KR101426056B1 - 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 혈관 투과성 측정 방법 - Google Patents

생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 혈관 투과성 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 외에서도 생체 내 혈관과 유사한 성질을 지닌 혈관을 생성할 수 있는 생체 외 혈관 생성 장치, 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법, 및 생성된 혈관의 투과성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 혈관 투과성 측정 방법{DEVICE FOR IN VITRO BLOOD VESSEL FORMATION AND VASCULAR PERMEABILITY ASSAY USING THE SAME}
본 발명은 생체 외에서 혈관을 생성하기 위한 생체 외 혈관 생성 장치, 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법, 및 생성된 혈관의 투과성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
혈관의 형성과 기능은 수많은 생리 및 병리학적 현상을 매개하는 중요한 과정이다. 암의 발생과 전이, 당뇨병에 의한 실명, 노인황반변성, 건선, 류마티스 관절염을 포함한 70 종 이상의 질병이 혈관의 생성 및 기능에 대한 이상에 의해 발생 혹은 악화되는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 과정의 메커니즘을 이해하고 이를 조절하는 약물 및 치료법을 개발하는 연구는 다양한 질병에 대한 극복으로 이어질 수 있다. 이는 최근의 암 극복 노력이 혈관 신생의 억제를 통한 암세포의 사멸 유도에 집중되어 온 연구 경향을 통해서도 엿볼 수 있다. 앞서 언급한 혈관 관련 질병의 극복을 위한 기초 연구와 신약의 개발은 혈관의 형성과 기능, 그리고 병리학적 현상 등을 체외에서 모사하는 실험 플랫폼의 구현을 필요로 한다.
종래의 혈관신생 관련 연구 방법 또는 약물 테스트 방법 중 대표적이라 할 수 있는 반 투과막 위에 세포를 부착시켜 배양하는 시스템(Gastroenterology 96(3), 736-749,1989)은 생체 내의 혈관을 이용한 실험들에 비해 시간 및 노동력의 비용은 적게 드나, 실제 생체 내 혈관의 생물학적 특성을 정확히 모사하지 못하여 실제 혈관의 생물학적 행태의 정확한 예측은 어렵다는 단점이 있었다.
실험용 쥐를 이용하여 쥐의 생체 내에서 혈관 내 약물을 투여하고 테스트하는 실험 방법(J. Pharm . Pharmacol . 53, 1007-1013, 2001) 등은, 동물을 해부하고 특정 장기를 판별하여 튜브를 연결하는 등 실험 과정이 복잡하고 시간과 비용이 많이 든다는 단점이 있었다.
이에 동물 실험을 하지 않고서도 생체 외(in vitro)에서 실제 생체 내(in vivo) 환경과 유사한 환경에서 혈관과 관련된 연구 또는 약물 테스트를 수행할 수 있도록, 생체 외에서 실제 혈관과 유사한 혈관을 생성하는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다. 즉, 생체 외에서도 생체 내와 유사한 혈관을 생성할 수 있는 생체 외 혈관 생성 장치, 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법, 및 생성된 혈관의 투과성을 측정하는 방법의 개발이 필요하다.
이에, 상기와 같은 과제를 해결하고자 본 발명은, 제 1 배양액 저장소(media reservoir)와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 제 1 배양액 채널; 제 2 배양액 저장소와 유체간 상호작용하고, 제 1 배양액 채널과 병렬로 배치된 제 2 배양액 채널; 혈관 채널 유입구와 유체간 상호작용하고, 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널 사이에서 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널의 일측면과 접하는 혈관 채널; 및 기질 세포 채널 유입구와 유체간 상호작용하고, 제 2 배양액 채널의 타측면과 접하고, 제 2 배양액 채널과 병렬로 배치된 기질 세포 채널을 포함하고, 혈관 채널에는 돌출된 2 개 이상의 격벽 구조가 형성되어 있고, 각각의 격벽 구조는 제 1 배양액 채널과 병렬로 배치된 제 1 격벽, 제 1 격벽에서 제 2 배양액 채널 방향으로 연장 형성된 제 2 격벽, 제 2 격벽에서 연장 형성되고 제 1 격벽과 병렬로 배치된 제 3 격벽, 및 제 1 격벽, 제 2 격벽 및 제 3 격벽이 둘러싼 공간에 형성된 1 개 이상의 돌출부를 포함하고, 각 채널이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학 물질들간 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 갭(gap)을 두고 배열된, 생체 외 혈관 생성 장치를 제공한다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 하나 이상의 채널에 독립적으로 혈관형성세포, 세포외기질(extracellular matrix, ECM), 세포배양액, 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및 공동배양세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 순차적으로 또는 동시에 주입하여, 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는, 생체 외 혈관 생성 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에 의하여 생성된 혈관 내에 형광 마커를 주입하거나, 생성된 혈관의 내피 양단간의 전기 저항(transendothelial electrical resistance, TEER) 수치를 측정하여 혈관의 투과성을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 생체 외에서도 생체 내 혈관과 유사한 성질을 지닌 혈관을 생성할 수 있는 생체 외 혈관 생성 장치, 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법, 및 생성된 혈관의 투과성을 측정하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 사시도 및 부분 확대도이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 평면도 및 부분 확대도이다.
도 4는 겔 주입 모델링으로서, 혈관 채널 내 겔 충전의 컴퓨터 시뮬레이션을 나타낸다.
도 5는 겔 주입 실험 과정의 DIC 이미지로서, 겔 충전 및 세포 시딩 과정을 나타낸다. (a)는 겔 주입 전, (b)는 배양액 없는 상태에서 겔 및 기질 세포 주입 후, (c)는 배양액 있는 상태에서 겔 벽에 내피 세포 부착 후를 각각 나타낸다. 우측 하단의 스케일 바는 500 ㎛이다.
도 6은 LF로 유도된 HUVEC 스프라우트 성장의 현미경 사진이다. 우측 하단의 스케일 바는 70 ㎛이다.
도 7은 U87MG로 유도된 HUVEC 스프라우트 성장의 현미경 사진이다. 우측 하단의 스케일 바는 70 ㎛이다.
도 8은 미세 혈관의 3차원 사진 및 밀착 연접 발현을 나타낸다. 스케일 바는 70 ㎛이다.
도 9는 미세 혈관 루멘 내로 FITC-덱스트란을 도입한 후 시간에 따른 혈관주변 영역의 형광 강도 변화를 나타낸 것이다.
도 10의 b는 상이한 분자량의 FITC-덱스트란 분자를 미세 혈관 내에 도입한 후 투과 계수를 측정한 그래프이다(각 조건별 n=4). c는 상이한 용량의 TNF-α의 처리에 따른 미세 혈관의 투과성을 나타낸 그래프이다(각 조건별 n=5, *p < 0.05). 에러 바는 SEM을 나타낸다.
도 11은 LF 또는 U87MG에 의해 유도된 미세 혈관의 혈관 투과성 비교 및 Avastin 처리에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다(각 조건별 n=6~9, *p < 0.05). 에러 바는 SEM을 나타낸다.
이하, 도면을 참조하면서 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 제 1 배양액 저장소(110)와 유체간 상호작용하는 제 1 배양액 채널(100); 제 2 배양액 저장소(210)와 유체간 상호작용하고, 제 1 배양액 채널(100)과 병렬로 배치된 제 2 배양액 채널(200); 혈관 채널 유입구(310)와 유체간 상호작용하고, 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200) 사이에서 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)의 일측면과 접하는 혈관 채널(300); 및 기질 세포 채널 유입구(510)와 유체간 상호작용하고, 제 2 배양액 채널(200)의 타측면과 접하고, 제 2 배양액 채널(200)과 병렬로 배치된 기질 세포 채널(500)을 포함하고, 혈관 채널(300)에는 돌출된 2 개 이상의 격벽 구조(600)가 형성되어 있고, 각각의 격벽 구조(600)는 제 1 배양액 채널(100)과 병렬로 배치된 제 1 격벽(610), 제 1 격벽(610)에서 제 2 배양액 채널(200) 방향으로 연장 형성된 제 2 격벽(620), 제 2 격벽(620)에서 연장 형성되고 제 1 격벽(610)과 병렬로 배치된 제 3 격벽(630), 및 제 1 격벽(610), 제 2 격벽(620) 및 제 3 격벽(630)이 둘러싼 공간에 형성된 1 개 이상의 돌출부(640)를 포함하고, 각 채널이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학 물질들간 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 갭을 두고 배열된, 생체 외 혈관 생성 장치에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 생체 외 혈관 생성 장치는 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200) 사이에서 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)의 일측면과 접하고, 혈관 채널(300)과 연결되어 배치된 공 채널(400)을 추가로 포함한다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 장치에서는 반복 형성된 특정 구조의 격벽 구조(600)를 갖는 혈관 채널(300)을 포함함으로써, 기존의 생체 외 혈관 생성 구조물에 비해 더욱 효과적이면서도 생체 내 혈관과 더욱 유사한 형태의 혈관을 생성할 수 있게 된다.
본 발명의 혈관 생성 장치의 채널의 높이와 폭은 특별히 제한되지 않고, 채널에 주입되는 물질의 종류나 실험의 목적 및 조건에 따라 유동적으로 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 채널의 높이는 10 ㎛ 내지 100 ㎛이고, 30 ㎛ 내지 80 ㎛가 바람직하고, 40 ㎛ 내지 60 ㎛가 더 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 "미세구조물"이란 용어는 혈관 채널(300) 내에 존재하는 격벽 구조(600) 뿐만 아니라, 혈관 채널(300)과 임의 채널인 공 채널(400) 간, 혈관 채널(300)과 배양액 채널(100, 200) 간, 제 2 배양액 채널(200)과 기질 세포 채널(500) 간을 경계 짓는 마이크로 단위의 구조물을 총칭하는 개념으로 정의된다. 각 채널이 서로 접하는 경계에 형성되는 미세구조물의 형태는 특별히 제한되지 않지만, 마이크로포스트(micropost)의 형태일 수 있다. 일 구현예에서, 미세구조물이 형성하는 갭의 크기(폭)는 10 ㎛ 내지 100 ㎛이고, 50 ㎛ 내지 90 ㎛가 바람직하고 60 ㎛ 내지 80 ㎛가 더 바람직하다. 일례로서, 마이크로 갭의 크기는 70(폭) ㎛ × 50(높이) ㎛일 수 있다.
본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치는 예를 들어, 리소그래피 방법, 몰딩 방법 등에 의해 제작할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 실리콘 웨이퍼 상에 포토레지스트를 두께 50 내지 100 ㎛로 쌓은 후, 투과성 막 위에 형성된 패턴을 통해 자외선을 투사하여 포토레지스트를 경화시켜 구조물을 제작한다. 이렇게 제작된 구조물 상에 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)를 부어 경화시킨 후 이를 박막 유리와 접합하여 혈관 생성 장치를 만들 수 있다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 장치 구조의 바람직한 구현예를 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 도 1은 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 사시도 및 부분 확대도이고, 도 2 및 도 3은 평면도 및 부분 확대도이다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, 혈관 생성 장치에는 공 채널을 포함하여 5 개의 채널이 존재할 수 있고, 각 채널 사이에는 채널에 포함된 생화학 물질들간 상호작용을 허용하는 미세구조물이 형성되고, 혈관은 혈관 채널에 형성되게 된다.
도면에 도시되어 있지 않으나 본 발명의 혈관 생성 장치는 커버 글래스 슬립을 포함할 수 있다.
혈관 채널(300)은 내부에 세포외기질 또는 세포외기질 및 혈관형성세포가 충전됨으로써 3차원의 혈관 형성 영역을 형성한다. 혈관 형성 영역은 혈관형성세포가 3차원으로 증식 및 분화하여 혈관을 형성할 수 있는 공간을 제공한다. 혈관 채널(300)이 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)과 접하는 경계에는 특정 격벽 구조(600) 또는 그 외의 미세구조물이 갭을 두고 배열되어 있기 때문에, 세포외기질 또는 세포외기질 및 혈관형성세포를 혈관 채널(300)에 주입했을 때, 세포외기질 또는 세포외기질 및 혈관형성세포가 표면장력에 의해 미세구조물 사이로 빠져나가지 않고 혈관 채널(300) 내에서 혈관 형성 영역을 형성하게 된다.
반면에 각 채널에 포함된 각종 생화학 물질들은 상기 미세구조물 사이의 갭을 통해 이동할 수 있기 때문에, 배양액 채널(100, 200) 내에 포함된 다양한 혈관형성인자, 영양성분 등은 혈관 채널(300)로 공급될 수 있다.
또한, 혈관 형성 영역에서 생성된 혈관이 상기 복수의 미세구조물이 만들어낸 갭을 향해 뻗어나오면서 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)과 연통되어 혈관의 출입구를 형성할 수 있다. 따라서, 복수의 미세구조물들 사이의 갭과 연통된 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)을 통해 혈관의 루멘(lumen) 내부로 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 신호를 직접 전달함으로써 혈관의 반응을 실시간으로 관찰하고 이미징(imaging)할 수 있다.
따라서 혈관 채널의 미세구조물, 특히 격벽 구조(600)의 배치, 개수, 크기 등의 변화를 통해 생성하고자 하는 혈관 네트워크의 입구와 출구의 개수를 조절 가능하다. 따라서 미세구조물의 형상 등의 파라미터는 도면에 도시된 구현예에 한정되지 않고 실험의 목적 및 구성에 따라 적절히 조절할 수 있음은 자명하다.
혈관 채널로 주입된 경화 이전의 액상의 세포외기질 또는 세포외기질 및 혈관형성세포는 복수의 미세구조물들 사이에서 모세관 현상 및 표면 장력에 의한 메니스커스(meniscus)를 형성한다. 메니스커스는 역치 압력 수준(threshold pressure level) 이하에서는 표면 장력에 의해 인접한 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)로 전진하지 못한다. 복수의 미세구조물 사이에서 메니스커스가 측면의 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)로 전진하지 않고 정지할 수 있는 압력의 범위는 미세구조물들 사이의 간격과 높이에 영향을 받는다. 따라서 이 두 파라미터(미세구조물들 사이의 간격 및 미세구조물의 높이)를 최적화함으로써 역치 압력 수준을 조절할 수 있으며, 구체적인 역치 압력 수준의 조절 방법은 Carlos P. Huang et al. (Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures, Lab Chip, 2009, 9, 1740-1748)에 개시된 내용을 참고할 수 있다.
이렇게 미세구조물들 사이의 간격 및 미세구조물의 높이를 조절하여 혈관 채널(300)에 세포외기질 또는 세포외기질 및 혈관형성세포가 주입될 때 메니스커스가 효과적으로 구조물 사이에서 정지할 수 있도록 함으로써, 서로 완전히 물리적으로 분리되지 않은 채널과 채널 사이에서 세포외기질의 충전을 정밀하게 조절할 수 있다. 이는 기질 세포 채널(500)에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포가 충전되는 경우에도 마찬가지이다.
일 구현예에서, 혈관 채널에 격벽 구조(600)가 1 내지 15 개 존재하고, 5 내지 8 개 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 일 구현예에서 격벽 구조(600) 당 1 개의 돌출부(640)를 포함하는 것이 바람직하다. 돌출부(640)의 형상은 혈관 채널 유입구(310) 방향의 일측 보다 반대 방향, 즉 공 채널(400)이 존재하는 경우 공 채널(400) 방향의 타측의 길이가 더 긴 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 제 2 격벽(620)은 제 1 격벽(610)에서 수직 방향으로 연장 형성되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 제 3 격벽(630)은 제 1 격벽(610), 제 2 격벽(620) 및 제 3 격벽(630)이 둘러싼 공간 방향의 절곡부(631)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 절곡부(631)는 제 1 격벽(610)과 제 2 격벽(620)의 결합부를 향한 방향으로 절곡될 수 있다.
일 구현예에서, 공 채널(400)이 존재하는 경우, 혈관 채널(300)과 공 채널(400)의 경계에 2 개의 미세구조물이 배열되는 것이 바람직하다. 상기 미세구조물은 혈관 채널(300) 내의 돌출부(640)와 동일한 형상을 가질 수 있다.
기질 세포 채널(500)은 내부에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포가 충전됨으로써 3차원의 세포 배양 영역을 형성한다. 기질 세포 채널(500)이 제 2 배양액 채널(200)과 접하는 경계에도 복수의 미세구조물이 갭을 두고 배열되어 있기 때문에, 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 기질 세포 채널(500)에 주입했을 때, 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포는 표면장력에 의해 미세구조물 사이로 빠져나가지 않고 기질 세포 채널(500) 내에서 세포 배양 영역을 형성하게 된다. 세포 배양 영역은 공동배양세포가 3차원으로 배양될 수 있는 공간을 제공한다. 이러한 3차원 다세포 공동 배양(multicellular co-culture)을 통해 생체 내 환경을 매우 유사하게 생리학적으로 모사할 수 있으며, 공동배양세포로부터 각종 신호물질의 생산 및 분비를 촉진시킬 수 있다. 반면 기질 세포 채널(500)에서 생산된 각종 신호물질과 제 2 배양액 채널(200) 내에 포함된 혈관형성인자 등의 각종 생화학물질들은 상기 복수의 미세구조물 사이의 갭을 통해 이동할 수 있기 때문에, 기질 세포 채널(500)과 제 2 배양액 채널(200) 사이에서 생화학물질의 활발한 상호작용이 이루어질 수 있다.
제 1 배양액 채널(100)과 제 2 배양액 채널(200)은 유체의 흐름을 허용하는 통로를 제공하며, 여기서 유체는 세포배양액, 각종 혈관형성인자 등을 포함할 수 있다. 제 2 배양액 채널(200)은 혈관 채널(300)의 일 측면과 기질 세포 채널(500) 사이에 위치하고, 제 1 배양액 채널(100)은 혈관 채널(300)의 타 측면과 인접하여 위치함으로써, 혈관 채널(300)과 기질 세포 채널(500)에 세포배양액, 혈관형성인자 등을 공급한다. 이를 통해 혈관형성세포와 공동배양세포의 장기간의 세포 배양을 가능케 함과 동시에, 혈관 채널(300)과 기질 세포 채널(500) 내의 두 세포군(혈관형성세포와 공동배양세포)이 근거리분비(paracrine)를 통해 상호작용할 수 있는 통로를 제공한다. 혈관형성세포와 공동배양세포 간의 근거리분비를 통한 상호작용은 혈관형성세포의 형태형성(morphogenesis)을 혈관 네트워크로 촉진하며, 형성된 혈관의 특이적 성질 발현 및 기능에도 중요한 영향을 미친다. 또한 제 2 배양액 채널(200)은 혈관형성세포와 공동배양세포를 물리적으로 분리시킴으로써 혈관형성세포와 공동배양세포를 독립적으로 관찰하고 분석하기 용이하게 하며, 특히 복수의 미세구조물의 갭으로 배양액 채널(100, 200)과 연통된 혈관의 내부로 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 신호를 주입할 수 있는 공간을 제공한다. 이로써 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 혈관 사이의 상호작용을 모사할 수 있으며, 다양한 자극에 대한 혈관의 반응을 관찰하고 이를 실시간으로 이미징 및 정량화할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 하나 이상의 채널에 독립적으로 혈관형성세포, 세포외기질, 세포배양액, 혈관형성인자 및 공동배양세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 순차적으로 또는 동시에 주입하여, 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는, 생체 외 혈관 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 혈관 생성은 신생혈관생성(angiogenesis) 과정 및/또는 맥관형성(vasculogenesis) 과정일 수 있다.
각 채널에 세포외기질, 세포, 세포배양액, 각종 혈관형성인자 등을 주입할 때에는 별도의 외부 실험기기를 필요로 하지 않으며, 간단히 피펫(pipette) 조작을 통해 주입할 수 있다. 또한 혈관형성세포와 공동배양세포는 세포외기질과 혼합해 주입할 수 있으나 실험의 목적에 따라 세포외기질만을 주입할 수도 있다.
각각의 채널에 주입된 세포외기질은 그 종류에 따라 온도의 상승, 화학적 작용, 빛의 조사 등에 의해 경화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법은 (a) 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 혈관 채널(300)에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계; (b) 기질 세포 채널(500)에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 (c) 제 1 배양액 채널(100), 제 2 배양액 채널(200), 또는 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)에 세포배양액, 혈관형성인자, 또는 세포배양액 및 혈관형성인자를 주입하여, 혈관 채널(300) 내에서 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함한다.
세포외기질 및 혈관형성세포를 혈관 채널(300)에 먼저 주입한 후, 기질 세포 채널(500)에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 세포외기질 등을 각 채널에 주입하는 순서는 혈관의 형성에 영향을 미치지 않는다. 따라서 각 채널에 세포외기질 등을 주입하는 순서는 실험자의 편의 및 실험의 특성에 따라 변경될 수 있다.
각각의 채널에 주입된 세포외기질은 그 종류에 따라 온도의 상승, 화학적 작용, 빛의 조사 등에 의해 경화된다. 경화 과정 이후에 세포배양액, 혈관형성인자, 또는 세포배양액 및 혈관형성인자를 제 1 배양액 채널(100), 제 2 배양액 채널(200), 또는 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)에 주입함으로써 혈관 채널(300)과 기질 세포 채널(500)에 영양 성분, 혈관형성인자 등을 공급하고, 각 채널 사이에 근거리분비를 유도함으로써 장기적인 세포의 배양과 혈관의 형성을 가능케 한다.
생성된 혈관 네트워크는 혈관 채널에서 세포외기질 내 함유된 혈관형성세포로부터 형성된다. 혈관은 미세구조물 사이의 갭으로 확장하여, 배양 채널(100, 200) 내 세포배양액과 유체간 상호작용하고 관류할 수 있는 혈관 내 공간을 형성할 수 있다. 혈관의 내부는 배양 채널(100, 200) 내 세포배양액과 직접적으로 연결되며, 혈관 내부의 공간은 관류할 수 있는 혈관 네트워크를 형성할 수 있다. 관류를 형성하는 혈관 네트워크의 혈관 형성의 개시 이후에는 특정한 실험 조작의 필요 없이 자발적인 세포군 사이의 상호작용을 통해 높은 재현성을 가지고 혈관이 형성되게 된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법은 (a) 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 혈관 채널(300)에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하여, 혈관 채널(300)과 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)이 접하는 면에 세포 부착을 위한 세포 부착면을 형성시키는 단계; (b) 제 1 배양액 채널(100), 제 2 배양액 채널(200), 또는 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)에 혈관형성세포를 주입하여, 세포 부착면에 혈관형성세포를 부착시키는 단계; 및 (c) 기질 세포 채널(500)에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 (d) 제 1 배양액 채널(100), 제 2 배양액 채널(200), 또는 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)에 세포배양액, 혈관형성인자, 또는 세포배양액 및 혈관형성인자를 주입하여, 혈관 채널(300) 내에서 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함한다.
혈관형성세포를 세포 부착면의 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포에 부착시키는 경우에, 세포배양액 내 함유된 혈관형성세포가 채널 내로 주입되고, 혈관 생성 장치를 예를 들어 10 내지 15 분 동안 90 도 정도 기울임으로써, 혈관형성세포가 의도한 위치에 부착되도록 할 수 있다.
배양 세포의 종류 및 실험의 목적에 따라, 혈관형성세포의 배양 및 형태 형성을 촉진하거나 조절하기 위하여 혈관형성인자 또는 세포 반응에 영향을 미치는 다른 인자를 세포외기질 또는 세포배양액과 함께 혼합할 수 있다. 신생혈관 스프라우트(angiogenic sprout)는 혈관형성세포가 부착된 혈관 형성 영역으로부터 성장하여 관류할 수 있는 혈관을 형성한다.
혈관형성세포의 신생혈관생성을 유도하는 혈관형성인자의 방향성있는 농도 구배를 제공하기 위하여, 혈관형성세포를 부착하는 위치, 공동배양세포의 주입, 및 배양액 채널(100, 200)로의 혈관형성인자의 유입은 실험 목적에 맞게 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 혈관형성세포란 혈관형성인자, 세포배양액에 포함된 혈관형성유도물질, 공동배양세포 등과의 상호작용에 의해 혈관을 형성하는 세포를 의미한다. 이들 혈관형성세포는 맥관형성 및/또는 신생혈관생성을 통해 혈관을 형성할 수 있다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에서, 혈관형성세포는 특별히 제한되지 않고 실험의 목적에 따라 적절하게 선택될 수 있으나, 바람직하게는 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 암세포(cancer cell), 줄기세포(stem cell), 줄기세포 유래세포(stem cell-derived cell) 및 혈관전구세포(endothelial progenitor cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있다. 예를 들어, 인간제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC), 인간미세혈관내피세포(human microvascular endothelial cell), 인간뇌미세혈관내피세포(human brain microvascular endothelial cell), 인간림프내피세포(human lymphatic endothelial cell) 등 다양한 신체 부위 유래의 혈관내피세포가 사용될 수 있다. 또한, 암의 성장과 전이 기전 등을 연구하기 위해 암세포가 이용될 수도 있다. 배양 세포는 인간 이외의 다양한 종, 예를 들어 돼지(porcine), 쥐(murine), 소(bovine)에서 유래된 혈관내피세포를 사용할 수도 있다.
또한, 상기 혈관형성세포는 유전변이된 세포(mutated cell), 형질감염된 세포(transfected cell), 또는 유전변이 및 형질감염된 세포일 수 있다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에서, 세포외기질은 특별히 제한되지 않으나, 콜라겐 겔(collagen gel), 피브린 겔(fibrin gel), 마트리 겔(Matrigel), 자가조립 펩티드 겔(self-assembled peptide gel), 폴리에틸렌글리콜 겔(polyethylene glycol gel) 및 알지네이트 겔(alginate gel)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 공동배양세포는 혈관형성세포와의 상호작용을 통해 혈관 형성 유도물질 등 혈관 형성에 필요한 생화학물질을 분비하는 세포일 수 있다. 본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에서, 공동배양세포는 특별히 제한되지 않으나, 성상세포(astrocyte), 아교세포(glial cell), 중피세포(mesothelial cell), 섬유아세포(fibroblast), 평활근세포(smooth muscle cell), 암세포, 주피세포(pericyte), 신경교세포(neuroglial cell), 줄기세포, 줄기세포 유래세포 및 혈관 내피와 상호작용하는 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있다. 예를 들어, 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관인 경우 공동배양세포는 성상세포, 아교세포, 주피세포 또는 섬유아세포인 것이 바람직하고, 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관 이외의 혈관인 경우에는 섬유아세포 또는 평활근세포인 것이 바람직하다. 또한 암과 신생혈관생성과의 관련성 등을 연구하기 위하여 암세포를 공동배양세포로 사용할 수도 있다. 배양되는 세포의 종류와 조합, 그리고 배양 방식은 실험의 목적에 맞게 선택될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 내피 스프라우트 유도자(endothelial sprout inducer)로서 폐 섬유아세포(lung fibroblast, LF) 및 U87MG를 사용하였다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에서, 공동배양세포는 유전변이된 세포, 형질감염된 세포, 또는 유전변이 및 형질감염된 세포일 수 있다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에서, 혈관 형성 및 기능의 효과와 효능을 정량 측정하거나 신생혈관생성을 촉진 또는 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적으로, 세포외기질 또는 세포배양액은 약물, 가용성 인자, 불용성 인자, 생체분자, 단백질, 나노소재 및 siRNA(small interfering RNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에서, 혈관형성인자는 특별히 제한되지 않으나, 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF) 등 일 수 있다.
한편, 기존의 혈관 구조 모델은 혈관 내피세포를 박막 위에 붙여 배양하여 2차원적 혈관 벽을 만드는 방식으로 제조된다. 그러나, 이와 같은 혈관 구조 모델은 혈관벽의 구조적인 특징만 일부 모사하고 있을 뿐, 실제 혈관구조가 체내에서 만들어지는 과정인 신생혈관생성을 통하여 제조한 구조가 아니므로, 혈관 내피세포 고유의 특징을 일부 상실한 상태의 모델이 됨은 불가피하다. 이와 같이 고유의 특징을 일부 상실한 체외 모델을 이용하여 약물 스크리닝 등에 적용하였을 경우, 실제 체내에서의 혈관의 반응을 예측함에 실패할 확률이 높아지며, 이는 약물 개발 과정의 시간적, 금전적 손실을 초래하게 될 것이다.
이에, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 생체 외 혈관 생성 방법에 의하여 생성된 혈관 내에 형광 마커를 주입하거나, 또는 생성된 혈관의 내피 양단간의 전기 저항(TEER) 수치를 측정하여 혈관의 투과성(vascular permeability)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 혈관 네트워크의 투과성을 조절하는 경우, 혈관의 투과성은 형광 마커와 같은 물질을 유입하고 혈관벽을 통하여 확산된 형광의 강도(intensity)를 정량하여 측정할 수 있고, 또는 혈관의 내부에 전극을 삽입하고 혈관의 외부에 다른 전극을 삽입하여, 혈관벽 간의 TEER 수치를 정량하여 측정할 수도 있다.
본 발명의 실시예에서는 배양액 채널(100, 200)까지 완전히 개방된 미세 혈관을 제작하여, 혈관 루멘 영역에 FITC-덱스트란을 도입하여 성공적으로 혈관의 투과성을 측정할 수 있었다.
본 발명의 혈관 투과성 측정 방법에 따를 경우, 본 발명의 혈관 생성 방법에 따라 생성된 혈관은 랜덤한 네트워크를 형성하지 않고 매우 정돈되고 조직화되어(organized) 있기 때문에, 관심 영역(region of interest, ROI)은 항상 고정되어 있어 실험 과정을 단순화할 수 있다. 또한, 본 발명의 혈관 생성 방법에 따라 생성된 혈관은 미세구조물 사이의 마이크로 갭을 완전히 커버할 수 있어서, FITC-덱스트란과 같은 형광 분자가 혈관 벽을 통하지 않고 바로 혈관주변 영역(perivascular region)으로 침투하여 측정 값의 정확성을 떨어뜨리는 것을 방지할 수 있다.
혈관의 과투과성은 혈장 단백질(plasma protein)이 혈관주변 영역으로 흘러나오게 하여 암 콜로니를 향한 내피 세포 이동의 임시 매트릭스(provisional matrix)를 만들게 되므로, 암 신생혈관생성의 진행의 한 인자로 알려져 있다. 따라서, 항-VEGF를 이용한 혈관 정상화가 암 신생혈관생성을 막는 하나의 주요한 타겟이 되어 왔다. 본 발명의 실시예에서는 U87MG 암 세포를 이용하여 암 혈관의 과투과성을 성공적으로 모델링하였다. 또한, 베바시주맙(Avastin) 처리를 통해, 암 혈관의 투과성을 정상 혈관 조건의 수준으로 감소시킬 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명의 생체 외 혈관 생성 장치에 의해 생성된 혈관은 생체 내 혈관의 기본 특징을 갖추고 있으므로, 본 발명의 혈관 생성 방법 및 혈관 투과성 측정 방법을 사용하여 생체 내 혈관의 실제 반응을 정확히 예측하는 것이 가능하다.
본 발명은 약물 반응 시험, 혈관의 세포형태신호변환(mechanotransduction) 등과 같은 다양한 응용 분야에 활용이 가능할 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
분석 장비
채널 내 유체 거동의 컴퓨터 시뮬레이션은 COMSOL 사의 Multiphysics로 수행하였다.
DIC(differential interference contrast) 이미지를 위해 Motic 사의 AE31 현미경을 사용하였다. 면역 염색된 샘플의 3차원 z-스태킹(stacking)을 위해 Olympus 사의 공초점 현미경(FV1000)을 사용하였다. 공초점 현미경의 이미지를 Bitplane 사의 IMARIS로 분석하였다. 형광 라이브 이미징을 위해, FITC-덱스트란 도입된 샘플을 CoolLED 형광 광원이 장착된 Olympus 사의 IX81 인버티드 현미경으로 이미징하였다. 타임랩스(time-lapse) 및 다-단계 이미징(multi-stage imaging)을 위해 상기 현미경 및 CCD 카메라를 MetaMorph로 제어하였다.
세포의 배양
Lonza 사의 폐 섬유아세포(LF)를 Lonza 사의 FGM(Fibroblast Growth Medium)-2 배지에서 배양하고, 계대 5 내지 7을 사용하였다. Lonza 사의 인간제대정맥내피세포(HUVEC)를 Lonza 사의 EGM(Endothelial Growth Medium)-2 배지에서 배양하고, 계대 5 내지 6을 사용하였다. 서울대학교 백선하 박사로부터 기증받은 인간다형성교아종세포(Human glioblastoma multiforme cell) U87MG를 10% FBS, 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(100 U/ml)으로 보충한 DMEM(Hyclone 사 제조)에서 배양하였다. 모든 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 가습한 인큐베이터에 보관하였다.
혈관 생성 장치의 제작
50 ㎛ 높이의 마스터몰드(master mold)를 생성하기 위하여, 실리콘 웨이퍼를 MicroChem 사의 SU-8로 코팅하였다. SU-8 내 용매를 증발시키기 위하여, 스핀 코팅된 마스터를 65℃에서 프리베이크(pre-bake)한 다음 95℃에서 프리베이크하였다. 도 1 내지 도 3에 도시된 마이크로 패턴을 생성하기 위하여, 프리베이크된 웨이퍼를 투명 마스크로 덮힌 UV 광에 노출시켰다. 그 후 현상 과정 후에 웨이퍼를 95℃로 베이크(bake)하였다. 웨이퍼를 PDMS로 채우고 90℃로 경화한 다음, 세포 주입 포트 및 배양액 저장소(110, 210)를 위해 원통형 6 mm 생검 펀치(biopsy punch) 및 뾰족한 18 게이지 블런트(gauge blunt) 피하주사침(hypodermic needle)으로 펀치 아웃(punch out)하였다. PDMS 및 커버 글래스 슬립을 플라즈마 처리한 다음 비가역적으로 결합하였다. 마이크로채널 내 유체 누출을 최소화하기 위해, 결합된 혈관 생성 장치를 48 시간 동안 80℃의 건조한 오븐에 보관하였다. 살균을 위해 장치를 2 분 동안 UV 처리하였다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이, 제작된 칩은 공 채널(400)이 포함되는 경우 5 개의 채널로 이루어질 수 있다. 미세혈관이 자라는 중앙 하부의 혈관 채널(300), 세포에 배양액을 공급하는 제 1 배양액 채널(100)과 제 2 배양액 채널(200)이고, 폐 섬유아세포 또는 U87MG 증식을 위한 기질 세포 채널(500), 및 피브린 용액이 혈관 채널(300)에만 충전되도록 돕는 중앙 상부의 공 채널(400)이 형성되었다.
혈관 채널(300)에는, 두 가지 목적을 위해 PDMS 등으로 제조된 복수의 격벽 구조(600)가 있다. 우선, 격벽 구조(600)는 HUVEC의 스프라우팅 방향을 안내한다. 이러한 구조에 따라 투과성 측정이 용이하도록 HUVEC 스프라우트가 곧게 형성되도록 유도된다. 또한, 이러한 격벽 구조(600)는 인접한 미세혈관 사이의 FITC 확산을 분리할 수 있다. 미세혈관 사이가 분리되어 있지 않다면, 인접한 미세혈관에서 유입된 FITC 확산이 투과성 데이터의 신뢰성을 떨어뜨릴 수 있다.
혈관 채널(300) 내 겔 충전 과정의 컴퓨터 시뮬레이션 이미지를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 피브리노겐 용액은 각각의 미세혈관에 대해 임시적인 매트릭스(matrix)를 형성하면서, 혈관 채널(300)과 배양액 채널(100, 200) 사이의 각각의 갭까지 혈관 채널(300)을 적절히 채우게 된다. 소수성 표면이 유체가 인접 채널을 침범하는 것을 방지한다.
기질 세포 채널(500) 및 혈관 채널(300)은 배양액 보충 뿐만 아니라 HUVEC과 LF 또는 U87MG 사이의 근거리 상호작용을 유도하기 위해 제 2 배양액 채널(200)로 연결되어 있다. 갭 크기는 혈관 채널(300)에서 70 ㎛로, 기질 세포 채널(500)에서 80 ㎛로 설정되었다. 혈관 채널(300)의 폭은 550 ㎛로 설정되었다.
혈관 생성
조직 배양 디쉬로부터 채취하고 트롬빈(0.5 U/ml)과 혼합된 소 피브리노겐 용액(bovine fibrinogen solution)(0.15 U/ml 아프로티닌이 포함된 2.5 mg/ml 피브리노겐)에서 재현탁시킨 기질 세포를 기질 세포 채널 유입구(510)에 주입하였다. 기질 세포로는 2 종류의 세포를 사용하였는데, 하나는 정상 조건에서의 미세혈관 제작을 위한 LF이고, 다른 하나는 종양 혈관 제작을 위한 U87MG이었다. 이들 기질 세포는 성장 인자 및 세포외기질(ECM)의 분비에 의해 HUVEC의 신생혈관생성을 유도하였다.
트롬빈(0.5 U/ml)과 혼합된 피브리노겐 용액(0.15 U/ml 아프로티닌이 포함된 2.5 mg/ml 피브리노겐)을 혈관 채널 유입구(310)에 주입하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 피브린 겔이 도 4의 컴퓨터 시뮬레이션과 유사한 형태로 혈관 채널(300) 내로 패턴화되었다. 도 5의 (b)에 나타낸 바와 같이, 주입된 피브리노겐 용액이 혈관 채널(300)을 채웠다. 상기 용액은 공 채널(400)에 침범하지 않으면서, 공 채널(400)과 혈관 채널(300) 사이의 2 개의 마이크로포스트까지 채워졌다. 피브린 중합을 위해 2 분 동안 인큐베이트한 후에, 제 1 배양액 채널(100) 및 제 2 배양액 채널(200)을 채우기 위해 EGM-2 배양액을 흡인(aspiration)으로 배양액 저장소(110, 210)에 채웠다. 하루 동안 인큐베이트한 후에, 세포 배양 디쉬로부터 HUVEC을 채취하고 10 million/ml 세포 농도로 EGM-2 배양액에 재현탁시켰다. 배양액 저장소(110, 210)에서 배양액을 제거한 후에, 장치를 90 도 기울이고 EGM-2 배양액을 함유하는 HUVEC 4.5 ㎕를 제 1 배양액 채널(100)에 주입하였다. HUVEC이 혈관 채널(300) 내 피브린 겔 벽에 부착되도록 장치를 40 분 동안 인큐베이트하였다(도 5의 (c)). 피브린 벽에 HUVEC 부착 후에, 장치의 배양액 저장소(110, 210)를 EGM-2 배양액으로 채웠다. 완전 루멘화된 미세혈관 배열(fully lumenized microvessel array)을 제작하기 위하여 장치를 6 내지 7 일 동안 인큐베이트하였으며, 배양액은 5 일 후에 한번 교환하였다.
0 일째, HUVEC은 피브린 겔 벽에 부착되어 있었다(도 5의 (c)). 세포 시딩(seeding) 2 일 후, HUVEC은 기질 세포 채널에서의 LF 또는 U87MG의 분비에 의해 유도된 스프라우트(sprout)를 만들기 시작하였다(도 6 및 도 7). 도 6의 좌측 현미경 사진에 나타난 바와 같이, 2 일째 기질 세포 채널(500)에서의 LF의 분비에 의해 개시되어, 피브린 겔 벽에서 단층으로부터 HUVEC이 많은 스프라우트를 만들기 시작하였다. 4 일째, HUVEC 스프라우트는 혈관 채널(300)의 끝에 도달하기 시작하였다. 도 6의 중앙 현미경 사진에 나타난 바와 같이, 4 일째 스프라우트 팁(tip)이 혈관 채널(300)의 맞은편 끝에 도달하기 시작하였다. 이 시점에서는 루멘 형성이 완료되지는 않았고 루멘 영역의 접근성은 낮았다. 비록 처음에 스프라우트의 수는 많았지만 스프라우트가 서로 융합하기 시작하였다. 6 일째, 스프라우트가 혈관의 끝에 완전히 도달했을 뿐만 아니라, 루멘 속으로 다른 종류의 용액의 접근이 충분히 가능할 정도로 완전히 루멘화되어 배양액 채널(100, 200) 양 측에 개방되었다. 이 시점에서는 0 일째 HUVEC 단층에 의해 형성된 스프라우트는 서로 융합되어, 좌측 및 우측의 배양액 채널(100, 200)을 연결하면서 혈관 채널(300)의 각각의 갭에서 하나의 완전히 루멘화된 미세혈관을 만들었다. 도 6의 우측 현미경 사진에 나타난 바와 같이, 스프라우트는 융합되어 하나의 미세 혈관 및 몇 개의 분지(branch)를 만들었다. 도 7에 나타난 바와 같이, U87MG에 의해 유도된 HUVEC 스프라우트의 성장은 처음에는 LF에 의해 유도된 HUVEC 스프라우트에 비해 늦었지만, 6 일째에는 혈관 채널(300)의 맞은편 끝에 도달하여 완전히 루멘화되었다.
면역 염색
샘플을 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)(Hyclone사 제조)로 2 회 세척한 후, 이들을 15 분 동안 PBS 내 4% (w/v) 파라포름알데히드에 의해 고정한 다음, 15 분 동안 PBS 용액 내 0.15% Triton X-100(Sigma사 제조)을 이용하여 투과성으로 만들었다. 1 시간 동안 PBS 내 3% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma사 제조) 및 Hoechst 33342 (1:1000)으로 처리한 후에, 밀착 연접(tight junction)을 검출하기 위해 세포를 ZO-1 단백질(Molecular Probes사 제조)에 대한 마우스 모노클로날 항체로 컨쥬게이트된 Alexa fluor®로 염색하고, 실온에서 밤새 인큐베이트하였다.
6 일째에 형광 마커로 ZO-1에 대해 미세 혈관의 면역 염색을 수행하고, 이의 탄탄한 연접 단백질 발현 및 생체공학적 미세 혈관의 3차원 구조를 증명하기 위해 공초점 현미경으로 미세 혈관을 3D 스택(stack)하였다. 도 8은 미세 혈관이 길다란 형태의 밀착 연접 단백질 ZO-1을 발현하고 있음을 보여주며, 이는 미세 혈관에서 적절한 연접의 발현을 확인한 것이다.
혈관 루멘을 시각화하기 위하여 공초점 이미지를 수평 및 수직 방향으로 횡단면화하였다. 도 8의 스택 횡단면 이미지에 나타낸 바와 같이, 미세 혈관의 전체 영역이 루멘 속으로 다른 종류의 용액의 접근이 충분히 가능할 정도로 충분히 루멘화되어 배양액 채널(100, 200) 양 측에 개방되었음을 3차원적으로 확인할 수 있었다.
TNF -α 처리
종양괴사인자(Tumor necrosis factor, TNF)-α는 혈관 누출을 증가시키는 염증 유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)으로 알려져 있고, 내피 단층의 투과성을 증가키는 것으로 알려져 있다. 이에, 생성된 미세 혈관이 장벽 기능에 영향을 주는 외인성 인자에 반응성임을 관찰하기 위하여, 24 시간 동안 미세 혈관에 2 가지 단위 용량(20 ng/ml 및 40 ng/ml)의 재조합 인간 TNF-α(PeproTech 사 제조)를 처리하였다. TNF-α 용액을 조절된 농도, 20 ng/ml 또는 40 ng/ml로 EGM-2 배양액으로 희석시켰다. 투과성 이미징은 처리 24 시간 후에 수행하였다.
처리 후, 미세 혈관의 투과성을 측정하고 70 kDa FITC-덱스트란을 이용하여 계산하였다. 도 10의 c에 나타낸 바와 같이, 미세 혈관의 투과 계수는 TNF-α에 용량-의존적임을 관찰할 수 있었다.
광표백( photobleaching ) 시험
광표백에 의한 강도 저하율(rate of intensity degradation)을 측정하기 위하여, FITC-덱스트란 용액을 80 ㎛ 높이의 마이크로채널에 주입하고 형광 현미경으로 라이브 이미징하였다. 투과성 이미징에 사용하기 위해 동일한 조건으로 3 가지 종류의 FITC-덱스트란(4 kDa, 20 kDa, 70 kDa)을 시험하였다. FITC-덱스트란 강도의 광표백을 점검하기 위하여, LED를 계속 켜두고 3 초 마다 강도를 점검하였다. 2 분째에서의 강도 저하는 초기 강도의 6 % 보다 더 작았다. 투과성 평가를 위해, 샘플이 노출(exposure)을 필요로 할 때에만 형광 현미경이 켜지는 조건을 설정하였다. 데이터가 일정한 LED 노출의 2 분째에서만 FITC-덱스트란의 6 % 보다 더 적게 저하되었음을 보여주어, 광표백 효과는 투과성 측정에 무시할만하다고 결론을 내렸다.
투과 계수 계산
생체공학적 미세 혈관의 투과 계수를 계산하기 위하여 형광 현미경을 이용하여 FITC-덱스트란을 이미징하였다. 배양액 저장소(110, 210) 내 모든 배양액을 제거한 후에, 20 ㎕의 20 kDa FITC-덱스트란 용액을 배양액 저장소(110, 210) 내에 도입하였다. 미세 혈관이 이의 루멘 내로 용액을 허용하기에 충분히 루멘화되면, 정수압력(hydrostatic pressure)에 의해 FITC-덱스트란 분자를 미세 혈관 루멘 내로 도입하였다. 투과 계수 P는 하기와 같이 계산하였다.
Figure 112013030347397-pat00001
식 중, V 는 미세 혈관의 총 부피이고, S 는 형광 분자가 혈관주변 영역에 들어가기 위해 통과해야 하는 총 표면적이다. I O 는 FITC의 혈관내 강도이고, dl / dt 는 혈관주변 영역의 시간 경과에 따른 총 형광 강도 변화이다.
Metamorph 내 다-단계 타임랩스 모드를 이용하여 미세 유체 칩 상의 모든 미세 혈관을 동시에 이미징하였다. FITC-덱스트란 도입된 칩을 총 45 내지 120 초에 대해 15 초 마다 이미징하였다.
미세 혈관의 투과성 측정을 6 일째 수행하였고, 도 9에 나타난 바와 같이, 혈관주변 영역 내 FITC-덱스트란의 형광 강도가 시간에 따라 증가함을 볼 수 있었다. 혈관주변 영역에서의 FITC-덱스트란의 강도 변화를 측정함으로써 투과 계수를 계산할 수 있었다. 12 개의 칩을 시험한 결과, 칩 당 약 3 개의 미세 혈관이 완전히 루멘화되어 배양액 채널의 양 끝에 개방되었음을 확인하였고, 이를 투과성 평가에 사용할 수 있었다.
분자량의 작용에 따라 내피 장벽(endothelial barrier)을 통한 상이한 누출을 측정하기 위하여, 3 개의 상이한 분자량의 FITC-덱스트란(4 kDa, 20 kDa, 70 kDa)을 사용하였다. 도 10의 b에 나타난 바와 같이, FITC-덱스트란의 누출율은 이들의 분자량에 강하게 의존함을 관찰할 수 있었다. 계산된 투과 계수의 값은 70 kDa FITC-덱스트란에 대해 2×10-6 cm/s로 단리된 포유동물의 세정맥에 대해 측정한 값과 상당히 가까웠다. 또한, 본 실시예에서 계산된 투과 계수는 기존의 생체 외 혈관 모델에서 측정된 투과 계수 값 보다 2 내지 3 배 정도 더 낮은 값으로 생체 내 측정 값에 훨씬 근접함을 확인하였다. 이러한 결과는 혈관 투과성을 측정하기 위한 이전의 혈관 모델에 비해 본 발명의 혈관 생성 장치가 생체 내 조건과 더욱 유사한 조건을 제공한다는 점을 뒷받침하는 것이다.
항- VEGF 정상화
VEGF 불활성을 유도하기 위하여, 인간 VEGF를 특이적으로 정상화시키는 항체인 베바시주맙(Avastin, Genentech사 제조)을 이용하였다. 베바시주맙은 서울대학교의 김정훈 박사로부터 기증받은 것이다. 베바시주맙을 EGM-2로 2.5 mg/ml로 희석하고 처리를 위해 미세 유체 칩 내의 배양액 저장소(110, 210)에 도입하였다. 대조 실험을 위하여 베바시주맙 용액 대신에 동일한 부피의 PBS를 첨가하였다. 베바시주맙은 6 일째부터 24 시간 동안 처리하였다.
미세 혈관의 투과성 시험을 1) LF로 유도된 미세 혈관; 2) 베바시주맙 처리를 한 LF로 유도된 미세 혈관; 3) U87MG로 유도된 미세 혈관; 및 4) 베바시주맙 처리를 한 U87MG로 유도된 미세 혈관의 4 가지 상이한 조건에 대해 수행하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, U87MG로 유도된 미세 혈관이 LF로 유도된 미세 혈관 보다 더 투과성이 높음을 알 수 있었다. 베바시주맙을 처리한 후, LF에 의해 유도된 미세 혈관은 투과 계수의 감소가 크지 않았는데, 이는 LF에 의해 발현된 VEGF의 양이 미세 혈관의 과투과성을 유도할 만큼 과량이 아니었음을 보여준다. 하지만, U87MG에 의해 유도된 미세 혈관은 상당한 감소를 나타냈는데, 이 값은 베바시주맙으로 처리한 LF-유도된 미세 혈관의 투과 계수와 유사하였다. 이러한 데이터로, U87MG의 과잉의 VEGF 발현에 의해 유도된 미세 혈관의 과투과성은 본 발명의 미세 유체 칩 내 베바시주맙 처리에 의해 정상화될 수 있으며, 이는 생체 내 종양 혈관의 특징을 그대로 반영하고 있는 것이다. 또한, 이는 암 세포가 다른 세포 보다 더 많은 양의 VEGF를 발현하고, 암 부위에서의 모세혈관이 정상 조직의 모세혈관 보다 더 높은 투과성을 나타내며, 이는 항-VEGF의 처리로 정상화될 수 있다는 기존의 연구와도 합치된다.
100 : 제 1 배양액 채널 110 : 제 1 배양액 저장소
200 : 제 2 배양액 채널 210 : 제 2 배양액 저장소
300 : 혈관 채널 310 : 혈관 채널 유입구
400 : 공 채널 500 : 기질 세포 채널
510 : 기질 세포 채널 유입구 520 : 기질 세포 채널 유출구
600 : 격벽 구조 610 : 제 1 격벽
620 : 제 2 격벽 630 : 제 3 격벽
631 : 절곡부 640 : 돌출부

Claims (16)

  1. 제 1 배양액 저장소와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 제 1 배양액 채널;
    제 2 배양액 저장소와 유체간 상호작용하고, 제 1 배양액 채널과 병렬로 배치된 제 2 배양액 채널;
    혈관 채널 유입구와 유체간 상호작용하고, 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널 사이에서 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널의 일측면과 접하는 혈관 채널; 및
    기질 세포 채널 유입구와 유체간 상호작용하고, 제 2 배양액 채널의 타측면과 접하고, 제 2 배양액 채널과 병렬로 배치된 기질 세포 채널을 포함하고,
    혈관 채널에는 돌출된 2 개 이상의 격벽 구조가 형성되어 있고,
    각각의 격벽 구조는 제 1 배양액 채널과 병렬로 배치된 제 1 격벽, 제 1 격벽에서 제 2 배양액 채널 방향으로 연장 형성된 제 2 격벽, 제 2 격벽에서 연장 형성되고 제 1 격벽과 병렬로 배치된 제 3 격벽, 및 제 1 격벽, 제 2 격벽 및 제 3 격벽이 둘러싼 공간에 형성된 1 개 이상의 돌출부를 포함하고,
    각 채널이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학 물질들간 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 갭(gap)을 두고 배열된, 생체 외 혈관 생성 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널 사이에서 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널의 일측면과 접하고, 혈관 채널과 연결되어 배치된 공 채널을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    혈관 채널 내 격벽 구조가 1 내지 15 개 존재하고, 격벽 구조 당 1 개의 돌출부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    제 3 격벽이 제 1 격벽, 제 2 격벽 및 제 3 격벽이 둘러싼 공간 방향의 절곡부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 장치.
  5. 제 2 항에 있어서,
    혈관 채널과 공 채널의 경계에 2 개의 미세구조물이 배열된 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 장치.
  6. 제 1 항에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 하나 이상의 채널에 독립적으로 혈관형성세포, 세포외기질, 세포배양액, 혈관형성인자 및 공동배양세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 순차적으로 또는 동시에 주입하여, 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  7. (a) 제 1 항에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 혈관 채널에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계;
    (b) 기질 세포 채널에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및
    (c) 제 1 배양액 채널, 제 2 배양액 채널, 또는 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널에 세포배양액, 혈관형성인자, 또는 세포배양액 및 혈관형성인자를 주입하여, 혈관 채널 내에서 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  8. (a) 제 1 항에 따른 생체 외 혈관 생성 장치의 혈관 채널에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하여, 혈관 채널과 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널이 접하는 면에 세포 부착을 위한 세포 부착면을 형성시키는 단계;
    (b) 제 1 배양액 채널, 제 2 배양액 채널, 또는 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널에 혈관형성세포를 주입하여, 세포 부착면에 혈관형성세포를 부착시키는 단계; 및
    (c) 기질 세포 채널에 세포외기질 또는 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및
    (d) 제 1 배양액 채널, 제 2 배양액 채널, 또는 제 1 배양액 채널 및 제 2 배양액 채널에 세포배양액, 혈관형성인자, 또는 세포배양액 및 혈관형성인자를 주입하여, 혈관 채널 내에서 혈관형성세포를 배양하고 혈관 생성을 유도하는 단계를 포함하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈관형성세포가 내피세포, 상피세포, 암세포, 줄기세포, 줄기세포 유래세포 및 혈관전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    혈관형성세포가 유전변이된 세포, 형질감염된 세포, 또는 유전변이 및 형질감염된 세포인 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  11. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외기질이 콜라겐 겔, 피브린 겔, 마트리 겔, 자가조립 펩티드 겔, 폴리에틸렌글리콜 겔 및 알지네이트 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  12. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공동배양세포가 성상세포, 아교세포, 중피세포, 섬유아세포, 평활근세포, 암세포, 주피세포, 신경교세포, 줄기세포, 줄기세포 유래세포 및 혈관 내피와 상호작용하는 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    공동배양세포가 유전변이된 세포, 형질감염된 세포, 또는 유전변이 및 형질감염된 세포인 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  14. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포외기질 또는 세포배양액이 약물, 가용성 인자, 불용성 인자, 생체분자, 단백질, 나노소재 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 외 혈관 생성 방법.
  15. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 생성된 혈관 내에 형광 마커를 주입하여 혈관의 투과성을 측정하는 방법.
  16. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 생성된 혈관의 내피 양단간의 전기 저항(transendothelial electrical resistance, TEER) 수치를 측정하여 혈관의 투과성을 측정하는 방법.




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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160110740A (ko) * 2015-03-11 2016-09-22 서강대학교산학협력단 하이드로젤 기반의 세포 공동-배양용 미세유체칩
KR101709315B1 (ko) * 2015-08-24 2017-02-23 주식회사 에스피엘 구배형 채널을 갖는 세포 배양 용기
WO2017039043A1 (ko) * 2015-09-04 2017-03-09 서울대학교 산학협력단 체외 피부면역계 모사 시스템
KR20180069882A (ko) * 2015-10-19 2018-06-25 에뮬레이트, 인크. 혈액 뇌 장벽의 미세유체 모델
KR102157266B1 (ko) 2019-11-22 2020-09-18 차의과학대학교 산학협력단 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도
WO2021034107A1 (ko) * 2019-08-22 2021-02-25 차의과학대학교 산학협력단 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
WO2021216848A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microfluidic chips and microphysiological systems using the same
CN114214194A (zh) * 2021-12-14 2022-03-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种微流控芯片及其在构建三维仿生神经血管单元模型中的应用
CN114480122A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 中国人民解放军海军军医大学 一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110244567A1 (en) 2006-08-31 2011-10-06 Snu R&Db Foundation Device and Method of 3-Dimensionally Generating IN VITRO Blood Vessels
KR20120013012A (ko) * 2010-08-04 2012-02-14 공주대학교 산학협력단 신경세포로부터 공간적인 축색 돌기 분리 및 방향성을 갖는 시냅스 형성방법
KR20120118444A (ko) * 2011-04-18 2012-10-26 서울대학교산학협력단 생체 외 혈관 생성 장치

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110244567A1 (en) 2006-08-31 2011-10-06 Snu R&Db Foundation Device and Method of 3-Dimensionally Generating IN VITRO Blood Vessels
KR20120013012A (ko) * 2010-08-04 2012-02-14 공주대학교 산학협력단 신경세포로부터 공간적인 축색 돌기 분리 및 방향성을 갖는 시냅스 형성방법
KR20120118444A (ko) * 2011-04-18 2012-10-26 서울대학교산학협력단 생체 외 혈관 생성 장치

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bita Carrion, et al. Recreating the Perivascular Niche Ex Vivo Using a Microfluidic Approach. Biothechnology and Bioengineering. Vol. 107, No. 6, pp. 1020-1028. (2010. 07. 29.) *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160110740A (ko) * 2015-03-11 2016-09-22 서강대학교산학협력단 하이드로젤 기반의 세포 공동-배양용 미세유체칩
KR101709312B1 (ko) 2015-03-11 2017-02-23 서강대학교산학협력단 하이드로젤 기반의 세포 공동-배양용 미세유체칩
KR101709315B1 (ko) * 2015-08-24 2017-02-23 주식회사 에스피엘 구배형 채널을 갖는 세포 배양 용기
WO2017039043A1 (ko) * 2015-09-04 2017-03-09 서울대학교 산학협력단 체외 피부면역계 모사 시스템
KR20180069882A (ko) * 2015-10-19 2018-06-25 에뮬레이트, 인크. 혈액 뇌 장벽의 미세유체 모델
KR102410389B1 (ko) 2015-10-19 2022-06-16 에뮬레이트, 인크. 혈액 뇌 장벽의 미세유체 모델
WO2021034107A1 (ko) * 2019-08-22 2021-02-25 차의과학대학교 산학협력단 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
KR20210024342A (ko) 2019-08-22 2021-03-05 차의과학대학교 산학협력단 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
KR102281857B1 (ko) * 2019-08-22 2021-07-28 차의과학대학교 산학협력단 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
KR102157266B1 (ko) 2019-11-22 2020-09-18 차의과학대학교 산학협력단 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도
WO2021216848A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microfluidic chips and microphysiological systems using the same
CN114214194A (zh) * 2021-12-14 2022-03-22 中国科学院大连化学物理研究所 一种微流控芯片及其在构建三维仿生神经血管单元模型中的应用
CN114480122A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 中国人民解放军海军军医大学 一种基于微流控芯片的血脑屏障与脑胶质瘤共培养模型的建立方法及应用

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