CN106367346A - 一种间充质干细胞提取灌溉培养系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞提取灌溉培养系统，包括提取装置和灌流培养系统，所述的提取装置包括骨髓切割装置、反应池、过滤装置、滤液收集装置和密度梯度离心装置，所述的灌溉培养系统通过使用成分明确的培养系统，并且提供特定的营养成分和添加相关的小分子化合物等，维持细胞的多向分化潜能，让骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，低免疫原性，取材方便，扩增迅速，遗传背景稳定等特点，因此在组织工程和细胞及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。该骨髓间充质干细胞完全培养液的使用，为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。
Description
技术领域
本发明属于医用机械技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞提取灌溉培养系统。
背景技术
干细胞是指具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，在特定的条件下可分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是干细胞的一种，因为能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。
干细胞以间充质干细胞为代表的治疗用细胞培养制备方法，传统上是将干细胞提取后接种于培养瓶，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中进行静态非连续工业培养。但是这种传统细胞培养工艺制备干细胞存在以下弊端：1)静态非连续工业培养往往因为营养消耗而不足，细胞代谢废物无法排除，因此造成代谢产物累积，逐渐增加细胞毒性等缺陷，因此导致细胞生长缓慢，最高生长速率和最终细胞浓度有限的问题；2)不能有效地模拟体内的循环动态过程和保持细胞恒定生长活力，使对微环境敏感而又处于变化中的“动态”干细胞不能被高质量地扩增制备；3)培养周期受到限制，总体细胞承载数量有限，难于进行工程放大；4)整体监控能力有限，缺少对正常生长细胞量、分化或未分化态细胞比例等有效的在线或离线监控。因此，利用连续灌流反应器结合有效的监控方式能将传统细胞培养方式进行全新改进，快速、高效、连续地扩增以干细胞为首选的治疗用细胞。
综上所述，研究并开发可机械自动化且标准可控的干细胞提取且连续灌流培养系统成为当下热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间充质干细胞提取灌溉培养系统，旨在提供一种用于实验室或医疗机构、细胞制备应用工业界的更实用、更经济、更环保、使用范围更广的从骨髓提取干细胞及灌流培养的系统及用途。
本发明是这样实现的，一种间充质干细胞提取灌溉培养系统，包括提取装置和灌流培养系统，提取装置与灌流培养系统密封无菌相连，其特征在于，
所述的提取装置包括骨髓切割装置、反应池、过滤装置、滤液收集装置和密度梯度离心装置，所述骨髓切割装置包括切割部件和连接部件，所述切割部件由切刀部件和底座组成，连接部件为一升降臂；所述连接部件连接所述底座和所述切刀部件；所述的切刀部件由纵横排列的横刀和纵刀组成；所述的底座设有与所述横刀和纵刀对应的纵向和横向排列的凹槽；所述连接部件与一双开关电控装置连接，电动控制所述连接部件上下伸缩；所述反应池通过传送装置与骨髓切割装置相连，切割后的骨髓碎块直接进入反应池与酶反应液反应；所述过滤装置为金属过滤网与反应池相连；所述滤液收集装置与过滤装置相连；所述滤液收集装置与密度梯度离心装置相连；
灌流培养系统是直接使用该骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞，可高效促进细胞的贴壁，存活和增值；然后在后续传代过程中，不使用血清进行细胞培养，使用骨髓间充质干细胞完全培养液，完全培养液通过添加成分明确的血清替代物，一系列营养物质和小分子，维持骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞活力，纯度和均匀的生物特性；在细胞汇合度达到90％以前，完全培养液每隔一天换液；超过90％以上，进行细胞传代，满足干细胞的营养需求，维持和控制骨髓间充质干细胞形态稳定，维持细胞多向分化的潜能,纯度高、活力强、生物特性均匀；
对获得的细胞进行周期检测；特征分子表达量检测；细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；最终肯定培养所得的树鼩骨髓间充质干细胞可长期传代，并仍然维持较高纯度的间充质干细胞，具有较好的多向分化潜能。
进一步，间充质干细胞完全培养液的成分包括：
100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)+15％血清替代物KSR(Gibco)+10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco)+10mMbeta巯基乙醇+5ng/mlbFGF+15ng/mlEGF+3μMCHIR99021；其中：上述配方中，100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)为基础成分；其余为添加成分；
以上培养液，可以2-8℃储存1个月。
进一步，对获得的细胞进行周期检测；细胞在第4代，第8代，第12代，第20代消化后收集到1.5ml离心管中，每个代次收集细胞5x106以上，加入70％的酒精4℃过夜固定后，用PBS洗涤除去酒精，在PI溶液里(PI0.05mg/ml)重悬细胞，避光4℃孵育30分钟以上，通过流式细胞仪进行细胞周期检测。
进一步，其特征在于对获得的细胞进行特征分子表达量检测；
通过实时荧光定量PCR检测间充质干细胞表达的分子标志物，利用定量的方法比较在新的培养体系和传统培养液中，树鼩间充质干细胞完全培养液第4代，第8代，第12代和第20代的特征分子标记物表达量，分子标志物主要有：CD44，CD29，CD73，CD90，CD106，CD166，CD34和CD45。
进一步，对获得的细胞进行细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；
将第12代的骨髓间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测；
成骨分化液：高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+0.2mMascorbate-2-phosphate+10mMbeta-glycerophosphate；
茜素红染色鉴定；
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成脂分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素+1μmol/L地塞米松+200μM吲哚美辛+0.01mg/mL胰岛素+0.5mmol/LIBMX；
油红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成软骨分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100nM地塞米松+10ng/mlTGF-beta3+0.17Mmascorbate-2-phosphate+1/100100XITS+
alcianblue染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用alcianblue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
进一步，所述反应池位于骨髓切割装置的一侧，设有投料口、入液口和出液口、恒温装置、CO2通气装置、自动加液装置，所述的投料口和出液口位于反应池的两侧，入液口位于反应池的上表面。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：所述的装置切割效率高、操作方便有效，可极大的提高生产效率，其制备工艺简单，质量控制简便，能在短期内高效获得均一、优良的干细胞产品，更适于大规模生产和商业应用；使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。培养液成分明确，性能稳定；可控均一性，不同批次的培养液性能均一，各培养成分作用明确可控，细胞状态均一，活力好。
附图说明
图1是本发明实施例提供的间充质干细胞提取灌溉培养系统结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的结构作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的间充质干细胞提取灌溉培养系统包括提取装置和灌流培养系统，提取装置与灌流培养系统密封无菌相连，其特征在于，
所述的提取装置包括骨髓切割装置、反应池、过滤装置、滤液收集装置和密度梯度离心装置，所述骨髓切割装置包括切割部件和连接部件，所述切割部件由切刀部件和底座组成，连接部件为一升降臂；所述连接部件连接所述底座和所述切刀部件；所述的切刀部件由纵横排列的横刀和纵刀组成；所述的底座设有与所述横刀和纵刀对应的纵向和横向排列的凹槽；所述连接部件与一双开关电控装置连接，电动控制所述连接部件上下伸缩；所述反应池通过传送装置与骨髓切割装置相连，切割后的骨髓碎块直接进入反应池与酶反应液反应；所述过滤装置为金属过滤网与反应池相连；所述滤液收集装置与过滤装置相连；所述滤液收集装置与密度梯度离心装置相连；
灌流培养系统是直接使用该骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞，可高效促进细胞的贴壁，存活和增值；然后在后续传代过程中，不使用血清进行细胞培养，使用骨髓间充质干细胞完全培养液，完全培养液通过添加成分明确的血清替代物，一系列营养物质和小分子，维持骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞活力，纯度和均匀的生物特性；在细胞汇合度达到90％以前，完全培养液每隔一天换液；超过90％以上，进行细胞传代，满足干细胞的营养需求，维持和控制骨髓间充质干细胞形态稳定，维持细胞多向分化的潜能,纯度高、活力强、生物特性均匀；
对获得的细胞进行周期检测；特征分子表达量检测；细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；最终肯定培养所得的树鼩骨髓间充质干细胞可长期传代，并仍然维持较高纯度的间充质干细胞，具有较好的多向分化潜能。
本发明提供的装置在操作时，可将于骨髓直接接触的部件如切刀部件、底座等经高温消毒杀菌，而后将骨髓直接放置在底座上，手动或自动地通过连接部件的上下伸缩将切刀部件向下运动，使得横刀和纵刀插入底座上与其对应的凹槽内，此时骨髓可被一次性切割成相同大小的小块，所的小块用于后续的提取干细胞的操作。切割完成后的骨髓碎块可通过投料口直接加入反应池中反应，其中酶反应液可选用含胰蛋白酶(终浓度0.125％)、Dispase(分散酶，终浓度0.2％)、胶原酶(终浓度0.05％)、DNase I(脱氧核糖核酸酶I，终浓度0.2％)的反应液通过入液口加入反应池，搅拌均匀后，37℃下5％CO2条件下反应15分钟后加入小牛血清，在30秒内搅拌均匀，通过反应池的出液口经滤装置的滤网研磨过滤后流入滤液收集装置即得骨髓细胞悬浮液；所得骨髓细胞悬浮液经密度梯度离心装置离心后，取离心分层的中层单个核细胞，加PBS溶液洗涤两遍离心弃上清后，用培养液重悬离心管中的细胞沉淀，放入灭菌后的培养灌流系统中接种细胞，细胞接种后根据细胞情况，静止培养一定时间；
培养系统中骨髓间充质干细胞培养液包含的基础成分如下：
100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)
在骨髓间充质干细胞的完全培养液中，我们新添加成分和浓度范围是：
10％-15％血清替代物KSR(Gibco)+10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco)+10mMbeta巯基乙醇+5-8ng/mlbFGF+15-20ng/mlEGF+3-6μMCHIR99021
以上培养液，可以2-8℃储存1个月
培养液使用方法：
从骨髓中分离得到或者已经建系培养的骨髓间充质干细胞，可以每隔一天进行换液，细胞生长密度达到85％—90％时，进行细胞传代。细胞形态为梭形或三角形，呈蜂窝状生长，BM-MSCs生长曲线呈S形，符合正常细胞的生长特性，细菌，真菌，霉菌，支原体和病毒感染检测为阴性。通过向成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞的分化，证实了培养的细胞具有良好的多方向分化潜能。
对获得的细胞进行细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；
将第12代的骨髓间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测；
成骨分化液：高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+0.2mMascorbate-2-phosphate+10mMbeta-glycerophosphate；
茜素红染色鉴定；
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成脂分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素+1μmol/L地塞米松+200μM吲哚美辛+0.01mg/mL胰岛素+0.5mmol/LIBMX；
油红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成软骨分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100nM地塞米松+10ng/mlTGF-beta3+0.17Mmascorbate-2-phosphate+1/100100XITS+
alcianblue染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用alcianblue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种间充质干细胞提取灌溉培养系统，包括提取装置和灌流培养系统，提取装置与灌流培养系统密封无菌相连，其特征在于，
所述的提取装置包括骨髓切割装置、反应池、过滤装置、滤液收集装置和密度梯度离心装置，所述骨髓切割装置包括切割部件和连接部件，所述切割部件由切刀部件和底座组成，连接部件为一升降臂；所述连接部件连接所述底座和所述切刀部件；所述的切刀部件由纵横排列的横刀和纵刀组成；所述的底座设有与所述横刀和纵刀对应的纵向和横向排列的凹槽；所述连接部件与一双开关电控装置连接，电动控制所述连接部件上下伸缩；所述反应池通过传送装置与骨髓切割装置相连，切割后的骨髓碎块直接进入反应池与酶反应液反应；所述过滤装置为金属过滤网与反应池相连；所述滤液收集装置与过滤装置相连；所述滤液收集装置与密度梯度离心装置相连；
灌流培养系统是直接使用该骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞，可高效促进细胞的贴壁，存活和增值；然后在后续传代过程中，不使用血清进行细胞培养，使用骨髓间充质干细胞完全培养液，完全培养液通过添加成分明确的血清替代物，一系列营养物质和小分子，维持骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞活力，纯度和均匀的生物特性；在细胞汇合度达到90％以前，完全培养液每隔一天换液；超过90％以上，进行细胞传代，满足干细胞的营养需求，维持和控制骨髓间充质干细胞形态稳定，维持细胞多向分化的潜能,纯度高、活力强、生物特性均匀；
对获得的细胞进行周期检测；特征分子表达量检测；细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；最终肯定培养所得的树鼩骨髓间充质干细胞可长期传代，并仍然维持较高纯度的间充质干细胞，具有较好的多向分化潜能。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于间充质干细胞完全培养液的成分包括：
100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)+15％血清替代物KSR(Gibco)+10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco)+10mMbeta巯基乙醇+5ng/mlbFGF+15ng/mlEGF+3μMCHIR99021；其中：上述配方中，100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)为基础成分；其余为添加成分；
以上培养液，可以2-8℃储存1个月。
3.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于，其特征在于对获得的细胞进行周期检测；细胞在第4代，第8代，第12代，第20代消化后收集到1.5ml离心管中，每个代次收集细胞5x106以上，加入70％的酒精4℃过夜固定后，用PBS洗涤除去酒精，在PI溶液里(PI0.05mg/ml)重悬细胞，避光4℃孵育30分钟以上，通过流式细胞仪进行细胞周期检测。
4.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于，其特征在于对获得的细胞进行特征分子表达量检测；
通过实时荧光定量PCR检测间充质干细胞表达的分子标志物，利用定量的方法比较在新的培养体系和传统培养液中，树鼩间充质干细胞完全培养液第4代，第8代，第12代和第20代的特征分子标记物表达量，分子标志物主要有：CD44，CD29，CD73，CD90，CD106，CD166，CD34和CD45。
5.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于对获得的细胞进行细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；
将第12代的骨髓间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测；
成骨分化液：高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+0.2mMascorbate-2-phosphate+10mMbeta-glycerophosphate；
茜素红染色鉴定；
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成脂分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素+1μmol/L地塞米松+200μM吲哚美辛+0.01mg/mL胰岛素+0.5mmol/LIBMX；
油红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成软骨分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100nM地塞米松+10ng/mlTGF-beta3+0.17Mmascorbate-2-phosphate+1/100100XITS+
alcianblue染色鉴定：
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用alcianblue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
6.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于，所述反应池位于骨髓切割装置的一侧，设有投料口、入液口和出液口、恒温装置、CO2通气装置、自动加液装置，所述的投料口和出液口位于反应池的两侧，入液口位于反应池的上表面。
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2016
- 2016-10-20 CN CN201610913763.4A patent/CN106367346A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170201 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |