CN105238751A - 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤：A）样本采集和细胞分离培养；B）传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养；C）生长曲线绘制；D）细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代脐带间充质干细胞，缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。本发明同时使用两种类型的胶原蛋白酶，透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化可以使得组织块快速充分的消化。

Description

一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞及生物工程领域，具体是一种脐带间充质干细胞的分离培养方法。

技术背景

间充质干细胞最初在上世纪70年代采用贴壁培养方法从骨髓中分离出来。后来人们经过研究发现，这种细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导培养条件下能分化成为成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，心肌细胞等，这些细胞经过体外长期培养和多次传代后依然能保持分化潜能。由于其能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，故称之为间充质干细胞(Mesenchymalstemcell,MSC)。随着研究的深入人们发现，间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还具有一定的疾病治疗潜能。目前在许多动物实验中已经发现，将间充质干细胞移植到疾病小鼠模型后，疾病症状能得到明显改善，其中包括中风，脊柱损伤，帕金森等疾病。除动物实验外，在一些临床治疗中也发现间充质干细胞对糖尿病，干硬化，心肌梗死等疾病具有一定的疗效。早期用于临床治疗的间充质干细胞主要来源于骨髓，但骨髓中的间充质干细胞含量较低，扩增时间较长。而且骨髓提取会对病人造成一定的痛苦，且在进行细胞分离时，并不是每一次都能成功。上世纪90年代人们又从脐带组织中分离出间充质干细胞，经过研究发现脐带间充质干细胞符合国际细胞治疗协会（internationalsocietyforcellulartherapy，ISCT）对间充质干细胞的定义。脐带间充质干细胞能够贴壁生长，高表达CD73，CD105，CD90等阳性细胞表面标志物，几乎不表达CD34，CD45，HLA-Dr等阴性细胞表面标志物。除此之外，脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞十分相似，也对多种疾病具有一定的治疗效果，另外，脐带间充质干细胞还具有其自身的优势1：其免疫源性低，移植后几乎不发生免疫排斥反应。2：其来源广泛易于采集，采集产后的胎儿脐带组织即可，并且不会对胎儿造成伤害。3：其细胞起始量大，且易于增殖和培养，培养周期短。脐带间充质干细胞还具有促进和恢复造血的作用，其与造血干细胞共移植也展现了良好的治疗作用。脐带间充质干细胞的分离培养对其后续的研究与应用十分重要。本发明采用多酶消化法，对脐带组织进行消化，消化后收集细胞沉淀进行培养。

目前对脐带间充质干细胞的分离方法主要分为两种，即组织贴壁法和酶消化法。组织贴壁法的优点是脐带组织块未经过酶解处理，组织仅被机械方式粉碎，细胞受到的伤害较小。但组织贴壁培养法的一大缺点就是，细胞爬出的速度慢，原代培养时间长，细胞培养往往成为其进行科学研究和应用的限速环节。而采用酶消化的方法，将组织中的细胞消化下来培养就可以缩短原代培养时间。目前在一些专利文件中已经采用了酶消化的方法来分离脐带组织，如专利CN201510135941.0，CN201510120264.5，CN201010605542.3，CN200910195922.1和CN201010125235.5。在这些专利中，主要采用一种类型的胶原酶消化脐带组织，其中也有结合透明质酸酶，胰酶或中性蛋白酶共消化。然而这些方法的一个主要缺点就是消化时间长，都不少于3小时，且脐带组织用量多，亦有组织块消化不充分的现象。在专利CN200610067537.5，CN200810052286.2，CN201010517717.5和CN201510135941.0中，都有用到胰蛋白酶消化脐带组织。而胰蛋白酶是一种没有组织特异性，且活性极强的一种消化酶，任何蛋白质都是它的作用底物，也包括细胞膜表面的各种蛋白质。所以采用胰蛋白酶消化组织，会对细胞造成较大的伤害。因此在对组织进行酶消化时，对消化酶的选择也十分重要，应尽量能将组织消化充分，又对细胞伤害较小，相比之下，胶原酶，中性蛋白酶，透明质酸酶是较理想的选择。

研究发现脐带组织胞外基质主要包括胶原蛋白和糖胺聚糖。其中含有型 型和型等多种胶原蛋白，以型和 型为主。脐带中大部分糖胺聚糖是透明质酸。根据脐带中的这些成分组成，宜采用胶原酶，透明质酸酶以及其它作用较温和的酶进行消化。针对脐带中含有胶原蛋白的类型，本发明采用型、 型胶原酶、透明质酸酶，结合accutase或中性蛋白酶对脐带组织进行消化。型， 型胶原酶，透明质酸酶消化细胞外基质中的胶原蛋白和透明质酸等成分，中性蛋白酶消化细胞外基质中的纤连蛋白同时也消化 型胶原蛋白，并不对细胞造成伤害，Accutase的作用较温和，具有辅助消化作用，且对细胞伤害较小。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，解决现有技术存在的缺陷，本发明所述技术方案包括步骤：

A）样本采集和细胞分离培养：

A1）严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了80-100U/ml青霉素和80-100μg/ml链霉素培养基的无菌容器，0-4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理；

A2）将脐带中的胶体组织收集到离心管或培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎成组织块；

A3）量取胶体组织块到一个新的无菌器皿中，加入消化液在35-37℃恒温振荡器中振荡孵育50-80分钟，振荡频率为40-60rpm；

A4）向步骤A3)中消化后得到的混合液中加入1-3倍体积的缓冲液稀释，充分混均后，转移并离心，弃上清液；

A5）向沉淀中加入缓冲液洗涤细胞，再次离心，弃上清液；

A6）向沉淀中加入生长培养基，充分吹打混匀后接种于贴壁培养皿中，放置培养箱中进行原代细胞培养，每二-三天换培养液；

B）传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养；

C）生长曲线绘制：待第二代脐带间充质干细胞融合度达到80%以上，将细胞消化好，并终止消化，充分吹打混匀，离心弃上清液；用培养基重悬细胞后计数，将细胞悬液加入多孔板进行培养、检测；将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线；

D）细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代代脐带间充质干细胞，缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。

2、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，还包括步骤：

E）成骨和脂肪细胞分化：采用第三代代细胞进行成骨和成脂细胞分化。

3、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：所述A步骤中的消化液含0.8-1.0mg/mlI型胶原酶，0.2-0.3mg/mlIV型胶原酶，1-1.5U/ml分散酶，8-10μg/ml透明质酸酶；其中1U/mldispase可用30%体积比的细胞消化液代替。

4、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：所述D）步骤标记的抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgG1和FITC-MouseIgG1。

本发明与现有技术相比，具有如下优势：

同时使用两种类型的胶原蛋白酶（型和 型），透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化（目前已有的专利文献对于胶原酶仅使用其中一种，也未使用accutase）。本发明的优点是该酶组合液与其它专利相比消化时间短，仅需要1小时。消化充分，组织块基本被消化完，组织块利用率高。使用2.5ml脐带组织消化后，经过7-8天培养可获得约2.5X10⁵个原代细胞。

附图说明

图1a原代脐带MSC细胞形态

图1bP1代脐带MSC细胞形态

图1cP3代脐带MSC细胞形态

图1dP5代脐带MSC细胞形态

图2P3代脐带MSC生长曲线

图3P3代脐带MSC流式检测结果，CD73，CD105，CD90，CD44和CD29阳性率大于95%，CD34，CD45和HLA-Dr阳性率小于2%

图4aP3代脐带MSC向成骨细胞分化结果，细胞表面已经被茜素红s染色液染成深红色，说明细胞表面已经形成钙化结。

图4bP3代脐带MSC向脂肪细胞分化结果，在细胞内部已经形成大量脂肪滴，并被油红氧染成红色。

图5对比实验结果，a、b、c和d分别为用本发明方法消化0.5h、1h、2h和3h，所获得的细胞数量分别为0.9X10⁵个、2.5X10⁵个、1.6X10⁵个和1.2X10⁵个；e和f分别为采用专利CN200910055219.0实施例3和专利CN201010605542.3实施例1的方法消化组织块1h,所获得的细胞数量分别为0.9X10⁵个和0.6X10⁵个。

具体实施方式

为了便于对本发明进一步理解，下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。

实施例1:

样本采集和细胞分离培养（实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理）

1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中，4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理。

2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中，用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。

3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度，用镊子撕开脐带表面羊膜，去除动脉和静脉。

4.剥掉脐带中的胶体组织（Wharton’sjelly，华通氏胶），弃掉羊膜组织。

5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm³大小的组织块。

6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中，加入6ml消化液（含0.8mg/ml型胶原酶，0.2mg/ml型胶原酶，1U/mldispase，10μg/ml透明质酸酶）在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟，振荡频率为60rpm。其中1U/mldispase可用30%(v/v)accutase代替。（U表示酶的活力单位）。

7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释，充分混均后，转移到15ml离心管中400g离心10min，弃上清液。

8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞，400g离心10min，弃上清液。

9.向沉淀中加入3mlMSC生长培养基，充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中，放置37℃，5%CO₂培养箱中进行原代细胞培养，每三天换液。

：间充质干细胞（mesenchymalstemcell）

MSC生长培养基成分：低糖DMEM+10%FBS+5ng/mlbFGF

FBS:fetalbovineserum（胎牛血清）

bFGF：basicfibroblastgrowthfactor（碱性成纤维细胞生长因子）

形态观察

原代细胞经过培养到第8天后，从培养箱中取出细胞在倒置显微镜下观察，此时局部细胞融合度已经达到80%，细胞形态为典型的纤维状梭形细胞，见图1a。

细胞传代培养P0传P1

原代脐带间充质干细胞培养到第8天，从培养箱中取出细胞，弃掉培养基，加入洗涤细胞一遍，弃掉PBS。加入0.25%胰蛋白酶消化细胞3-5分钟。待细胞消化下来后，加入MSC生长培养基终止消化，充份吹打混匀。取少量细胞悬液用Countstar细胞计数仪进行计数，经计数，原代细胞总量共2.5X10⁵个，将剩余细胞200g离心10分钟，弃上清液。用培养基重悬细胞，将细胞以5000个/cm²的密度接种于新的10cm培养皿中。放置37℃，5%CO₂培养箱中进行P1代细胞培养，每3天换液。待细胞融合度达到80%后，在显微镜下观察拍照，并继续传代培养。

细胞传代培养P1传P2

待P1代脐带间充质干细胞融合度达到80%后，从培养箱中取出细胞，弃掉培养基，加入PBS洗涤细胞一遍，弃掉PBS。加入0.05%胰蛋白酶消化细胞3分钟。待细胞消化下来后，加入MSC生长培养基终止消化，充份吹打混匀。取少量细胞悬液用Countstar细胞计数仪进行计数，将剩余细胞200g离心10分钟，弃上清液。用MSC培养基重悬细胞，将细胞以5000个/cm²的密度接种于新的10cm培养皿中。放置37℃，5%CO₂培养箱中进行P2代细胞培养，每3天换液，待细胞融合度达到80%后，在显微镜下观察拍照，继续传代培养（P2代以后的传代操作方式与P1代传P2代的操作方式相同）。

细胞生长曲线

采用P3代细胞绘制生长曲线。

待P2代脐带间充质干细胞融合度达到80%时，将细胞消化好，并终止消化，充份吹打混匀。将细胞200g离心10分钟，弃上清液。用MSC培养基重悬细胞，用conster细胞计数仪计数，向6孔板中每孔加入2ml细胞悬液（含10000个细胞），放置37℃，5%CO₂培养箱中培养7天，每3天换液。每隔24小时取3孔细胞进行消化计数，取3孔平均值。连续检测7天。将检测结果用excel绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。如图2。

流式检测

采用P3代细胞进行流式检测

准备消化好的P3代脐带间充质干细胞，PBS洗涤后对细胞进行抗体标记，标记抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgG1和FITC-MouseIgG1（抗体采购自BDbioscience）。经孵育洗涤后，上机检测，结果见图3。其中CD73，CD105，CD90，CD44和CD29阳性率大于95%，CD34，CD45和HLA-Dr阳性率小于2%，从流式结果来看，本方法分离培养得到的细胞符合MSC鉴定标准。

成骨和脂肪细胞分化

采用P3代细胞进行成骨和成脂细胞分化

脐带MSC向成骨细胞和脂肪细胞分化采用Gibco的成骨细胞分化和脂肪细胞分化试剂盒，货号分别是A10072-01，A10070-01。实验操作按说明书要求进行。实验结果见图4。

成骨分化结果中，细胞表面已经被茜素红染色液染成深红色，说明细胞已经向胞外分泌骨基质。在脂肪分化结果中，细胞中存在大量脂肪滴被油红氧染成红色。该实验结果说明本方法所获得的MSC能够向成骨细胞和脂肪细胞分化。

实施例2:

样本采集和细胞分离培养（实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理）

1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中，4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理。

2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中，用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。

3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度，用镊子撕开脐带表面羊膜，去除动脉和静脉。

4.剥掉脐带中的胶体组织（Wharton’sjelly，华通氏胶），弃掉羊膜组织。

5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。

6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中，加入6ml消化液（含2mg/mlI型胶原酶，2mg/mlIV型胶原酶，2U/mldispase，100μg/ml透明质酸酶）在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟，振荡频率为60rpm。

7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释，充分混均后，转移到15ml离心管中400g离心10min，弃上清液。

8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞，400g离心10min，弃上清液。

向沉淀中加入3mlMSC生长培养基，充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中，放置37℃，5%CO2培养箱中进行原代细胞培养，每三天换液。

实施例3:

样本采集和细胞分离培养（实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理）

1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中，4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理。

2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中，用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。

3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度，用镊子撕开脐带表面羊膜，去除动脉和静脉。

4.剥掉脐带中的胶体组织（Wharton’sjelly，华通氏胶），弃掉羊膜组织。

5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。

6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中，加入6ml消化液（含1mg/mlI型胶原酶，1mg/mlIV型胶原酶，1U/mldispase，50μg/ml透明质酸酶）在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟，振荡频率为60rpm。

7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释，充分混均后，转移到15ml离心管中400g离心10min，弃上清液。

8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞，400g离心10min，弃上清液。

向沉淀中加入3mlMSC生长培养基，充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中，放置37℃，5%CO2培养箱中进行原代细胞培养，每三天换液。

实施例4:

样本采集和细胞分离培养（实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理）

1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中，4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理。

2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中，用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。

3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度，用镊子撕开脐带表面羊膜，去除动脉和静脉。

4.剥掉脐带中的胶体组织（Wharton’sjelly，华通氏胶），弃掉羊膜组织。

5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。

6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中，加入6ml消化液（含1mg/mlI型胶原酶，1mg/mlIV型胶原酶，30%(v/v)accutase，50μg/ml透明质酸酶）在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟，振荡频率为60rpm。

7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释，充分混均后，转移到15ml离心管中400g离心10min，弃上清液。

8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞，400g离心10min，弃上清液。

向沉淀中加入3mlMSC生长培养基，充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中，放置37℃，5%CO2培养箱中进行原代细胞培养，每三天换液。

实施例5:

样本采集和细胞分离培养（实验中所使用的试剂耗材均经过无菌处理）

1.严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素MSC培养基的无菌玻璃瓶中，4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理。

2.在超净工作台中将胎儿脐带组织放入15cm培养皿中，用镊子将脐带中的血液挤出。再用PBS洗涤脐带组织直到将脐带表面的血液清洗干净。

3.用剪刀将脐带组织剪成3-5cm长度，用镊子撕开脐带表面羊膜，去除动脉和静脉。

4.剥掉脐带中的胶体组织（Wharton’sjelly，华通氏胶），弃掉羊膜组织。

5.将胶体组织收集到一个50ml离心管或6cm培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎到1mm3大小的组织块。

6.量取2.5ml胶体组织块到一个新的100ml无菌瓶中，加入6ml消化液（含0.5mg/mlI型胶原酶，0.5mg/mlIV型胶原酶，1U/mldispase，20%(v/v)accutase，10μg/ml透明质酸酶）在37℃恒温振荡器中振荡孵育60分钟，振荡频率为60rpm。

7.向步骤6中消化后得到的混合液中加入2倍体积的PBS稀释，充分混均后，转移到15ml离心管中400g离心10min，弃上清液。

8.向沉淀中加入5mlPBS洗涤细胞，400g离心10min，弃上清液。

向沉淀中加入3mlMSC生长培养基，充分吹打混匀后接种于6cm贴壁培养皿中，放置37℃，5%CO2培养箱中进行原代细胞培养，每三天换液。

对比实验

脐带组织块消化时间确定为1小时是根据对比实验得出的结论。在对比实验中采用本发明中的实验方法对相同用量的组织块（2.5ml）分别消化0.5h、1h、2h和3h做对比。将上述四个对比实验分别命名为a、b、c和d。组织块消化0.5h后仍有部分未被消化完,经过滤掉组块后将细胞接种到培养皿中。组织块消化1h、2h和3h后组织块基本被消化完全，不需要过滤。原代细胞经8天培养获得的细胞量分别是0.9X105个、2.5X105个、1.6X105个和1.2X105个。

另外，采用专利CN200910055219.0实施例3和专利CN201010605542.3实施例1的方法对相同用量的组织块(2.5ml)消化1小时与本方法作对比，消化液体积和组织块体积的比例均与原方法中相同。将这两个对比实验分别命名为e和f。两种方法将组织块消化1小时后均有大部分组织块未被消化掉，过滤去除组织块后将细胞接种到培养皿中。原代细胞经8天培养后，所获得的细胞数量分别是0.9X105个和0.6X105个。

将上述6个对比实验结果用excel做图，如图5所示。

Claims (4)

1.一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤：

A）样本采集和细胞分离培养：

A1）严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了80-100U/ml青霉素和80-100μg/ml链霉素培养基的无菌容器，0-4℃运输，运输过程中确保脐带组织完全浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理；

A2）将脐带中的胶体组织收集到离心管或培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织破碎成组织块；

A3）量取胶体组织块到一个新的无菌器皿中，加入消化液在35-37℃恒温振荡器中振荡孵育50-80分钟，振荡频率为40-60rpm；

A4）向步骤A3)中消化后得到的混合液中加入1-3倍体积的缓冲液稀释，充分混均后，转移并离心，弃上清液；

A5）向沉淀中加入缓冲液洗涤细胞，再次离心，弃上清液；

A6）向沉淀中加入生长培养基，充分吹打混匀后接种于贴壁培养皿中，放置培养箱中进行原代细胞培养，每二-三天换培养液；

B）传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养；

C）生长曲线绘制：待第二代脐带间充质干细胞融合度达到80%以上，将细胞消化好，并终止消化，充分吹打混匀，离心弃上清液；用培养基重悬细胞后计数，将细胞悬液加入多孔板进行培养、检测；将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线；

D）细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代代脐带间充质干细胞，缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。

2.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，还包括步骤：

E）成骨和脂肪细胞分化：采用第三代代细胞进行成骨和成脂细胞分化。

3.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：所述A步骤中的消化液含0.8-1.0mg/mlI型胶原酶，0.2-0.3mg/mlIV型胶原酶，1-1.5U/ml分散酶，8-10μg/ml透明质酸酶；其中1U/mldispase可用30%体积比的细胞消化液代替。

4.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：所述D）步骤标记的抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45,FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgG1和FITC-MouseIgG1。