CN105238751A - 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105238751A
CN105238751A CN201510852329.5A CN201510852329A CN105238751A CN 105238751 A CN105238751 A CN 105238751A CN 201510852329 A CN201510852329 A CN 201510852329A CN 105238751 A CN105238751 A CN 105238751A
Authority
CN
China
Prior art keywords
umbilical cord
cell
tissue
cord tissue
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510852329.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105238751B (zh
Inventor
刘聪
陈晨
王宇环
罗晓玲
魏志璋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Unification Health Biotech Inc Of Shenzhen
Original Assignee
Unification Health Biotech Inc Of Shenzhen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unification Health Biotech Inc Of Shenzhen filed Critical Unification Health Biotech Inc Of Shenzhen
Priority to CN201510852329.5A priority Critical patent/CN105238751B/zh
Publication of CN105238751A publication Critical patent/CN105238751A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105238751B publication Critical patent/CN105238751B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,包括步骤:A)样本采集和细胞分离培养;B)传代培养:原代细胞经过培养,待细胞融合度达到80%以上,继续传代培养;C)生长曲线绘制;D)细胞检测:采用第三代细胞进行检测,准备消化好的第三代脐带间充质干细胞,缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后,进行检测。本发明同时使用两种类型的胶原蛋白酶,透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化可以使得组织块快速充分的消化。

Description

一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞及生物工程领域,具体是一种脐带间充质干细胞的分离培养方法。
技术背景
间充质干细胞最初在上世纪70年代采用贴壁培养方法从骨髓中分离出来。后来人们经过研究发现,这种细胞具有多向分化潜能,在一定的诱导培养条件下能分化成为成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞,心肌细胞等,这些细胞经过体外长期培养和多次传代后依然能保持分化潜能。由于其能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞,故称之为间充质干细胞(Mesenchymalstemcell,MSC)。随着研究的深入人们发现,间充质干细胞不仅具有多向分化潜能,还具有一定的疾病治疗潜能。目前在许多动物实验中已经发现,将间充质干细胞移植到疾病小鼠模型后,疾病症状能得到明显改善,其中包括中风,脊柱损伤,帕金森等疾病。除动物实验外,在一些临床治疗中也发现间充质干细胞对糖尿病,干硬化,心肌梗死等疾病具有一定的疗效。早期用于临床治疗的间充质干细胞主要来源于骨髓,但骨髓中的间充质干细胞含量较低,扩增时间较长。而且骨髓提取会对病人造成一定的痛苦,且在进行细胞分离时,并不是每一次都能成功。上世纪90年代人们又从脐带组织中分离出间充质干细胞,经过研究发现脐带间充质干细胞符合国际细胞治疗协会(internationalsocietyforcellulartherapy,ISCT)对间充质干细胞的定义。脐带间充质干细胞能够贴壁生长,高表达CD73,CD105,CD90等阳性细胞表面标志物,几乎不表达CD34,CD45,HLA-Dr等阴性细胞表面标志物。除此之外,脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞十分相似,也对多种疾病具有一定的治疗效果,另外,脐带间充质干细胞还具有其自身的优势1:其免疫源性低,移植后几乎不发生免疫排斥反应。2:其来源广泛易于采集,采集产后的胎儿脐带组织即可,并且不会对胎儿造成伤害。3:其细胞起始量大,且易于增殖和培养,培养周期短。脐带间充质干细胞还具有促进和恢复造血的作用,其与造血干细胞共移植也展现了良好的治疗作用。脐带间充质干细胞的分离培养对其后续的研究与应用十分重要。本发明采用多酶消化法,对脐带组织进行消化,消化后收集细胞沉淀进行培养。
目前对脐带间充质干细胞的分离方法主要分为两种,即组织贴壁法和酶消化法。组织贴壁法的优点是脐带组织块未经过酶解处理,组织仅被机械方式粉碎,细胞受到的伤害较小。但组织贴壁培养法的一大缺点就是,细胞爬出的速度慢,原代培养时间长,细胞培养往往成为其进行科学研究和应用的限速环节。而采用酶消化的方法,将组织中的细胞消化下来培养就可以缩短原代培养时间。目前在一些专利文件中已经采用了酶消化的方法来分离脐带组织,如专利CN201510135941.0,CN201510120264.5,CN201010605542.3,CN200910195922.1和CN201010125235.5。在这些专利中,主要采用一种类型的胶原酶消化脐带组织,其中也有结合透明质酸酶,胰酶或中性蛋白酶共消化。然而这些方法的一个主要缺点就是消化时间长,都不少于3小时,且脐带组织用量多,亦有组织块消化不充分的现象。在专利CN200610067537.5,CN200810052286.2,CN201010517717.5和CN201510135941.0中,都有用到胰蛋白酶消化脐带组织。而胰蛋白酶是一种没有组织特异性,且活性极强的一种消化酶,任何蛋白质都是它的作用底物,也包括细胞膜表面的各种蛋白质。所以采用胰蛋白酶消化组织,会对细胞造成较大的伤害。因此在对组织进行酶消化时,对消化酶的选择也十分重要,应尽量能将组织消化充分,又对细胞伤害较小,相比之下,胶原酶,中性蛋白酶,透明质酸酶是较理想的选择。
研究发现脐带组织胞外基质主要包括胶原蛋白和糖胺聚糖。其中含有 型和型等多种胶原蛋白,以型和 型为主。脐带中大部分糖胺聚糖是透明质酸。根据脐带中的这些成分组成,宜采用胶原酶,透明质酸酶以及其它作用较温和的酶进行消化。针对脐带中含有胶原蛋白的类型,本发明采用型、 型胶原酶、透明质酸酶,结合accutase或中性蛋白酶对脐带组织进行消化。型, 型胶原酶,透明质酸酶消化细胞外基质中的胶原蛋白和透明质酸等成分,中性蛋白酶消化细胞外基质中的纤连蛋白同时也消化 型胶原蛋白,并不对细胞造成伤害,Accutase的作用较温和,具有辅助消化作用,且对细胞伤害较小。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,解决现有技术存在的缺陷,本发明所述技术方案包括步骤:
A)样本采集和细胞分离培养:
A1)严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了80-100U/ml青霉素和80-100μg/ml链霉素培养基的无菌容器,0-4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理;
A2)将脐带中的胶体组织收集到离心管或培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎成组织块;
A3)量取胶体组织块到一个新的无菌器皿中,加入消化液在35-37℃恒温振荡器中振荡孵育50-80分钟,振荡频率为40-60rpm;
A4)向步骤A3)中消化后得到的混合液中加入1-3倍体积的缓冲液稀释,充分混均后,转移并离心,弃上清液;
A5)向沉淀中加入缓冲液洗涤细胞,再次离心,弃上清液;
A6)向沉淀中加入生长培养基,充分吹打混匀后接种于贴壁培养皿中,放置培养箱中进行原代细胞培养,每二-三天换培养液;
B)传代培养:原代细胞经过培养,待细胞融合度达到80%以上,继续传代培养;
C)生长曲线绘制:待第二代脐带间充质干细胞融合度达到80%以上,将细胞消化好,并终止消化,充分吹打混匀,离心弃上清液;用培养基重悬细胞后计数,将细胞悬液加入多孔板进行培养、检测;将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线;
D)细胞检测:采用第三代细胞进行检测,准备消化好的第三代代脐带间充质干细胞,缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后,进行检测。
2、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,其特征是,还包括步骤:
E)成骨和脂肪细胞分化:采用第三代代细胞进行成骨和成脂细胞分化。
3、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,其特征是:所述A步骤中的消化液含0.8-1.0mg/mlI型胶原酶,0.2-0.3mg/mlIV型胶原酶,1-1.5U/ml分散酶,8-10μg/ml透明质酸酶;其中1U/mldispase可用30%体积比的细胞消化液代替。
4、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,其特征是:所述D)步骤标记的抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgG1和FITC-MouseIgG1。
本发明与现有技术相比,具有如下优势:
同时使用两种类型的胶原蛋白酶(型和 型),透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化(目前已有的专利文献对于胶原酶仅使用其中一种,也未使用accutase)。本发明的优点是该酶组合液与其它专利相比消化时间短,仅需要1小时。消化充分,组织块基本被消化完,组织块利用率高。使用2.5ml脐带组织消化后,经过7-8天培养可获得约2.5X105个原代细胞。
附图说明
图1a原代脐带MSC细胞形态
图1bP1代脐带MSC细胞形态
图1cP3代脐带MSC细胞形态
图1dP5代脐带MSC细胞形态
图2P3代脐带MSC生长曲线
图3P3代脐带MSC流式检测结果,CD73,CD105,CD90,CD44和CD29阳性率大于95%,CD34,CD45和HLA-Dr阳性率小于2%
图4aP3代脐带MSC向成骨细胞分化结果,细胞表面已经被茜素红s染色液染成深红色,说明细胞表面已经形成钙化结。
图4bP3代脐带MSC向脂肪细胞分化结果,在细胞内部已经形成大量脂肪滴,并被油红氧染成红色。
图5对比实验结果,a、b、c和d分别为用本发明方法消化0.5h、1h、2h和3h,所获得的细胞数量分别为0.9X105个、2.5X105个、1.6X105个和1.2X105个;e和f分别为采用专利CN200910055219.0实施例3和专利CN201010605542.3实施例1的方法消化组织块1h,所获得的细胞数量分别为0.9X105个和0.6X105个。
具体实施方式
为了便于对本发明进一步理解,下面结合具体实施例和附图,对本发明作进一步详细说明。
实施例1:
样本采集和细胞分离培养(实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理)
1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中,4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理。
2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中,用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。
3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度,用镊子撕开脐带表面羊膜,去除动脉和静脉。
4.剥掉脐带中的胶体组织(Wharton’sjelly,华通氏胶),弃掉羊膜组织。
5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。
6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中,加入6ml消化液(含0.8mg/ml型胶原酶,0.2mg/ml型胶原酶,1U/mldispase,10μg/ml透明质酸酶)在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟,振荡频率为60rpm。其中1U/mldispase可用30%(v/v)accutase代替。(U表示酶的活力单位)。
7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释,充分混均后,转移到15ml离心管中400g离心10min,弃上清液。
8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞,400g离心10min,弃上清液。
9.向沉淀中加入3mlMSC生长培养基,充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中,放置37℃,5%CO2培养箱中进行原代细胞培养,每三天换液。
:间充质干细胞(mesenchymalstemcell)
MSC生长培养基成分:低糖DMEM+10%FBS+5ng/mlbFGF
FBS:fetalbovineserum(胎牛血清)
bFGF:basicfibroblastgrowthfactor(碱性成纤维细胞生长因子)
形态观察
原代细胞经过培养到第8天后,从培养箱中取出细胞在倒置显微镜下观察,此时局部细胞融合度已经达到80%,细胞形态为典型的纤维状梭形细胞,见图1a。
细胞传代培养P0传P1
原代脐带间充质干细胞培养到第8天,从培养箱中取出细胞,弃掉培养基,加入洗涤细胞一遍,弃掉PBS。加入0.25%胰蛋白酶消化细胞3-5分钟。待细胞消化下来后,加入MSC生长培养基终止消化,充份吹打混匀。取少量细胞悬液用Countstar细胞计数仪进行计数,经计数,原代细胞总量共2.5X105个,将剩余细胞200g离心10分钟,弃上清液。用培养基重悬细胞,将细胞以5000个/cm2的密度接种于新的10cm培养皿中。放置37℃,5%CO2培养箱中进行P1代细胞培养,每3天换液。待细胞融合度达到80%后,在显微镜下观察拍照,并继续传代培养。
细胞传代培养P1传P2
待P1代脐带间充质干细胞融合度达到80%后,从培养箱中取出细胞,弃掉培养基,加入PBS洗涤细胞一遍,弃掉PBS。加入0.05%胰蛋白酶消化细胞3分钟。待细胞消化下来后,加入MSC生长培养基终止消化,充份吹打混匀。取少量细胞悬液用Countstar细胞计数仪进行计数,将剩余细胞200g离心10分钟,弃上清液。用MSC培养基重悬细胞,将细胞以5000个/cm2的密度接种于新的10cm培养皿中。放置37℃,5%CO2培养箱中进行P2代细胞培养,每3天换液,待细胞融合度达到80%后,在显微镜下观察拍照,继续传代培养(P2代以后的传代操作方式与P1代传P2代的操作方式相同)。
细胞生长曲线
采用P3代细胞绘制生长曲线。
待P2代脐带间充质干细胞融合度达到80%时,将细胞消化好,并终止消化,充份吹打混匀。将细胞200g离心10分钟,弃上清液。用MSC培养基重悬细胞,用conster细胞计数仪计数,向6孔板中每孔加入2ml细胞悬液(含10000个细胞),放置37℃,5%CO2培养箱中培养7天,每3天换液。每隔24小时取3孔细胞进行消化计数,取3孔平均值。连续检测7天。将检测结果用excel绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。如图2。
流式检测
采用P3代细胞进行流式检测
准备消化好的P3代脐带间充质干细胞,PBS洗涤后对细胞进行抗体标记,标记抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgG1和FITC-MouseIgG1(抗体采购自BDbioscience)。经孵育洗涤后,上机检测,结果见图3。其中CD73,CD105,CD90,CD44和CD29阳性率大于95%,CD34,CD45和HLA-Dr阳性率小于2%,从流式结果来看,本方法分离培养得到的细胞符合MSC鉴定标准。
成骨和脂肪细胞分化
采用P3代细胞进行成骨和成脂细胞分化
脐带MSC向成骨细胞和脂肪细胞分化采用Gibco的成骨细胞分化和脂肪细胞分化试剂盒,货号分别是A10072-01,A10070-01。实验操作按说明书要求进行。实验结果见图4。
成骨分化结果中,细胞表面已经被茜素红染色液染成深红色,说明细胞已经向胞外分泌骨基质。在脂肪分化结果中,细胞中存在大量脂肪滴被油红氧染成红色。该实验结果说明本方法所获得的MSC能够向成骨细胞和脂肪细胞分化。
实施例2:
样本采集和细胞分离培养(实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理)
1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中,4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理。
2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中,用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。
3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度,用镊子撕开脐带表面羊膜,去除动脉和静脉。
4.剥掉脐带中的胶体组织(Wharton’sjelly,华通氏胶),弃掉羊膜组织。
5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。
6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中,加入6ml消化液(含2mg/mlI型胶原酶,2mg/mlIV型胶原酶,2U/mldispase,100μg/ml透明质酸酶)在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟,振荡频率为60rpm。
7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释,充分混均后,转移到15ml离心管中400g离心10min,弃上清液。
8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞,400g离心10min,弃上清液。
向沉淀中加入3mlMSC生长培养基,充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中,放置37℃,5%CO2培养箱中进行原代细胞培养,每三天换液。
实施例3:
样本采集和细胞分离培养(实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理)
1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中,4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理。
2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中,用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。
3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度,用镊子撕开脐带表面羊膜,去除动脉和静脉。
4.剥掉脐带中的胶体组织(Wharton’sjelly,华通氏胶),弃掉羊膜组织。
5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。
6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中,加入6ml消化液(含1mg/mlI型胶原酶,1mg/mlIV型胶原酶,1U/mldispase,50μg/ml透明质酸酶)在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟,振荡频率为60rpm。
7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释,充分混均后,转移到15ml离心管中400g离心10min,弃上清液。
8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞,400g离心10min,弃上清液。
向沉淀中加入3mlMSC生长培养基,充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中,放置37℃,5%CO2培养箱中进行原代细胞培养,每三天换液。
实施例4:
样本采集和细胞分离培养(实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理)
1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中,4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理。
2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中,用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。
3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度,用镊子撕开脐带表面羊膜,去除动脉和静脉。
4.剥掉脐带中的胶体组织(Wharton’sjelly,华通氏胶),弃掉羊膜组织。
5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。
6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中,加入6ml消化液(含1mg/mlI型胶原酶,1mg/mlIV型胶原酶,30%(v/v)accutase,50μg/ml透明质酸酶)在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟,振荡频率为60rpm。
7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释,充分混均后,转移到15ml离心管中400g离心10min,弃上清液。
8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞,400g离心10min,弃上清液。
向沉淀中加入3mlMSC生长培养基,充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中,放置37℃,5%CO2培养箱中进行原代细胞培养,每三天换液。
实施例5:
样本采集和细胞分离培养(实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理)
1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中,4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理。
2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中,用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。
3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度,用镊子撕开脐带表面羊膜,去除动脉和静脉。
4.剥掉脐带中的胶体组织(Wharton’sjelly,华通氏胶),弃掉羊膜组织。
5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。
6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中,加入6ml消化液(含0.5mg/mlI型胶原酶,0.5mg/mlIV型胶原酶,1U/mldispase,20%(v/v)accutase,10μg/ml透明质酸酶)在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟,振荡频率为60rpm。
7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释,充分混均后,转移到15ml离心管中400g离心10min,弃上清液。
8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞,400g离心10min,弃上清液。
向沉淀中加入3mlMSC生长培养基,充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中,放置37℃,5%CO2培养箱中进行原代细胞培养,每三天换液。
对比实验
脐带组织块消化时间确定为1小时是根据对比实验得出的结论。在对比实验中采用本发明中的实验方法对相同用量的组织块(2.5ml)分别消化0.5h、1h、2h和3h做对比。将上述四个对比实验分别命名为a、b、c和d。组织块消化0.5h后仍有部分未被消化完,经过滤掉组块后将细胞接种到培养皿中。组织块消化1h、2h和3h后组织块基本被消化完全,不需要过滤。原代细胞经8天培养获得的细胞量分别是0.9X105个、2.5X105个、1.6X105个和1.2X105个。
另外,采用专利CN200910055219.0实施例3和专利CN201010605542.3实施例1的方法对相同用量的组织块(2.5ml)消化1小时与本方法作对比,消化液体积和组织块体积的比例均与原方法中相同。将这两个对比实验分别命名为e和f。两种方法将组织块消化1小时后均有大部分组织块未被消化掉,过滤去除组织块后将细胞接种到培养皿中。原代细胞经8天培养后,所获得的细胞数量分别是0.9X105个和0.6X105个。
将上述6个对比实验结果用excel做图,如图5所示。

Claims (4)

1.一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,包括步骤:
A)样本采集和细胞分离培养:
A1)严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织,放入含有添加了80-100U/ml青霉素和80-100μg/ml链霉素培养基的无菌容器,0-4℃运输,运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下,48小时内对脐带组织进行处理;
A2)将脐带中的胶体组织收集到离心管或培养皿中,用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎成组织块;
A3)量取胶体组织块到一个新的无菌器皿中,加入消化液在35-37℃恒温振荡器中振荡孵育50-80分钟,振荡频率为40-60rpm;
A4)向步骤A3)中消化后得到的混合液中加入1-3倍体积的缓冲液稀释,充分混均后,转移并离心,弃上清液;
A5)向沉淀中加入缓冲液洗涤细胞,再次离心,弃上清液;
A6)向沉淀中加入生长培养基,充分吹打混匀后接种于贴壁培养皿中,放置培养箱中进行原代细胞培养,每二-三天换培养液;
B)传代培养:原代细胞经过培养,待细胞融合度达到80%以上,继续传代培养;
C)生长曲线绘制:待第二代脐带间充质干细胞融合度达到80%以上,将细胞消化好,并终止消化,充分吹打混匀,离心弃上清液;用培养基重悬细胞后计数,将细胞悬液加入多孔板进行培养、检测;将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线;
D)细胞检测:采用第三代细胞进行检测,准备消化好的第三代代脐带间充质干细胞,缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后,进行检测。
2.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,其特征是,还包括步骤:
E)成骨和脂肪细胞分化:采用第三代代细胞进行成骨和成脂细胞分化。
3.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,其特征是:所述A步骤中的消化液含0.8-1.0mg/mlI型胶原酶,0.2-0.3mg/mlIV型胶原酶,1-1.5U/ml分散酶,8-10μg/ml透明质酸酶;其中1U/mldispase可用30%体积比的细胞消化液代替。
4.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法,其特征是:所述D)步骤标记的抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgG1和FITC-MouseIgG1。
CN201510852329.5A 2015-11-30 2015-11-30 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 Active CN105238751B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510852329.5A CN105238751B (zh) 2015-11-30 2015-11-30 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510852329.5A CN105238751B (zh) 2015-11-30 2015-11-30 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105238751A true CN105238751A (zh) 2016-01-13
CN105238751B CN105238751B (zh) 2021-07-23

Family

ID=55036571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510852329.5A Active CN105238751B (zh) 2015-11-30 2015-11-30 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105238751B (zh)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434547A (zh) * 2016-12-17 2017-02-22 重庆市干细胞技术有限公司 制备脐带间充质干细胞的方法
CN107189982A (zh) * 2017-06-12 2017-09-22 北京焕生汇生物技术研究院 一种人脐带间充质干细胞的培养方法
CN107254489A (zh) * 2017-06-19 2017-10-17 河南省华隆生物技术有限公司 一种检测嵌合抗原受体或基因修饰的t细胞受体表达的方法和应用
CN107513518A (zh) * 2017-10-10 2017-12-26 重庆金时代生物技术有限公司 一种脐带间充质干细胞体外培养方法
CN108165526A (zh) * 2017-12-20 2018-06-15 北京焕生汇生物技术研究院 酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法
CN109370984A (zh) * 2018-08-14 2019-02-22 上海逍鹏生物科技有限公司 一种原代干细胞分离液以及分离原代间充质干细胞的方法
CN110157665A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 吉林省农业科学院 一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法
CN110257327A (zh) * 2019-06-27 2019-09-20 重庆市细胞生物工程技术有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离培养方法
CN110551684A (zh) * 2019-09-16 2019-12-10 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞制备方法
CN110804585A (zh) * 2019-11-19 2020-02-18 武汉济源高科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法
CN111518758A (zh) * 2020-04-30 2020-08-11 深圳市合一康生物科技股份有限公司 一种用于肺病治疗的脐带间充质干细胞及其制备方法
CN112011505A (zh) * 2020-09-09 2020-12-01 广州同康生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞分离方法
CN113322231A (zh) * 2021-06-23 2021-08-31 陕西九州生物医药科技集团有限公司 一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂
CN114107191A (zh) * 2021-12-09 2022-03-01 益诺思生物技术南通有限公司 一种89Zr标记人脐带间充质干细胞的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102127522A (zh) * 2010-12-27 2011-07-20 协和干细胞基因工程有限公司 人脐带间充质干细胞及其制备方法
CN103013911A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法
WO2013096686A1 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Detection of human umbilical cord tissue-derived cells
CN103266081A (zh) * 2012-01-21 2013-08-28 中国人民解放军军事医学科学院附属医院 从脐带中分离培养间充质干细胞的高效方法
CN103589683A (zh) * 2013-08-12 2014-02-19 北京东方华辉生物医药科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102127522A (zh) * 2010-12-27 2011-07-20 协和干细胞基因工程有限公司 人脐带间充质干细胞及其制备方法
WO2013096686A1 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Detection of human umbilical cord tissue-derived cells
CN103266081A (zh) * 2012-01-21 2013-08-28 中国人民解放军军事医学科学院附属医院 从脐带中分离培养间充质干细胞的高效方法
CN103013911A (zh) * 2012-11-30 2013-04-03 陆华 贴壁密度梯度法联合egf培养人脐带间充质干细胞的方法
CN103589683A (zh) * 2013-08-12 2014-02-19 北京东方华辉生物医药科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法和培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
祝加学等: "脐带间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞的实验研究", 《现代生物医学进展》 *
肖娜: "脐带间充质干细胞联合脐血干细胞治疗Ⅰ型糖尿病的初步研究", 《万方学位论文》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434547A (zh) * 2016-12-17 2017-02-22 重庆市干细胞技术有限公司 制备脐带间充质干细胞的方法
CN107189982A (zh) * 2017-06-12 2017-09-22 北京焕生汇生物技术研究院 一种人脐带间充质干细胞的培养方法
CN107254489B (zh) * 2017-06-19 2021-06-18 河南省华隆生物技术有限公司 一种检测嵌合抗原受体或基因修饰的t细胞受体表达的方法和应用
CN107254489A (zh) * 2017-06-19 2017-10-17 河南省华隆生物技术有限公司 一种检测嵌合抗原受体或基因修饰的t细胞受体表达的方法和应用
CN107513518A (zh) * 2017-10-10 2017-12-26 重庆金时代生物技术有限公司 一种脐带间充质干细胞体外培养方法
CN108165526A (zh) * 2017-12-20 2018-06-15 北京焕生汇生物技术研究院 酶解法提取及培养人脐带间充质干细胞的方法
CN109370984A (zh) * 2018-08-14 2019-02-22 上海逍鹏生物科技有限公司 一种原代干细胞分离液以及分离原代间充质干细胞的方法
CN110157665A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 吉林省农业科学院 一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法
CN110257327A (zh) * 2019-06-27 2019-09-20 重庆市细胞生物工程技术有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离培养方法
CN110551684A (zh) * 2019-09-16 2019-12-10 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞制备方法
CN110551684B (zh) * 2019-09-16 2021-09-03 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种人脐带间充质干细胞制备方法
CN110804585A (zh) * 2019-11-19 2020-02-18 武汉济源高科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的分离方法
CN111518758A (zh) * 2020-04-30 2020-08-11 深圳市合一康生物科技股份有限公司 一种用于肺病治疗的脐带间充质干细胞及其制备方法
CN112011505A (zh) * 2020-09-09 2020-12-01 广州同康生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞分离方法
CN113322231A (zh) * 2021-06-23 2021-08-31 陕西九州生物医药科技集团有限公司 一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂
CN114107191A (zh) * 2021-12-09 2022-03-01 益诺思生物技术南通有限公司 一种89Zr标记人脐带间充质干细胞的方法
CN114107191B (zh) * 2021-12-09 2024-03-12 益诺思生物技术南通有限公司 一种89Zr标记人脐带间充质干细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105238751B (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105238751A (zh) 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法
Domenis et al. Adipose tissue derived stem cells: in vitro and in vivo analysis of a standard and three commercially available cell-assisted lipotransfer techniques
CN106754674B (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN105861430A (zh) 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用
CN103352026A (zh) 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法
CN102127522A (zh) 人脐带间充质干细胞及其制备方法
CN101591644A (zh) 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存
CN105420179A (zh) 一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法
CN106367389A (zh) 一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用
CN106801032B (zh) 人羊膜上皮干细胞库的构建方法
CN104726406A (zh) 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
CN102154200B (zh) 临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存
CN104762259A (zh) 一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法
CN104762260A (zh) 脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途
CN104651305A (zh) 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法
CN107557331A (zh) 一种分离和培养人脂肪干细胞的方法
CN106318906A (zh) 一种大规模培养人脐带间充质干细胞的方法
CN103087982A (zh) 一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法
CN107267453A (zh) 一种用于培养脂肪间充质干细胞的培养基及其应用
CN102146359A (zh) 从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法
CN106701670A (zh) 一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法
CN106417253A (zh) 一种骨骼肌干细胞的冻存液和冻存方法
CN101629164A (zh) 从结缔组织中获取间充质基质细胞的方法
CN104031881B (zh) 一种人类嗅黏膜间充质干细胞的分离培养方法
CN106191127B (zh) 干细胞生物活性组合物及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information

Address after: 518000 tourism creative (bonded) garden 101, hehe Road, 8, Fuhua Road, Futian District, Shenzhen, Guangdong, T8

Applicant after: Unification health biotech inc of Shenzhen

Address before: 518000 Yingfu Hi-tech Factory Building, 7-storey B Factory Building and Office Room, Futian Street, Futian District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant before: Unification health biotech inc of Shenzhen

CB02 Change of applicant information
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant