CN102262162B - 一种用于细胞受力行为研究的微流控芯片系统 - Google Patents

一种用于细胞受力行为研究的微流控芯片系统 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种细胞受力行为研究微流控芯片系统，特别是一种针对间充质干细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：该微流控芯片系统将干细胞的接种、长期培养、干细胞受力学刺激及分析检测过程集成在一块功能芯片上完成；该系统由两个基本单元构成：第一个基本单元为细胞受力行为研究微流控芯片，第二个基本单元为细胞受力行为研究微流控芯片外围设备。

Description

一种用于细胞受力行为研究的微流控芯片系统
技术领域
本发明主要涉及微流控芯片，特别提供了一种细胞受力行为研究微流控芯片系统。
背景技术
微流控芯片实验室作为本世纪一项重要的科学技术已经在包括化学、生物学、医学等多个领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、传热传质快、通量高可以集成等特点而成为新一代细胞研究的重要平台，随着近二十年的发展，基于微流控芯片系统的细胞研究已经有所突破，相关细胞操作已基本都可在芯片上实现。此外，干细胞作为细胞研究领域中最为热点的对象之一，也逐渐成为微流控芯片的重要研究对象，在微流控芯片系统上研究干细胞与微环境的相互作用，特别是与物理因素有关的诸如机械外力、基质物理性质、纳米表面等也成为可能。随着研究的不断深入，微流控芯片系统或可成为干细胞研究的重要平台技术之一，为同干细胞研究相关的组织修复、再造移植及遗传发育等方面提供技术与理论的支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞受力行为研究微流控芯片系统，特别是一种针对间充质干细胞受力行为研究微流控芯片系统，具体说是一种基于PDMS(聚二甲基硅氧烷)膜弹性形变的细胞受力行为研究微流控芯片系统。
本发明以外部真空泵为动力源，以PDMS弹性薄膜为细胞受力载体，利用PDMS弹性薄膜在负压作用下发生形变，致使其上贴附细胞受机械外力刺激，进而研究细胞行为变化，该微流控芯片系统将细胞的接种、长期培养、细胞受力学刺激、细胞染色及分析检测过程集成在一块功能芯片上完成，实现了在微流控芯片平台上细胞受力的行为分析研究。细胞及试剂消耗量低，操作简便。
本发明具体提供了一种细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：该微流控芯片系统将干细胞的接种、长期培养、干细胞受力学刺激及分析检测过程集成在一块功能芯片上完成；该系统由两个基本单元构成：第一个基本单元为细胞受力行为研究微流控芯片，第二个基本单元为细胞受力行为研究微流控芯片外围设备。
其中细胞受力行为研究微流控芯片单元为采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建的多层微流控芯片，分为三部分：第一部分为液体流路层，包括液体流路(简称液路)、细胞进样孔以及废液池；第二部分为中间层，包括1层PDMS膜层；第三部分为气路控制层，包括气路以及气路控制孔；其中液体流路与气路通道的宽度相等，利用在芯片气路施加负压的方法致使PDMS膜发生弹性形变，并通过控制液体流路通道与气路通道的尺寸来调节PDMS弹性膜的形变程度，具体变化如图2所示，进而对其上贴附的细胞造成不同程度的力学刺激。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：所述芯片材料全部为PDMS聚合物。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：所述液体流路通道与气路通道的宽度为10微米～1厘米，要求小于交叉部分内切圆的直径，该直径尺寸为100微米～10厘米，交叉部分可以是正方形、圆形，原则上其它形状也可以。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：所述；细胞贴附的PDMS膜表面可被修饰：
(1)对于在PDMS膜表面生存状态良好的细胞可不进行表面修饰处理，直接接种细胞。
(2)对于在PDMS膜表面不易贴附或贴附后状态不佳的细胞可对通道内表面进行涂覆修饰，涂覆修饰的方法为：直接在通道内注入用于增加细胞贴附的试剂，待一定时间过后再进行细胞接种，该种试剂是明胶、白明胶、鼠尾胶原之一种或多种。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，所述细胞受力行为研究微流控芯片外围设备，是细胞受力行为研究微流控芯片实现各功能的外部支持及细胞行为分析的检测装置，主要包括真空泵、气路控制装置及荧光显微镜。其特征在于：其中气路控制装置采用电磁阀控制，可周期性对PDMS膜施加外力，进而周期性的对细胞产生机械力学刺激。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，能够实现间充质干细胞的长期贴附培养，利用该种力学刺激可促使间充质干细胞成骨分化，其结果如图3所示。在该系统上对间充质干细胞进行成骨、成脂肪的化学诱导分化，发现该种力学刺激可促进间充质干细胞向骨细胞分化并抑制间充质向脂肪细胞分化，如图4、5分别所示。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，其间充质干细胞的分化检测方法为：
(1)成骨分化检测方法：碱性磷酸酯酶ALP染色。
(2)成脂肪分化检测方法：脂肪细胞内油滴的Oil Red染色。
本发明提供的用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，操作简便，试剂及细胞消耗量低，是一种研究细胞受力行为变化的新平台。
附图说明
图1细胞受力行为研究微流控芯片结构图，其中1为芯片液体流路层，2为中间层，3为气路控制层，4为气路控制孔，5为细胞进样孔，6为废液池；
图2PDMS膜弹性形变量与通道尺寸变化关系；
图3间充质干细胞受机械外力刺激下成骨分化结果图；
图4间充质干细胞在成骨化学诱导分化剂及力学刺激共同作用下分化结果图；
图5间充质干细胞在成脂肪化学诱导分化剂及力学刺激共同作用下分化结果图；
图6细胞受力行为研究微流控芯片平面俯视图，其中4为气路控制孔，5为细胞进样孔，6为废液池，7为液体流路，8为气路。
具体实施方式
制备细胞受力行为研究微流控芯片的材料为PDMS聚合物，等离子体不可逆封接。制备后的芯片通道加水高压灭菌，再置于无菌工作台内晾干。以小鼠胚胎间充质干细胞为例，芯片液路通道无需涂敷，依次用75％乙醇、无菌二次水、PBS、含胎牛血清15％的α-MEM培养基润洗并保证通道内无气泡残留。小鼠胚胎间充质干细胞在无菌一次性培养瓶中传代培养，实验时用胰酶消化，调节合适密度从细胞加样口用移液枪注射入液路通道内，待24小时细胞完全贴壁后替换新鲜培养剂。若进行化学诱导剂同力学刺激共同作用的实验，则24小时之后替换诱导分化培养剂，成骨采用LG-DMEM+10％FBS+0.1μM地塞米松+50μg/ml抗坏血酸+100mM β-甘油磷酸钠，成脂肪采用LG-DMEM+10％FBS+1μM地塞米松+胰岛素。采用周期性的力学刺激，调节负压作用频率为20次/分钟，每作用5分钟停止5分钟，作用时间以实际刺激的时间为准，不计算停止的时间。连续刺激7天，之后细胞固定染色。染色步骤为：用PBS替换芯片通道内的培养基，并洗涤3次，用多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS冲洗3次。脂肪染色为在通道内加入Oil Red染色剂，染色10分钟之后，PBS冲洗拍照，计算脂肪油滴(红色)的面积占计算面积的百分比，得出脂肪分化率。成骨碱性磷酸酯酶ALP染色为细胞固定之后用PBS冲洗，换用Tris缓冲液冲洗，在通道内加入现配的ALP染色液，15分钟之后用Tris冲洗3次拍照，计算碱性磷酸酯酶(蓝色)的光强度用以表征成骨分化的强弱。空白组为不施加力学刺激的情况。
实施例1
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，通道尺寸宽度为气路同液路相等，包括300μm、400μm、500μm、600μm、700μm五个条件。芯片接种小鼠胚胎间充质干细胞，接种密度1×105个/ML，24小时细胞贴壁之后换用含胎牛血清15％的α-MEM培养基，每天换液，并施加不同时间的力学刺激(15分钟和30分钟)，7天之后成骨ALP染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。其结果如图3所示，由于不同尺寸下PDMS膜形变情况不同，致使间充质干细胞行为变化有所差别，400μm以上不同作用时间下间充质干细胞对比于空白组都有明显的成骨变化。
实施例2
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，通道尺寸宽度为气路同液路相等，包括300μm、400μm、500μm、600μm、700μm五个条件。芯片接种小鼠胚胎间充质干细胞，接种密度1×105个/ML，24小时细胞贴壁之后换用LG-DMEM+10％FBS+0.1μM地塞米松+50μ
g/ml抗坏血酸+100mM β-甘油磷酸钠成骨诱导分化培养基，每天换液，并施加不同时间的力学刺激(15分钟和30分钟)，力学刺激7天之后成骨ALP染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。其结果如图4所示，由于不同尺寸下PDMS膜形变情况不同，致使间充质干细胞行为变化有所差别，600μm和700μm力学刺激每天30分钟可促进间充质干细胞的成骨分化。空白组为未施加力学刺激仅使用成骨诱导分化培养基。
实施例3
利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，构型如图1所示，通道尺寸宽度为气路同液路相等，包括300μm、400μm、500μm、600μm、700μm五个条件。芯片接种小鼠胚胎间充质干细胞，接种密度1×105个/ML，24小时细胞贴壁之后换用LG-DMEM+10％FBS+1μM地塞米松+胰岛素成脂肪诱导分化培养基，每天换液，并施加不同时间的力学刺激(15分钟和30分钟)，力学刺激7天之后成脂肪Oil Red染色，显微镜拍照，Image Pro软件分析。其结果如图5所示，，600μm和700μm力学刺激可显著抑制间充质干细胞的成脂肪分化。空白组为未施加力学刺激仅使用成脂肪诱导分化培养基。
实施例4
胚胎干细胞：利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统，其俯视图如图6所示，通道尺寸宽度为气路同液路相等，包括300μm、400μm、500μm、600μm、700μm五个条件。芯片接种小鼠胚胎干细胞，接种密度1×105个/ML，24小时细胞贴壁之后，每天换液，并施加不同时间的力学刺激(15分钟和30分钟)，力学刺激7天之后可检测到胚胎干细胞的分化情况，比如成骨分化、成肌分化、成内皮细胞分化等。

Claims (5)

1.一种用于细胞受力行为研究的微流控芯片系统，其特征在于：该微流控芯片系统将干细胞的接种、长期培养、干细胞受力学刺激及分析检测过程集成在一块功能芯片上完成；该系统由两个基本单元构成：第一个基本单元为细胞受力行为研究微流控芯片，第二个基本单元为细胞受力行为研究微流控芯片外围设备；
其中细胞受力行为研究微流控芯片单元为采用PDMS软刻蚀及不可逆封接技术构建的多层微流控芯片，分为三部分：第一部分为液体流路层，包括液体流路、细胞进样孔以及废液池；第二部分为中间层，包括1层PDMS膜层；第三部分为气路控制层，包括气路以及气路控制孔；其中液体流路与气路通道的宽度相等，利用在芯片气路施加负压的方法致使PDMS膜发生弹性形变；
所述液体流路通道与气路通道的宽度为10微米~1厘米，要求小于交叉部分内切圆的直径，该直径尺寸为100微米~10厘米。
2.按照权利要求1所述用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：所述芯片材料全部为PDMS聚合物。
3.按照权利要求1所述细胞受力行为研究微流控芯片，其特征在于：细胞贴附的PDMS膜表面可被涂覆修饰，修饰方法为：直接在通道内注入用于增加细胞贴附的试剂，再进行细胞接种，该种试剂是明胶、白明胶、鼠尾胶原之一种或多种。
4.按照权利要求1所述细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：通过控制液体流路通道与气路通道的尺寸来调节PDMS弹性膜的形变程度。
5.按照权利要求1所述用于细胞受力行为研究微流控芯片系统，其特征在于：所述细胞受力行为研究微流控芯片外围设备的气路控制装置采用电磁阀控制。
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