CN105331535B - 用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法 - Google Patents

用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法。该微流控芯片通过构建以金为基底的二维网格图案，通过浸泡硫醇对图案表面进行疏水修饰，使细胞沿着图案实现有序生长；同时利用海藻酸钙聚合物盖住骨细胞细胞体，露出细胞突触，这样流体应力在突触部位就有了放大的作用，解决了传统的骨细胞流体应力刺激实验中细胞体和细胞突触表面会形成相同流体应力的难题，能更加真实地反映生理状态骨细胞的生物学特征。

Description

用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法。
背景技术
骨质疏松症会引起骨折等肢体功能缺失并发症，严重影响患者独立生活能力，降低生活质量。在中国就有6300万人患有不同程度的骨质疏松症。在骨组织的新陈代谢中，骨细胞能够通过调控成骨细胞和破骨细胞的功能实现骨组织的重塑，被认为是能从本质上解决骨质疏松症的潜在突破点，因此研究骨细胞具有非常重要的意义。
微流控技术作为一种新式研究工具，可在微观尺度下控制、操作和检测流体，由于其特征尺寸与细胞尺寸相比拟，具有在时空上精确控制细胞位置、细胞因子浓度和代谢物输运等能力。
在骨细胞的机制研究中，细胞培养是基本实验模型，通过一个能模拟体内环境的体外空间，配置以无菌、适当温度、酸碱度和一定营养条件培养细胞，使之生长繁殖并维持其结构和功能。细胞体外培养过程中能够获取大量可靠的细胞层面和分子层面的信息，因此骨细胞体外培养的研究是十分必要的。
骨细胞在生理条件下处于有流体应力的环境中。现有的研究骨细胞在流体应力刺激下的实验大多是将细胞接种于流体小室内，待细胞贴壁生长后，在小室内注入流体，进而观察在流体刺激下的细胞响应。
在实现本发明的过程中，申请人发现上述现有技术存在如下技术缺陷：
(1)骨细胞在体内有着特殊的微环境，细胞之间通过突触连接成网络结构，而传统的流体小室内骨细胞所处环境与体内微环境相差甚大，细胞突触无序生长、无法与周围环境建立有效物理连接。
(2)骨细胞包括位于陷窝中的细胞体和存在于纳米尺度沟道中的细胞突触，在生理条件下细胞突触感受到的流体应力远大于细胞体上感受到的流体应力。但是传统的流体小室内骨细胞的细胞体和细胞突触表面会形成相同的流体应力，在客观上难以真实反映生理状态骨细胞的生物学特征。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题，本发明提供了一种用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法，以更好的模拟人体骨细胞的特殊环境。
(二)技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种用于重建骨细胞微环境的微流控芯片。该微流控芯片包括：至少一条骨细胞培养沟道，用于进行骨细胞的培养，其至少包含一主沟道，在该主沟道的底壁上形成有二维网格图案。其中，在二维网格图案中，网格节点位置以及相邻网格节点横向和纵向连接的位置修饰有胶原，在网眼位置沉积有金薄膜，并在该金薄膜上修饰有硫醇。其中，具有骨细胞的培养基被注入主沟道中，骨细胞贴附于胶原修饰的网格节点位置，并沿相邻网格节点横向和纵向连接的方向伸出细胞突触，而硫醇修饰金薄膜的网眼位置骨细胞不能贴附。
优选地，上述微流控芯片中，骨细胞培养沟道还包括：中从沟道，正对主沟道设置，其前端连接至中流体进口；左从沟道，位于中从沟道的左侧，其前端连接至左流体进口；右从沟道，位于中从沟道的右侧，其前端连接至右流体进口；左从沟道和右从沟道在中从沟道的两侧对称设置，中从沟道、左从沟道、右从沟道的末端连接至主沟道的前端，主沟道的末端连接至流体出口。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述微流控芯片的使用方法。该制作方法包括：步骤S202：在骨细胞培养沟道中的主沟道的二维网格图案上网格节点位置以及相邻网格节点横向和纵向连接的位置的表面上修饰胶原；步骤S204：在骨细胞培养沟道内进行骨细胞接种；步骤S206：在骨细胞培养沟道内对骨细胞进行培养；步骤S208：待细胞在主沟道内贴壁良好后，中流体进口通入第一物质的溶液，左流体进口和右流体进口通入第二物质的溶液，调整液体流速，以使第一物质和第二物质反应生成的固态聚合物覆盖在骨细胞上，填充于沟道的中间位置并在两侧露出可供流体通过的通道，使靠近沟道两侧的骨细胞的突触被露出；以及步骤S212：通过在左从沟道和右从沟道引入可控制流体，利用流体的冲刷对骨细胞产生应力刺激，观测骨细胞在振荡流体应力作用下的响应。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明用于重建骨细胞微环境的微流控芯片及其使用方法将微流控技术与传统骨细胞的培养技术相结合，可以实现基底修饰、片上接种，二维网格图案形成，海藻酸钙聚合物固定以及外加流体振荡流刺激，具体来讲，其具有以下有益效果：
(1)通过构建以金为基底的二维网格图案，通过浸泡硫醇对图案表面进行疏水修饰，使细胞沿着图案实现有序生长；
(2)利用海藻酸钙聚合物盖住骨细胞细胞体，露出细胞突触，这样流体应力在突触部位就有了放大的作用，解决了传统的骨细胞流体应力刺激实验中细胞体和细胞突触表面会形成相同流体应力的难题，能更加真实地反映生理状态骨细胞的生物学特征。
附图说明
图1为根据本发明实施例重建骨细胞微环境的微流控芯片的俯视图；
图2为图1所示微流控芯片沿A-A’面的剖视图；
图3A为图1所示微流控芯片的一条骨细胞培养沟道中主沟道的示意图；
图3B为图3A所示主沟道表面二维网格图案的示意图；
图3C为图3A所示骨细胞培养沟道中流体进口、流体出口、从沟道和主沟道的示意图；
图4为微流控芯片的骨细胞培养沟道的主沟道中的细胞被固化后主沟道沿图3A中B-B’面的剖视图；
图5为根据本发明实施例微流控芯片制备方法的流程图；
图6为图5所示微流控芯片制备方法中执行各步骤后微流控芯片沿侧切方向的剖视图；
图7为根据本发明实施例微流控芯片使用方法的流程图。
具体实施方式
在对本发明进行介绍之前，首先对芯片设计的原理进行说明。请参照图1，有一种功能基团为聚乙醇长链(PEG)的硫醇分子(EG-terminated thiols，简称EG6，分子式为(HS(CH2)11(OCH2CH2)6OH)。这种硫醇分子可以与金属金(Au)发生反应，在硫原子(S)的一侧形成金硫键。而硫醇的另一端因为有PEG的存在，可以起到抗蛋白吸附的作用，进而阻止细胞吸附在Au表面。
本发明将微流控芯片技术与骨细胞的培养技术结合，通过限定细胞突触沿着纳米尺寸沟道定向生长的方法，利用海藻酸钙聚合物盖住骨细胞细胞体并露出细胞突触，最终引入流体振荡流刺激，更好地模拟了骨细胞在生理条件下的微环境。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种用于重建骨细胞微环境的微流控芯片。请参照图1，本实施例微流控芯片包括：基底；以及固定于基底上表面的沟道形成层。其中，在沟道形成层中形成三条骨细胞培养沟道。每条骨细胞培养沟道包括：主沟道，其末端连接至流体出口；中从沟道，正对主沟道设置，其前端连接至中流体进口，其末端连接至主沟道的前端；左从沟道，位于所述中从沟道的左侧，其前端连接至左流体进口，其末端连接至主沟道的前端；右从沟道，位于所述中从沟道的右侧，其前端连接至右流体进口，其末端连接至主沟道的前端。
以下对本实施例重建骨细胞微环境的微流控芯片的各个组成部分进行详细说明。
请参照图1，微流控芯片的面积为75mm×25mm，其沟道形成层上形成有三条的骨细胞培养沟道。该三条骨细胞培养沟道按照流体进/出口的方向交错设置，以节约芯片面积，实现在较小芯片面积上尽可能多的骨细胞培养沟道。
需要说明的是，本实施例中微流控芯片的沟道形成层上形成有三条的骨细胞培养沟道，但本发明并不以此为限。本领域技术人员可以根据芯片面积以及实验需要合理设置骨细胞培养沟道的数量，其可以为1条、2条、5条、10条、20条、50条，甚至上百条，均在本发明的保护范围之内。
请继续参照图1，骨细胞培养沟道中，主沟道的长度为5mm，宽度为300μm。中从沟道正对主沟道设置，左从沟道和右从沟道位于中从沟道的两侧，两者相对于中从沟道对称设置，三条从沟道的宽度均为100μm。三个流体进口的直径为4mm，左/右流体进口与中流体进口之间的距离为9mm。
如图2所示，整个沟道形成层的厚度为2mm，而主沟道和三条从沟道的高度均为100μm。此外，本实施例中，主沟道和三条从沟道的纵剖面形状均为圆形，但本发明并不以此为限。在本发明其他实施例中，主沟道和三条从沟道的纵剖面形状还可以为椭圆形，矩形等形状。
此外，关于细胞培养沟道、主沟道、从沟道等的形状、尺寸等，本领域技术人员可以根据需要合理设计，而不应当局限于本实施例所给出的具体结构。只是在一般情况下，主沟道的长度介于3mm～10mm之间，其高度介于20μm～500μm之间。
本实施例中，基底采用透明玻璃片，沟道形成层由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，简称PDMS)制作。而在本发明其他实施例中，还可以采用有机塑料片、Al2O3片、MgO片作为基底，还可以采用玻璃、石英、聚甲基丙烯酸甲酯等材料制作沟道形成层。
图3A为图1所示微流控芯片的一条骨细胞培养沟道中主沟道的示意图。如图3A所示，在主沟道的底壁，即透明玻璃的上表面形成有二维网格图案。
图3B为图3A所示主沟道表面二维网格图案的示意图。请参照图3B，在网格节点(直径范围20μm～25μm)位置以及相邻网格节点横向和纵向连接位置的玻璃基底上修饰有胶原，而在主沟道底部网眼位置的玻璃基底上，沉积有金薄膜，并且在金薄膜上修饰有硫醇分子。
请参照图3B，有硫醇修饰金薄膜的基底位置，限制了骨细胞的贴附，如黑色部分所示。有胶原修饰的基底位置，骨细胞可以贴附其上，并且沿水平方向伸出细胞突触，并在细胞突触之间形成连接，如图白色部分所示。
需要说明的是，为了保证胶原活性，做实验之前再进行胶原修饰。若能保证其活性，商品化的产品可以事先进行胶原修饰。
请参照图3C，在骨细胞培养沟道进口一侧的PDMS沟道形成层上具有三个圆形的流体进口-中流体进口、左流体进口和右流体进口。该三个流体进口可以通过滴管或者注射泵注入液体，并通过相应的从沟道汇流至主沟道中。
在不同阶段，三个流体进口所起到的作用是不同的：
(1)在细胞接种和换液阶段，三个流体进口均可以通入相应的溶液；
(2)在固化细胞阶段，中间位置的中流体进口用于通入海藻酸钠溶液，两侧的左流体进口和右流体进口用于通入氯化钙溶液。海藻酸钠与氯化钙在通过各自的从沟道流入主沟道后发生反应生成海藻酸钙聚合物，通过调节流速，使海藻酸钙聚合物覆盖在骨细胞上，填充于主沟道的中间位置并在两侧露出可供流体通过的通道，使靠近主沟道两侧的骨细胞突触被露出，如图4所示。
最终，前端中间的中流体进口以及后端的流体出口会被反应生成的海藻酸钙聚合物填充封闭。
本领域技术人员应当清楚，海藻酸钙聚合物固定层可以使海藻酸钙聚合物选择性覆盖两侧细胞的细胞体并且露出突触部分，这样在突触部位对流体应力就有了放大的作用，进而构成骨细胞的三维体外微环境。
(3)在观测阶段，将PBS通过左流体进口和右流体进口通入主沟道，并通过抽吸液体形成振荡流体对细胞提供流体冲击，研究靠近沟道壁两侧的骨细胞在其影响下的细胞响应。
以下介绍如上所述重建骨细胞微环境的微流控芯片的制备方法。请参照图5，本实施例微流控芯片制备方法包括：
步骤S102：制作沟道形成层；
该制作沟道形成层的步骤又可以包括：
子步骤S102a：光刻胶SU 8-5制作种子层：
载玻片依次经过丙酮、乙醇和去离子水清洗后，烘干表面均匀旋转涂敷一层SU-85，经曝光后形成种子层，如图6中A图所示。
子步骤S102b：光刻胶SU 8-2100制作阳模：
在种子层上均匀旋涂一层SU 8-2100，放上掩模版后经紫外曝光，见图6中子图B；显影、坚膜得到细胞培养微沟道阳模，如图6中C图所示。
子步骤S102c：PDMS的浇注、翻模与打孔
细胞培养微沟道阳模在浇筑PDMS固化、翻模得到骨细胞培养沟道的PDMS翻模，在骨细胞培养沟道两端打孔完成微流控芯片的沟道形成层的制作，如图6中D图、E图、F图所示。
步骤S104：制作具有二维网格图案的基底；
该制作具有二维网格图案的基底的步骤又可以包括：
子步骤S104a：光刻胶AZ1500制作掩膜；
载玻片经过丙酮、乙醇和去离子水清洗后吗，烘干表面并均匀旋转涂覆一层AZ1500型光刻胶，放上掩膜版后经曝光显影后制成光刻胶掩膜，如图6中G图、H图、I图所示。
子步骤S104b：钛、金的溅射及剥离：
在具有光刻胶掩膜的载玻片表面先后溅射钛层和金层，如图6中J图所示。将载玻片放入丙酮中超声处理，光刻胶掩膜及其表面的金属层被剥离，直接溅射在玻璃表面的金属层被保留，用N2吹干后得到来了以金和玻璃为基底的二维网格图案，如图6中K图所示。
步骤S106：沟道形成层与基底键合，如图6中L图所示。
步骤S108：金表面硫醇修饰：
在微流控芯片的骨细胞培养沟道中的主沟道的二维网格图案上金表面进行硫醇修饰。将硫醇/乙醇溶液加入沟道中，静置24小时。用无水乙醇冲洗干净，用37℃烘箱吹干，如图6中M图所示。
以下介绍如上所述重建骨细胞微环境的微流控芯片的使用方法。请参照图7，本实施例微流控芯片使用方法包括：
步骤S202：微沟道基底表面修饰：
在进行实验之前，在微流控芯片的骨细胞培养沟道中的主沟道的二维网格图案上网格节点位置以及相邻网格节点横向和纵向连接的位置的表面上修饰胶原。
具体而言：用移液枪对准微沟道一侧进口，向微沟道内包括两端的液滴进口全部打满70％的酒精溶液对微沟道进行灭菌处理；待酒精挥发干净，在进口中全部打满磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，清洗3次。再向芯片微流道中注入胶原溶液，静置4小时，使溶液中的胶原分子沉降于微沟道底面，形成修饰层，最后使用培养液将微沟道冲洗干净并浸泡、静置过夜，以便于后期骨细胞的接种。
步骤S204：在骨细胞培养沟道内进行骨细胞接种；
具体而言：与修饰方法类似，依靠重力作用接种细胞。将培养在培养瓶中的骨细胞消化、离心，再加入新鲜培养液配置成浓度为5×105个/ml的细胞悬液。吸出培养基，用两只移液枪同时吸取细胞悬液，左流体进口，中流体进口及右流体进口中加入20μl，流体出口中加入15μl。将芯片原地静置约5分钟，待主沟道内溶液稳定、细胞沉降，便可将芯片放于显微镜下观察记录接种的密度和均匀程度等情况，最后将芯片放入37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养。
本实施例中，在主沟道的一侧设置了位置标记，方形小标记的数量代表微沟道位置的序号。利用此标记可以清楚地分析微沟道内细胞的分布情况。
步骤S206：在骨细胞培养沟道内对骨细胞进行培养；
本实施例中，每间隔12小时，就用移液枪吸出三个流体进口和出口的旧溶液，并用移液枪在三个流体进口及出口中同时滴入20μl新鲜培养基，为骨细胞提供必要的营养物质。两端同时加入相同体积培养基可以消除微沟道两端液面差，保证主沟道内没有液体流动，消除流体剪切力作用而影响骨细胞生长的可能性。
步骤S208：海藻酸钙聚合物固定：待细胞在主沟道内贴壁良好后，用管子将进口和注射泵相连，中流体进口通入海藻酸钠，左流体进口和右流体进口通入氯化钙，通过调整注射泵流速来调整液体流速，以使海藻酸钠和氯化钙反应生成的海藻酸钙聚合物覆盖在骨细胞上，填充于沟道的中间位置并在两侧露出可供流体通过的通道，使靠近沟道两侧的骨细胞的突触被露出，如图4所示。
以下述尺寸的芯片为例：通入氯化钙以及海藻酸钠的三条从沟道(中从沟道、左从沟道和右从沟道)的高度为100μm，宽度为100μm，主沟道高度100μm，宽度300μm。氯化钙流速每分钟2μl，海藻酸钠流速每分钟2μl，可以在主通道中央形成宽度为100μm左右的海藻酸钙聚合物。这样海藻酸钙聚合物可以盖住一部分骨细胞的细胞体，露出细胞突触，这样就形成了类似生理环境中突触周围所需要的微尺寸沟道，加上骨细胞可以沿着金基底所形成的结构贴壁伸长构成二维网格，这样就构成了类似生理条件的骨细胞的三维体外微环境。
步骤S210：结构表征：海藻酸钙聚合物固定后，通过扫描电镜检查海藻酸钙聚合物盖住细胞的情况，观察骨细胞微环境重建情况。在确定骨细胞突触伸出海藻酸钙聚合物而细胞体被海藻酸钙聚合物包裹的情况下，进行后续实验；
步骤S212：引入流体振荡流观测骨细胞响应：在步骤S208中海藻酸钙聚合物固化后在两侧形成了通道，通过在左从沟道和右从沟道引入可控制流体，流体的冲刷可以对骨细胞产生应力刺激，进而使用免疫荧光或免疫组化等方法探索骨细胞在振荡流体应力作用下钙离子分布、一氧化氮合成和细胞凋亡信号传导通路等的响应。
在本实施例另外的实施例中，微流控芯片设计和第一实施例中相同，但注入的盖住骨细胞细胞体而露出骨细胞突触的物质不是海藻酸钙聚合物，而是胶原，琼脂糖水凝胶或明胶等物质，将这些物质从中流体进口用泵注入，左流体进口和右流体进口中用泵注入油相物质，通过调节流速使这些物质能在主沟道中形成稳定的液流并通过后续静置及控制温度，使其凝结成同第一实施例中海藻酸钙聚合物类似的具有一定形态的物质。后续使用方法及应用与第一实施例中相似。
在本发明另外的实施例中，主沟道为长条形，并没有两侧的从沟道。主沟道的两端只有一个流体进口和一个流体出口，底部有和第一实施例中相同的二维网格图案，通过从进口中通入海藻酸钙聚合物或胶原等物质，使其填充于整个沟道内。主要应用为研究大序列的骨细胞在非流体应力的其他刺激(如药物刺激等)下的细胞响应。
至此，已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明重建骨细胞微环境的微流控芯片及其制作方法和使用方法有了清楚的认识。
此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：
(1)骨细胞培养沟道形状不限，可以为矩形、梯形、蛇形等双进口结构；流体进口也不局限于圆形，可以替换为正方形、三角形等。每片玻璃上的骨细胞培养沟道的数量不限于三个，可根据需要在同一片玻璃上设计多个骨细胞培养沟道，实现高通量；
(2)二维网格图案不局限于实施例中所描述的形状，只要是中间留有细胞体附着的大面积网格节点，周围有引导其突触伸长方向的设计即可，其中，网格节点的形状可以为圆形、椭圆形或矩形，沿相邻网格节点横向和纵向连接的网格线可以为长条形或长线形；
(3)一般情况下，主沟道的宽度介于100μm～500μm之间，所述网格节点的径向宽度介于10μm～50μm之间，并且，网格节点的大小可以随主沟道的尺寸变化而调整；
(4)细胞接种的密度不局限于5×105个/ml，可以用任意实验需求的细胞密度来代替；
(5)长时间骨细胞培养过程中，换液时间不局限于12小时，可以为实验需要的任意时间间隔；
(6)金表面硫醇修饰时，溶解硫醇的液体不局限于酒精，也可以使用PBS，去离子水等。
综上所述，本发明将微流控芯片技术与骨细胞的培养技术结合，通过构建以金为基底的二维网格图案，通过浸泡硫醇对图案表面进行疏水修饰，使细胞沿着图案实现有序生长，同时，利用海藻酸钙聚合物盖住骨细胞细胞体，露出细胞突触，这样流体应力在突触部位就有了放大的作用，解决了传统的骨细胞流体应力刺激实验中细胞体和细胞突触表面会形成相同流体应力的难题，能更加真实地反映生理状态骨细胞的生物学特征，具有较好的应用前景。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种用于重建骨细胞微环境的微流控芯片，其特征在于，包括：
至少一条骨细胞培养沟道，用于进行骨细胞的培养，其至少包含一主沟道，在该主沟道的底壁上形成有二维网格图案；
其中，在所述二维网格图案中，网格节点位置以及相邻网格节点横向和纵向连接的位置修饰有胶原，在网眼位置沉积有金薄膜，并在该金薄膜上修饰有硫醇；
其中，具有骨细胞的培养基被注入主沟道中，骨细胞贴附于胶原修饰的网格节点位置，并沿相邻网格节点横向和纵向连接的方向伸出细胞突触，而硫醇修饰金薄膜的网眼位置骨细胞不能贴附，在细胞突触之间形成连接。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述胶原和/或硫醇为在具有骨细胞的培养基被注入主沟道之前被修饰至相应位置。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述网格节点的形状为圆形、椭圆形或矩形，所述相邻网格节点横向和纵向连接的形状为条形或线形。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：
所述主沟道的纵剖面形状为圆形、椭圆形或矩形；
所述主沟道的宽度介于100μm～500μm之间，所述网格节点的径向宽度介于10μm～50μm之间。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述主沟道具有一个流体进口和一个流体出口；
其中，所述流体进口用于通入可固化物质，该可固化物质用于固化主沟道内骨细胞。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述可固化物质为海藻酸钙聚合物或胶原。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述骨细胞培养沟道还包括：
中从沟道，正对所述主沟道设置，其前端连接至中流体进口；
左从沟道，位于所述中从沟道的左侧，其前端连接至左流体进口；
右从沟道，位于所述中从沟道的右侧，其前端连接至右流体进口；
所述左从沟道和右从沟道在所述中从沟道的两侧对称设置，所述中从沟道、左从沟道、右从沟道的末端连接至所述主沟道的前端，所述主沟道的末端连接至流体出口。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，所述中流体进口用于通入第一物质的溶液，所述左流体进口和右流体进口用于通入第二物质的溶液；
其中，所述第一物质与第二物质发生反应，生成固态聚合物填充于主沟道的中间位置，覆盖在骨细胞上，同时在主沟道两侧露出可供流体通过的通道，使靠近主沟道两侧的骨细胞突触被露出，构成骨细胞的三维体外微环境。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一物质为海藻酸钠，所述第二物质为氯化钙，两者发生反应，生成海藻酸钙聚合物填充于主沟道的中间位置，覆盖在骨细胞上。
10.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，所述中流体进口用于通入易凝结物质，所述左流体进口和右流体进口用于通入水或油相物质；
其中，所述易凝结物质通过静置和/或温度控制，形成固态聚合物覆盖在骨细胞上，填充于主沟道的中间位置，覆盖在骨细胞上，同时在主沟道两侧露出可供流体通过的通道，使靠近主沟道两侧的骨细胞突触被露出，构成骨细胞的三维体外微环境。
11.根据权利要求10所述的微流控芯片，其特征在于，所述易凝结物质为胶原，琼脂糖水凝胶或明胶。
12.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，包括多条的骨细胞培养沟道，该多条骨细胞培养沟道按照流体进/出口的方向交错设置。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，包括：
基底；以及
沟道形成层，固定于所述基底的上表面，其中形成至少一所述的骨细胞培养沟道；
其中，所述主沟道的底壁为主沟道底部的基底表面。
14.根据权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底为玻璃片、有机塑料片、Al2O3片或MgO片；
所述沟道形成层由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料、聚甲基丙烯酸甲酯材料、玻璃材料或石英材料制备而成。
15.一种权利要求7所述微流控芯片的使用方法，其特征在于，包括：
步骤S202：在骨细胞培养沟道中的主沟道的二维网格图案上网格节点位置以及相邻网格节点横向和纵向连接的位置的表面上修饰胶原；
步骤S204：在骨细胞培养沟道内进行骨细胞接种；
步骤S206：在骨细胞培养沟道内对骨细胞进行培养；
步骤S208：待细胞在主沟道内贴壁良好后，中流体进口通入第一物质的溶液，左流体进口和右流体进口通入第二物质的溶液，调整液体流速，以使第一物质和第二物质反应生成的固态聚合物覆盖在骨细胞上，填充于沟道的中间位置并在两侧露出可供流体通过的通道，使靠近沟道两侧的骨细胞的突触被露出；以及
步骤S212：通过在左从沟道和右从沟道引入可控制流体，利用流体的冲刷对骨细胞产生应力刺激，观测骨细胞在振荡流体应力作用下的响应。
16.根据权利要求15所述的使用方法，其特征在于，所述第一物质为海藻酸钠，所述第二物质为氯化钙。
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