WO2021034107A1 - 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩 - Google Patents

약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩 Download PDF

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cardiomyocyte
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최건호
김기석
이재혁
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/14—Coculture with; Conditioned medium produced by hepatocytes

Definitions

  • the present invention relates to an endomyocardial level biomimetic cardiac chip for testing cardiac efficacy and toxicity of drugs, and more specifically, the present invention is used for testing cardiac efficacy and toxicity of drugs and for supplying a culture medium to cardiomyocytes.
  • a cardiac chip that mimics a living body at the level of the endomyocardium including a culture solution supply unit and a cardiomyocyte supply unit including fixed cardiomyocytes, a method of evaluating the efficacy of a drug on cardiomyocytes using the cardiac chip, and using the cardiac chip
  • the present invention relates to a method for evaluating the toxicity of drugs on cardiomyocytes.
  • the heart is an important bodily organ that shares the beginning and end of life.
  • various diseases occur in the heart that moves without rest and sends blood, oxygen, and nutrients to every corner of the body.
  • the mortality rate from heart disease has increased by 41.6% over the last 10 years, and the ranking of causes of death for Koreans has also risen from 3rd to 2nd.
  • prior diseases such as high blood pressure, diabetes and obesity, it is predicted that heart disease will soon surpass cancer and rise to the number 1 cause of death.
  • various studies on heart disease are being conducted, but the incidence rate of heart disease and the resulting mortality rate are still increasing worldwide. Therefore, it is clear that it is time for more definitive and in-depth heart disease research.
  • organ on a chip As a technology that can more accurately evaluate drug efficacy and toxicity in vitro (in-vitro) by replacing animal experiments, organ on a chip (OCC) has recently attracted attention.
  • OOC organ on a chip
  • This technology mimics the internal microenvironment structure of a specific organ and can realize its functions and properties by culturing the cells that make up the organ. It is not simply culturing cells on a chip, but the movement and absorption of oxygen and nutrients. Focusing on the fact that the movement of the signal transmission material takes place within the unit of micrometers to several millimeters, it is a soft-lithography process developed from microfluidic technology and semiconductor microprocessing.
  • the human body recognizes all drugs as foreign substances and processes them through various chemical processes suitable for their elimination. Most of these processes are changed by metabolic action occurring in the liver. Drug metabolism in the liver has the effect of increasing the hydrophilicity of the drug or reducing the effectiveness of drug metabolites in order to promote drug excretion from the kidneys, but this is not always the case, and sometimes drug metabolites also show efficacy or In some cases, the drug has a stronger efficacy than the original drug, and the original drug does not show an effect, but in some cases, the drug metabolite does. Therefore, drug metabolism by the liver is an essential factor to be considered in drug efficacy and toxicity evaluation, but most organ biomimetic chips often overlook this pharmacokinetic system.
  • the present inventors have developed a heart chip including a culture solution supply unit for supplying a culture solution to cardiomyocytes and a cardiomyocyte supply unit including fixed cardiomyocytes.
  • a culture solution supply unit for supplying a culture solution to cardiomyocytes
  • a cardiomyocyte supply unit including fixed cardiomyocytes.
  • the main object of the present invention is to provide a cardiac chip imitating endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of a drug comprising a culture medium supply unit for supplying a culture medium to cardiomyocytes and a cardiomyocyte supply unit including fixed cardiomyocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy of a drug on cardiomyocytes using the cardiac chip that mimics the endomyocardium.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the toxicity of a drug on cardiomyocytes using the cardiac chip that mimics the endomyocardium.
  • an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided in the present invention can overcome inaccuracies due to differences between heterogeneous animal experiments in cardiac studies, and cardiomyocytes alone or cardiomyocytes It can be used as a platform for more accurate efficacy and toxicity evaluation of drugs under conditions similar to in vivo conditions by using together with hepatocytes, and for microenvironment studies in the heart and other organ-on-a-chips. Since it can be applied to research, etc., it can be used to develop a human-on-a-chip that can effectively analyze drug efficacy and toxicity.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a three-dimensional view of an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluation of efficacy and toxicity of a drug provided in the present invention and an overall schematic view including components within the chip.
  • Figure 2 is a three-dimensional view of a cardiac chip mimicking the endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided in the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view of an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating efficacy and toxicity of a drug provided by the present invention.
  • FIG. 4 is a partial enlarged view of the cardiomyocyte channel and the culture medium channel of the cardiac chip mimicking the endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided in the present invention.
  • FIG. 5 is a partial enlarged view of a micro-pillar structure and a micro-weir structure of a cardiac chip that mimics endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided by the present invention.
  • FIG. 6 is a partial enlarged photograph showing an actual photograph of an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluation of efficacy and toxicity of a drug provided in the present invention and a result of injecting food coloring into each channel inside the chip.
  • Figure 7a is a cardiomyocyte cultured for 7 days in a cardiac chip that mimics the endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided in the present invention, and after treatment with isoproterenol, a drug that changes the heart rate, of the cardiomyocytes.
  • This is a graph showing the result of analyzing the change in beat rate.
  • Figure 7b is a cardiomyocyte cultured for 7 days in a cardiac chip that mimics the myocardial endometrium for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided in the present invention, and after treatment with nifedipine, a drug that changes the heart rate, changes in the heart rate of the cardiomyocytes It is a graph showing the results of analysis.
  • FIG. 8 is a photograph and a partial enlarged photograph showing the result of co-culture of cardiomyocytes and hepatocellular carcinoma cells on a cardiac chip that mimics endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided by the present invention.
  • One embodiment of the present invention for achieving the object of the present invention described above is for the evaluation of efficacy and toxicity of a drug including a culture medium supply unit for supplying a culture medium to cardiomyocytes and a cardiomyocyte supply unit including fixed cardiomyocytes. Provides a mimic heart chip.
  • the cardiac chip mimicking endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of the drug provided in the present invention includes (a) a culture solution supply chamber; A culture medium recovery chamber; And, a culture medium supplying unit including; a culture medium channel in communication with each of the chambers; And (b) a cardiomyocyte inlet provided at one end; A residue outlet provided at the other end; And, provided between the cardiomyocyte inlet port and the residue outlet port, a fine weir structure is provided in the communication part with the residue outlet port, extends in the same direction as the culture solution channel, and is connected to a part of the culture solution channel, and the It consists of a cardiomyocyte supply unit including a; cardiomyocyte channel forming a mixing region in which the culture medium can interact with each other at the junction with the culture medium channel.
  • the material of the overall structure of the heart chip provided in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit or adversely affect the fixation and culture of cardiomyocytes, but as an example, polycaprolactone (PCL), poly It may be dimethylsiloxane (poly(dimethylsiloxane), PDMS), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polydioxanone (PDO), etc.
  • PCL polycaprolactone
  • PCL poly It may be dimethylsiloxane (poly(dimethylsiloxane), PDMS), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polydioxanone (PDO), etc.
  • PCL polycaprolactone
  • PDA polylactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PDO polydioxanone
  • It is optically transparent, durable, bio-friendly, and flexible, and can be PDMS, etc. that can easily analyze the heartbeat state of
  • a post-treatment process can be performed on the target.
  • a post-treatment process may be performed on the entire heart chip that has primarily formed a shape, or a post-treatment process may be performed limited to the cardiomyocyte channel and the culture medium channel, and the culture medium channel and the cardiomyocyte channel It is also possible to perform a post-treatment process limited to the adjacent mixing area.
  • the post-treatment process is not particularly limited thereto, but as an example, it may be performed by heat treatment at 70 to 90°C for 36 to 60 hours, and as another example, heating at 75 to 85°C for 44 to 52 hours It can be carried out by treatment, as another example, it can be carried out by heat treatment for 48 hours in an 80 °C oven.
  • the culture solution supply chamber included in the culture solution supply unit stores a culture solution for culturing cardiomyocytes to be supplied to the cardiomyocyte channel through a mixing region, and serves to supply the stored culture solution to the cardiomyocytes through the culture solution channel.
  • the culture solution supply chamber may be used as a culture vessel for culturing hepatocytes.
  • the culture solution recovery chamber included in the culture solution supply unit is a portion where the culture solution supplied from the culture solution supply chamber passes through the culture solution channel and is finally stored, and serves to recover the contaminated culture solution after culturing the cardiomyocytes. It is used for the purpose of preventing contamination of the surrounding environment due to the culture medium contaminated with various metabolites and waste products secreted from cardiomyocytes.
  • the culture medium channel included in the culture medium supply unit serves as a main flow path for the culture medium through which the culture medium flows from the culture medium supply chamber to the culture medium recovery chamber.
  • a part of the culture medium channel forms a mixing region, and the myocardium through the formed mixing region It supplies the culture medium to the cells, and plays the role of recovering the culture medium used for the cardiomyocyte culture.
  • the culture medium channel may be interpreted as a component that simulates capillaries for supplying nutrients to cardiomyocytes present in a living body.
  • the width of the culture medium channel is not particularly limited as long as it can simulate the function of capillaries, but as an example, it may have a width of 20 to 40 ⁇ m, and as another example, a width of 25 to 35 ⁇ m It may have, and as another example, may have a width of 30 ⁇ m.
  • the cardiomyocyte inlet included in the cardiomyocyte supply unit serves to introduce a cardiomyocyte mixture for supply to the cardiomyocyte channel.
  • a nozzle of a syringe can be connected to the cardiomyocyte inlet port loaded with the cardiomyocyte mixture. It can be configured to have a structure.
  • the cardiomyocyte mixture may include cardiomyocytes and auxiliary components that assist in circulation and fixation of the cardiomyocytes.
  • the cardiac chip of the present invention includes cardiomyocytes arranged in the cardiomyocyte channel contained therein and present in a fixed form, wherein cardiomyocytes are injected into the cardiomyocyte channel, and the injected cardiomyocyte is the cardiomyocyte channel.
  • an auxiliary component that assists it is required.
  • the auxiliary component mimics the extracellular matrix (ECM) existing in the microenvironment around the cardiomyocytes, and is essential for the three-dimensional cell culture of cardiomyocytes, and the structure and function of the cultured cardiomyocytes are maintained to be similar to those in the living body. You can play a role.
  • ECM extracellular matrix
  • the auxiliary component is not particularly limited as long as it can assist the inflow and fixation of cardiomyocytes, but as an example, a hydrogel may be used, and as another example, collagen hydrogel, alginate hydrogel, GelMa Hydrogel or the like can be used.
  • the hydrogel is mixed with cardiomyocytes, assists in three-dimensional culture of cardiomyocytes, and additionally imparts fluidity to the cardiomyocytes, thereby allowing the cardiomyocytes to move from the cardiomyocyte inlet to the cardiomyocyte channel.
  • the hydrogel can be cured under various conditions.
  • collagen hydrogel can be cured by inducing temperature increase by placing it in an incubator for 1 hour or longer, and alginate hydrogel replaces the medium in the culture medium channel. Then, CaCl 2 solution can be injected and cured, and gelma hydrogel can be cured by irradiating ultraviolet rays.
  • the cardiomyocytes contained in the cured hydrogel can be naturally fixed. Due to the inherent porosity of the hydrogel, the hydrogel The external culture medium can be delivered to the cardiomyocytes through the gel, thereby assisting the culture of the fixed cardiomyocytes.
  • the cardiomyocyte used in the present invention is not particularly limited as long as it is fixed inside the cardiomyocyte channel of the cardiac chip to simulate the function of the heart in vivo, but as an example, cardiomyocytes differentiated from stem cells are Can be.
  • the cardiomyocyte channel included in the cardiomyocyte supply unit can serve as a culture vessel for culturing the fixed cardiomyocytes as well as storing and fixing the cardiomyocyte mixture supplied through the cardiomyocyte inlet, as described above. have.
  • the cardiomyocyte channel can be interpreted as a component that simulates a microstructure called a myocardial fiber, which is the most basic unit in the heart, and an endomysium surrounding it.
  • the width of the cardiomyocyte channel is not particularly limited as long as it is possible to fix and cultivate cardiomyocytes, but as an example, it may have a width of 50 to 70 ⁇ m, and as another example, 55 to 65 It may have a width of ⁇ m, and as another example, it may have a width of 60 ⁇ m.
  • the cardiomyocyte channel may be in the form of a passage communicated between the cardiomyocyte inlet and the residue outlet, and a fine weir structure is provided inside the region communicating with the residue outlet, and such a fine weir structure is a cardiomyocyte It is located in the center of the channel and plays a role of partially blocking the cardiomyocyte channel by reducing its cross-sectional area. Accordingly, the cardiomyocytes contained in the cardiomyocyte mixture supplied through the cardiomyocyte inlet do not move to the residue outlet, but remain in the cardiomyocyte channel.
  • the shape of such a fine weir structure is not particularly limited thereto, but consists of a blocker column and a channel surface in a reverse oblique shape, one may be provided inside the cardiomyocyte channel, or a plurality may be provided, and cardiomyocytes It is preferable that a plurality of fine weir structures are provided inside the cardiomyocyte channel in order to more effectively prevent it from deviating from the cardiomyocyte channel.
  • the size of the blocker column included in the fine weir structure is not particularly limited as long as the cross-sectional area of the cardiomyocyte channel can be reduced, but as an example, it may represent a size of 5 to 30 ⁇ m in width and 5 to 30 ⁇ m in length. And, as another example, it may represent a size of 10 to 25 ⁇ m in width and 10 to 25 ⁇ m in length, and as another example, it may represent a size of 20 ⁇ m in width and 20 ⁇ m in length.
  • horizontal of the present invention refers to a surface in a direction parallel to the extension direction of the culture medium channel and the cardiomyocyte channel among the surfaces of micropillars vertically erected from the bottom of the cardiomyocyte channel.
  • vertical of the present invention refers to a surface in a direction perpendicular to the extension direction of the culture medium channel and the cardiomyocyte channel among the surfaces of the micropillars vertically erected from the bottom of the cardiomyocyte channel.
  • the cardiomyocyte mixture remaining inside the cardiomyocyte channel may be fixed to the inside of the cardiomyocyte channel by hardening of the auxiliary components contained therein.
  • the residue outlet included in the cardiomyocyte supply unit may serve to discharge contaminants such as metabolites or waste products generated from the cardiomyocytes while culturing the cardiomyocytes fixed to the cardiomyocyte channel.
  • This role of discharging contaminants can be performed not only at the outlet of the residue, but also at the inlet of cardiomyocytes. That is, the cardiomyocyte inlet port that has finished its role of introducing the cardiomyocytes into the cardiomyocyte channel may serve to discharge contaminants generated while culturing the cardiomyocytes fixed to the cardiomyocyte channel.
  • the shape of the residue outlet is not particularly limited as long as it can serve to discharge contaminants such as various metabolites and waste products secreted from cardiomyocytes contained in the cardiomyocyte mixture to the outside, similar to the culture solution recovery chamber described above. Does not. However, in order to prevent contamination of the surrounding environment of cardiomyocytes due to the contaminants, a nozzle of a tube or a syringe may be combined.
  • a part of the culture medium channel forms a mixing region with a part of the cardiomyocyte channel, supplies the culture medium to the cardiomyocytes through the mixing region, and recovers the culture medium used for culturing the cardiomyocytes, As a result, fixed cardiomyocytes can be cultured.
  • the mixing region may include a portion of a culture medium channel, a portion of a cardiomyocyte channel connected to a portion of the culture medium channel, and a partial blocking member formed at a junction of each channel.
  • the partial blocking member plays a role of partially opening a part of the culture medium channel connected to each other and a part of the cardiomyocyte channel without completely opening it, which is stored in the cardiomyocyte mixture stored inside the cardiomyocyte channel prior to fixation of the cardiomyocyte.
  • the culture medium supplied to the culture medium channel is transferred to the cardiomyocytes fixed to the cardiomyocyte channel through the partially opened region. It allows them to migrate, and consequently contributes to effective cardiomyocyte culture.
  • the partial blocking member is not particularly limited as long as it exhibits the above-described functionality, but as an example, it may be a micro-pillar structure that is spaced apart and arranged in a line along the extending direction of each channel, which is through the spaced area, It may play a role of allowing mutual circulation of the culture medium between a partial region of the culture medium channel and a partial region of the cardiomyocyte channel adjacent to a portion of the culture medium channel.
  • the micro-pillar structure plays a role of partially opening a part of the culture medium channel and a part of the cardiomyocyte channel connected to each other through the spaced region, through which the cardiomyocytes move and assist. It is possible to prevent the dilution of the components and to allow mutual circulation of the culture solution.
  • the shape of the micro-pillar structure is not particularly limited as long as it exhibits the above-described functionality, but as an example, the shape of the cross section may be a shape having a rounded square shape, which injects a culture solution into a culture solution channel.
  • the boundary is formed by the surface tension at the beginning of the rounded corner of the micropillar structure.
  • the cardiomyocyte mixture is injected into the cardiomyocyte channel, the surface at the beginning of the rounded corner of the micropillar structure By inducing the boundary to be formed by tension, a gap is formed between the cardiomyocyte channel and the culture medium channel around the micro-pillar structure, so that each separate injection is smoothly performed even without a separation valve or membrane. It is to make it happen.
  • the size of the micro-pillar structure is not particularly limited as long as it exhibits the above-described functionality, but may represent a size of 50 to 70 ⁇ m in width and 40 to 60 ⁇ m in length, and as another example, 55 to horizontal It may represent a size of 65 ⁇ m and 45 to 55 ⁇ m in length, and as another example, it may represent a size of 60 ⁇ m in width and 50 ⁇ m in length.
  • the reason why the horizontal and vertical lengths of the micro-pillar structures are set differently is that the horizontal length is longer than the vertical length so that the culture medium flows from the culture medium channel to the cardiomyocyte channel without interfering with the flow of the culture medium, and the vertical length is the induction. This is to induce a reproducible formation of an empty gap between the cardiomyocyte channel and the culture medium channel by sufficiently increasing the distance between the defined boundary formation site.
  • the length of the separation between each of the micro-pillar structures is not particularly limited thereto, but as an example, it may represent a length of 10 to 30 ⁇ m, as another example, may represent a length of 15 to 25 ⁇ m, and another example As, it can represent a length of 20 ⁇ m. This is to maintain the width of the cardiomyocyte channel and the ratio of about 3:1 to facilitate the inflow of the culture medium and the cardiomyocyte mixture.
  • the endomyocardial mimetic cardiac chip for evaluation of drug efficacy and toxicity basically includes at least one culture medium supply unit and one cardiomyocyte supply unit, but depending on the purpose of using the cardiac chip, a plurality of culture solution supply units and It may also include a cardiomyocyte supply unit.
  • it may include a plurality of culture medium supply units and one cardiomyocyte supply unit, one culture medium supply unit and a plurality of cardiomyocyte supply units, or may include a plurality of culture solution supply units and a plurality of cardiomyocyte supply units.
  • the mixing region is formed between the plurality of culture medium channels and one cardiomyocyte channel.
  • each culture medium channel It is preferable to configure not to be adjacent or to be completely isolated from each other even if they are adjacent.
  • the cardiac chip 2 provided by the present invention is in the form of a structure provided on the slide glass 1, and a cardiomyocyte supply unit consisting of a cardiomyocyte inlet 5, a residue outlet 6, and a cardiomyocyte channel 8
  • a cardiomyocyte supply unit consisting of a cardiomyocyte inlet 5, a residue outlet 6, and a cardiomyocyte channel 8
  • the culture solution supply chamber 3, the culture solution recovery chamber 4, and the culture solution channel (7 and 9) two sets of the culture solution supply unit is provided at the top and bottom, respectively.
  • a part of the cardiomyocyte channel 8 and a part of the culture medium channels 7 and 9 form a mixing region, the mixing region being separated from each other in the micro-pillar structure 10 arranged in a row along the extension direction of each channel.
  • Each is distinguished by, and a fine weir structure 11 is provided at a portion where the cardiomyocyte channel 8 and the residue outlet 6 communicate with each other.
  • Another embodiment of the present invention provides a method of evaluating the efficacy of a drug on cardiomyocytes using an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug.
  • the method for evaluating the efficacy of a drug on cardiomyocytes includes (a) culturing the cardiomyocytes included in the cardiomyocyte channel included in the cardiac endomyocyte mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug. step; (b) administering a target drug to a culture medium supply chamber included in an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug; And, (c) measuring the beat rate of the cultured cardiomyocytes.
  • the beats of the cardiomyocytes are confirmed at about 1 to 2 days after the culture, and the beats of these cardiomyocytes are maintained at a constant level until 7 days after the culture. Accordingly, when the cardiomyocytes are cultured and the cardiomyocytes start beating, and then a drug is administered to the culture medium supply chamber, the heartbeat rate of the cardiomyocytes may be changed by the effect of the drug. Therefore, by measuring the beat rate of the cardiomyocytes, the effect of the drug on the cardiomyocytes can be evaluated. For example, if the heartbeat rate of cardiomyocytes is increased after administration of a drug, the drug may be evaluated to play a role as a cardiac or blood pressure enhancing agent that increases the heartbeat in vivo. On the contrary, if the heartbeat rate of cardiomyocytes decreases after administration of the drug, it can be evaluated that the drug will play a role as a blood pressure lowering agent to reduce the heartbeat in vivo.
  • treatment with isoproterenol on the heart chip increases the heartbeat rate of cardiomyocytes, and treatment with nifedipine reduces or stops the heartbeat of cardiomyocytes.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for evaluating the efficacy of a drug on cardiomyocytes using an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug including hepatocytes.
  • the method of evaluating the efficacy of a drug on cardiomyocytes using an endomyocardial mimetic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug containing hepatocytes is (a) the efficacy and toxicity of the drug Obtaining cultured hepatocytes by culturing hepatocytes in a culture solution supply chamber included in the cardiac chip that mimics the endomyocardium; (b) culturing the cardiomyocytes contained in the cardiomyocyte channel included in the cardiac chip that mimics the endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of the drug; (c) administering a target drug to the cultured hepatocytes; And, (d) measuring the beat rate of the cultured cardiomyocytes.
  • the hepatocytes are cultured in the culture medium supply chamber of the endomyocardial mimic cardiac chip for evaluation of the efficacy and toxicity of the drugs provided in the present invention, and the endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug containing the cultured hepatocytes is used,
  • the endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug containing the cultured hepatocytes is used.
  • the drug is transformed through the hepatocytes, and the modified product is transferred to the myocardium. Since the cardiomyocytes are treated on cells, and thus the cardiomyocytes are affected by the product modified in the hepatocytes, the drug, not the drug, can be evaluated for the efficacy of the drug on the cardiomyocytes in an environment similar to the in vivo environment.
  • the hepatocytes may be normal hepatocytes, or immortalized hepatoma cells may be used for convenience of culture.
  • HepG2 a type of hepatoma cells, may be used.
  • the myocardial rate was increased by 2.5 times compared to the case of culturing only myocardial cells alone.
  • isoproterenol it was confirmed that the increase in the heart rate was further improved than when only the cardiomyocytes were cultured alone.
  • the time for maintaining the increased heart rate was further increased when the cardiomyocytes were cultured alone, compared to when the liver cancer cells and cardiomyocytes were co-cultured.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for evaluating the toxicity of a drug on cardiomyocytes using an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug.
  • the method for evaluating the toxicity of a drug on cardiomyocytes includes (a) culturing the cardiomyocytes contained in the cardiomyocyte channel included in the cardiac chip that mimics the endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of the drug. step; (b) administering a target drug to a culture medium supply chamber included in an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug; And, (c) evaluating whether the cultured cardiomyocytes are beaten and damaged.
  • the heartbeat rate of the cardiomyocytes may be changed by the effect of the drug.
  • the method of evaluating whether or not toxic to cardiomyocytes is performed is whether the beating of the cardiomyocytes is continuously or abruptly stopped, or whether the cardiomyocytes are continuously or rapidly damaged. It can be done by checking.
  • the heartbeat rate of cardiomyocytes is not decreased to maintain a constant level by administration of the drug, and the heartbeat rate of cardiomyocytes is continuously decreased in proportion to the passage of time. As a result, the heart muscle cells may eventually stop beating.
  • the cardiomyocytes may be shocked by the administration of the drug and the heart muscle cells may rapidly stop beating.
  • cardiomyocytes are damaged by the administration of the drug, and the function of the cardiomyocytes is continuously reduced in proportion to the passage of time, and finally, the cardiomyocytes are Symptoms of death may appear.
  • cardiomyocytes are rapidly damaged by the administration of the drug, resulting in a symptom of necrosis of the cardiomyocytes.
  • cardiomyocytes are beating or damaged, it is possible to evaluate whether the drug exhibits toxicity to cardiomyocytes.
  • Another embodiment of the present invention provides a method of evaluating the toxicity of a drug on cardiomyocytes using an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug including cultured hepatocytes.
  • the method of evaluating the toxicity of a drug on cardiomyocytes using an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug containing hepatocytes is (a) evaluating the efficacy and toxicity of the drug Obtaining cultured hepatocytes by culturing hepatocytes in a culture solution supply chamber included in the cardiac chip that mimics the endomyocardium; (b) culturing the cardiomyocytes contained in the cardiomyocyte channel included in the cardiac chip that mimics the endomyocardium for evaluating the efficacy and toxicity of the drug; (c) administering a target drug to the cultured hepatocytes; And, (d) evaluating whether the cultured cardiomyocytes are beaten and damaged.
  • an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of drugs containing cultured hepatocytes, the efficacy of the drug on the cardiomyocytes in an environment similar to the in vivo environment can be evaluated. For the same reason, By using an endomyocardial mimic cardiac chip for evaluating the efficacy and toxicity of the drug containing the cultured hepatocytes, it is possible to evaluate whether the drug exhibits toxicity to cardiomyocytes in an environment similar to the in vivo environment.
  • the drug is transformed through the hepatocytes, and the modified product is converted to the cardiomyocytes.
  • the product of the modified product of the hepatocyte which is not the drug, exhibits symptoms that continuously or rapidly stops the beating of the cardiomyocytes, or shows symptoms that continuously or rapidly damage the cardiomyocytes.
  • the toxicity of the drug to cardiomyocytes can be evaluated.
  • hepatocytes are the same as described above, and the "method of evaluating whether or not toxic to cardiomyocytes” is also the same as described above.
  • Example 1 Culture of human stem cell-based cardiomyocytes and hepatocytes
  • Cardiosight-S differentiated from human stem cells (hPSCs) of NEXEL was mixed with a hydrogel such as collagen or GelMa, and injected into the heart chip of the present invention, Supplement (100X) Cardiosight-S Media supplemented with was cultured for 7 days.
  • Liver cancer cells (HepG2) of Korean Cell Line Bank (KCLB) are MEM (Gibco) supplemented with 10% FBS, 1% penicillin, and streptomycin (Penicillin/Strepto-mycin, P/S) in a culture dish.
  • a culture solution supply chamber coated with a matrigel in the heart chip of the present invention was loaded into a culture solution supply chamber coated with a matrigel in the heart chip of the present invention, and co-cultured with a medium provided by NEXEL such as cardiomyocytes for at least 1 day. All cells were stored in a humidified incubator at 37° C. and 5% CO 2.
  • Example 2 Preparation of a cardiac chip that mimics endomyocardium for evaluation of drug efficacy and toxicity
  • the heart chip of the present invention was manufactured using PDMS (polydimethylsiloxane) elastomer and slide glass.
  • the heart chip of the present invention was designed by imitating a muscle fiber surrounded by an endomysium of the heart, and a chip drawing was designed with an AutoCAD program.
  • a film mask to create a 50 ⁇ m-high mold was prepared, and the photoresist (PR) photoresist SU-8 (MICROCHEM) and photolithography were used.
  • PR photoresist
  • MICROCHEM photoresist photoresist SU-8
  • the specific method is as follows: About 1.5 ml of a photoresist was dropped on a silicon wafer and then evenly coated (PR coated) with a thickness of 50 ⁇ m using a spin coater. After that, put the wafer on a hot plate heated to 95°C and perform soft baking for about 2 minutes to remove moisture and allow the photosensitive solution on the wafer to adhere firmly to the surface, thereby developing a photoresist. During (PR developing), the part exposed to ultraviolet rays was prevented from falling off. After aligning the film mask on the wafer coated with the photoresist, ultraviolet rays were irradiated thereon using a UV exposable mask aligner.
  • the exposed portion of the UV light became harder, and the wafer was placed at 95° C. for about 3 minutes to perform a post exposure baking process.
  • the photoresist was immersed in a photoresist developer (PR developer; SU-8 developer, MICROCHEM) for about 1 minute to develop the photoresist (PR developing) to selectively remove the part not exposed to ultraviolet rays.
  • PR developer photoresist developer
  • SU-8 developer MICROCHEM
  • the ratio of PDMS silicone base elastomer and curing agent (SYLGARD 184 silicone elastomer kit, Dow Corning) is mixed at 10:1 on the mold on which the PR patterning has been completed, and on the SU-8 mold After pouring, heat treatment was applied at 85° C. for 8 hours to solidify. After separating it from the mold, cut the PDMS according to the size of the chip, and then use a cylindrical 1.2mm and 8mm diameter biopsy punch to store the cell and hydrogel mixture inlet and outlet, and store the medium and inlet and outlet. A microfluidic device was manufactured by punching out according to the size. After immersing the PDMS-based microfluidic device in an ultrasonic generator containing isopropyl alcohol and performing sonication to clean the fabricated microfluidic device, a nitrogen air-gun Dried completely.
  • SYLGARD 184 silicone elastomer kit Dow Corning
  • the PDMS-based microfluidic device and slide glass that had been cleaned were dried in a dry oven at 70° C. for 5 minutes and then sterilized by exposure to ultraviolet rays. Finally, a PDMS-based microfluidic device and a slide glass were placed in a plasma processing system (CUTE, FEMTO Science) and bonded through oxygen plasma treatment to produce a heart chip.
  • a plasma processing system CUTE, FEMTO Science
  • the total size of the heart chip prepared as described above was 19 mm wide and 19 mm long, the height of all the channel microstructures in the chip was 50 ⁇ m, and the width size of the cardiomyocyte channel was 60 ⁇ m.
  • the width of the cardiomyocyte channel is about three times the size of about 20 ⁇ m, which is the diameter of the cardiomyocyte in vivo, and has a shape similar to the myocardial lining surrounding the cardiomyocyte and a myocardial fiber that extends long in several strands. I designed it.
  • the micro-weir structure located in the direction of the outlet of the cardiomyocyte channel is provided to be composed of a blocker column having a size of 20 ⁇ m and 20 ⁇ m in length in the middle of the channel and a channel surface having a diagonal shape in the reverse direction of injection,
  • the cardiomyocyte mixture containing the injected cardiomyocyte and hydrogel was designed to accumulate in the channel without escaping to the outlet of the residue.
  • the micro-weir structure was constructed in a repeating structure twice in order to prevent an exceptional situation in which cardiomyocytes may leak and to ensure reproducibility.
  • the micro-post that exists between the cardiomyocyte channel and the culture medium channel is designed in a rectangular shape with rounded corners, which is where the rounded corners of the micropillars begin when the cardiomyocyte mixture is injected into the cardiomyocyte channel.
  • the boundary was induced to be formed, and similarly, when only the culture medium was injected into the culture medium channel, the boundary formation was induced at the same position. Accordingly, a gap was formed between each cardiomyocyte channel and the culture medium channel, and the cardiomyocyte mixture and the culture medium were designed to be easily injected.
  • the size of the micro-pillar structures is 60 ⁇ m in width and 50 ⁇ m in length, and the spacing between each micro-pillar structure is designed to be 20 ⁇ m.
  • the size of the micro-pillar structure is set to 60 ⁇ m horizontally and 50 ⁇ m vertically is to make it larger than the vertical size of the micro-pillar structure, but to make it as short as possible without interfering with the flow of the culture medium and to sufficiently flow into the cardiomyocyte channel. It was designed to reproducibly form an empty gap between the cardiomyocyte channel and the culture medium channel by making the vertical boundary sufficient distance.
  • the reason why the spacing between the micro-pillar structures was set to 20 ⁇ m was designed to have a ratio of at least 3:1 to 60 ⁇ m, which is the width of the cardiomyocyte channel, to facilitate the injection of the cardiomyocyte mixture and the culture solution.
  • the width of the culture medium channel is 30 ⁇ m, which is about three times the diameter of the capillary vessel in the living body, 10 ⁇ m, and by placing it on both outer sides around the cardiomyocyte channel, the capillary vessels located between the myocardial fibers
  • the culture medium was designed to pass between the micro-pillar structures so that nutrients could reach the cardiomyocytes wrapped in a hydrogel that mimics the myocardium.
  • the diameter of the cardiomyocyte inlet and the residue outlet into which the cardiomyocyte mixture was injected was designed to be 1.2 mm, respectively, and the culture solution supply chamber and the culture solution collection chamber were designed to have a diameter of 8 mm.
  • Example 3 Evaluation of efficacy and toxicity of drugs using cardiac chips containing cardiomyocytes
  • Example 3-1 Evaluation of the function of the heart chip
  • FIG. 6 is a partial enlarged photograph showing an actual picture of a heart chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided by the present invention and a result of injecting food coloring into each channel inside the chip.
  • Example 3-2 Construction of a bio-like environment
  • 200 ⁇ l of culture solution was loaded into each of a set of culture solution supplying chamber and collection chamber included in the heart chip of the present invention prepared in Example 2, and the culture solution was placed inside each of the culture solution channels located on both sides using a pipette. After filling, 200 ⁇ l of culture solution was also loaded into the remaining one set of culture solution supply chamber and recovery chamber, so that the flow of culture solution was connected between the chambers. At this time, it was confirmed that the medium is bounded by the surface tension at the portion where the rounded corner begins in the direction toward the culture medium channel of the micro-pillar structure.
  • cardiomyocytes produced in a ratio of 2 x 10 6 /2 ⁇ l and injected into several chips
  • a syringe pump (NE-1000, NEWERA) was injected into the cardiomyocyte channel at a rate of 30 ⁇ l/min.
  • NE-1000, NEWERA a syringe pump
  • the cardiomyocyte mixture formed the boundary by the surface tension at the beginning of the rounded corner in the direction of the cardiomyocyte channel of the micro-pillar structure, confirming that the myocardial cell mixture and the culture solution were each successfully separated and injected.
  • the hydrogel contained in the injected cardiomyocyte mixture was cured to fix the cardiomyocytes in the cardiomyocyte channel.
  • the gap formed around the micro-pillar structure disappeared naturally at room temperature as it was temporarily formed, and when all the gaps formed inside the heart chip disappeared, the cardiomyocytes were cultured in an incubator.
  • the flow of the medium is minimized to give the cardiomyocytes time to adapt to the new cardiac chip environment, and the culture solution is supplied until the 7th day of culture.
  • culture solution 200 ⁇ l of the culture solution was loaded into the chamber, and 150 ⁇ l of the culture solution was loaded into the culture solution recovery chamber to give a difference in height of the medium, thereby inducing the flow of the medium by gravity.
  • the culture solution was replaced with fresh culture solution every day to provide continuous medium flow and fresh nutrients, and when the medium was replaced, the culture solution was cultured while removing waste products by removing the existing culture solution in each culture solution supply chamber and recovery chamber.
  • the heartbeat of the cardiomyocytes in the heart chip begins to occur around 1-2 days of culture as soon as possible, but the number of heartbeats increases as the culture time elapses, and based on the appropriate beat per minute (BPM).
  • BPM beat per minute
  • Example 3-3 Evaluation of efficacy and toxicity of drugs
  • Example 3-2 isoproterenol and nifedipine, drugs known to affect the heart rate, were used in the culture medium supply chamber of the heart chip of the present invention in which a bio-like environment was created. The concentration was treated, and the change was observed with an optical microscope, and the heartbeat and beat intervals of the cardiomyocytes were measured, and then analyzed (FIGS. 7A and 7B ).
  • the heart muscle rate (bpm) per minute before treatment with isoproterenol was about 40-50, indicating a slight bradycardia state.
  • the concentrations of the drug were 1, 5, and 10 ⁇ M, and a total of 3 concentrations were treated, and when observed for a total of 12 hours at 1 hour intervals, the overall trend toward all concentrations increased after drug treatment and the time at the highest beat rate. It could be observed that the beat rate decreases as the flow increases. Since the concentration of 1 ⁇ M was a relatively low concentration of the drug, it took a little longer, 3 hours to rise to the highest beat rate, and then, as the beat rate decreased slowly and only to the level of the normal beat rate, the efficacy and toxicity were also relatively low.
  • the concentration of 5 ⁇ M reduced the time to increase to the maximum beat rate from 3 hours to 1 hour, and the rate of decrease in the number of beats after that was much larger, and the number of beats that were finally decreased and maintained was increased from about 60 to 45. It was confirmed that it was maintaining a low state.
  • the concentration of 10 ⁇ M was the same as the concentration of 5 ⁇ M, and the time to increase to the highest heartbeat level was very fast as 1 hour, and unlike the concentration of 5 ⁇ M, it was confirmed that the high beat rate was maintained until 5 hours of treatment.
  • the width of the decrease in the rate of beat after that is as large as 5 ⁇ M, but it can be observed that the rate of beat is generally higher than that of the 5 ⁇ M treatment condition, which was interpreted to be because the effect of the drug persisted for a longer time at high concentrations.
  • the beat rate was continuously decreasing to about 40, and the phenomenon of arrhythmia, in which the beat interval was not constant, was clearly observed around 12 hours after treatment.
  • cardiomyocytes increase myocardial rate due to the efficacy of isoproterenol, but rather reduce myocardial rate due to the decrease in cellular function due to toxicity of the drug when the drug treatment time after recording the maximum heart rate is prolonged. It could be confirmed that the efficacy and toxicity were observed in proportion to the concentration of the drug.
  • the heart muscle rate per minute (bpm) before the nifedipine treatment was also about 40 to 50, which was slightly bradycardia.
  • the overall trend is that the beat disappears within 1 hour due to the efficacy of the drug after treatment with the drug at concentrations of 1, 5, and 10 ⁇ M, and after that, the number and intensity of the beats recover again at 1 ⁇ M and maintain this state.
  • the number of beats and intensity were recovered and maintained in this state, but it was confirmed that the beats suddenly stopped at 8 hours, and the number and intensity of beats were not recovered again at 10 ⁇ M.
  • the concentration of 1 ⁇ M was a relatively low concentration of drug treatment, it is expected that toxicity was weak, and it was possible to recover the beat and at the same time.
  • the concentration of 5 ⁇ M was also a drug treatment with a relatively lower concentration than 10 ⁇ M. However, it was interpreted that the sudden heartbeat disappeared due to strong toxicity to maintain it, and the concentration of 10 ⁇ M was so toxic that the heartbeat was not recovered.
  • nifedipine was also a result of confirming that drug efficacy and toxicity were observed in proportion to the concentration.
  • Example 4 Evaluation of efficacy and toxicity of drugs using cardiac chips including cardiomyocytes and liver cancer cells
  • Example 4-1 Culture of liver cancer cells
  • Liver cancer cells were cultured in the culture medium supply chamber of the heart chip of the present invention prepared in Example 2. Approximately, before loading the liver cancer cells, 100 ⁇ l of matrigel was loaded into the space to be cultured, coating was performed in an incubator for 30 minutes, and then 150 ⁇ l of NEXEL's Cardiosight-S medium was loaded. Additionally, liver cancer cells (5 x 10 4 cells) were loaded and cultured for about 2 days.
  • Example 4-2 Evaluation of efficacy and toxicity of drugs
  • Example 4-1 A bio-like environment was created through Example 4-1, and 5 ⁇ M of isoproterenol was treated in the culture medium supply chamber (liver cancer cells) of the heart chip of the present invention in which liver cancer cells and cardiomyocytes were co-cultured. Then, the change was observed with an optical microscope, and the beat rate and the beat interval of the cardiomyocytes were measured, and then analyzed (FIG. 9).
  • a difference in heart rate was observed before treatment with the drug depending on the presence or absence of liver cancer cells.
  • the heart rate was about 2.5 times higher than that of not.
  • isoproterenol was treated and observed for 6 hours at 1 hour intervals, the myocardial rhythm was significantly increased after 1 hour in both conditions.
  • the increase was relatively high, and in terms of maintaining the increased beat rate, it was confirmed that the longer time was maintained in the absence of liver cancer cells.

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Abstract

본 발명은 약물의 심장 효능 및 독성을 시험하기 위한 용도로 사용되고 심근세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 심근세포를 포함하는 심근세포 공급부를 포함하는 심근내막 수준에서 생체를 모방한 심장칩, 상기 심장칩을 이용하여 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법 및 상기 심장칩을 이용하여 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 사용하면, 심장연구에 있어서 동물실험의 이종간의 차이에 따른 부정확성을 극복할 수 있고, 심근세포를 단독으로 사용하거나 또는 심근세포와 간세포를 함께 사용하여 생체 내 조건과 유사한 조건에서 약물의 보다 정확한 효능 및 독성을 평가하는 플랫폼으로의 사용이 가능하며, 심장 내 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구 등에 응용될 수 있으므로, 약물 유효성 및 독성 등을 효과적으로 분석할 수 있는 휴먼온어칩(human-on-a-chip) 개발에 활용될 수 있을 것이다.

Description

약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
본 발명은 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 약물의 심장 효능 및 독성을 시험하기 위한 용도로 사용되고 심근세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 심근세포를 포함하는 심근세포 공급부를 포함하는 심근내막 수준에서 생체를 모방한 심장칩, 상기 심장칩을 이용하여 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법 및 상기 심장칩을 이용하여 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
심장은 생명의 시작과 끝을 함께하는 중요한 신체기관이다. 다만, 쉬지 않고 움직여 온몸 구석구석까지 혈액과 산소, 영양소를 보내는 심장엔 다양한 질환이 발생한다. 통계청 자료에 따르면 심장질환으로 인한 사망률은 최근 10년 동안 41.6%나 증가하였으며, 한국인 사망원인 순위도 3위에서 2위로 상승했다. 사회가 고령화되고, 고혈압, 당뇨병, 비만과 같은 심장병 선행질환이 급증함에 따라 심장질환이 조만간 암을 제치고 사망원인 1위로 올라설 것이라고 전망을 하고 있다. 현재 심장질환에 대한 다각적인 연구가 진행되고 있지만, 여전히 세계적으로 심장질환의 발생률과 이에 따른 사망률은 지속적으로 증가하고 있는 실정이다. 따라서 보다 확실하고 심도 있는 심장질환 연구가 필요할 때임은 분명하다.
신약개발을 통해 발굴된 다수 약물들의 최종 경쟁력은‘안전성’에 달려 있는데, 특히 급성독성으로써 심장독성은 매우 중요한 안전성 인자로써 치명적인 부정맥 증상인 Torsades de Pointes(TdP)로 인해 몇몇 약물이 시장으로부터 퇴출된 이후 약물개발에 있어서 심장독성을 위시한 주요 약리안전성이 강조되고 있으며 이를 확보하기 위한 연구 개발에 박차를 가하고 있는 실정이다.
효능 및 독성을 연구하는 방법 중 역학연구를 통한 독성평가가 가장 신뢰성 이 높은 것으로 알려져 있으나 이 방법은 많은 돈과 시간이 필요로 하는 단점이 있다. 따라서 상대적으로 짧은 시간 내 평가하기 위한 방법으로 쥐, 생쥐, 기니피그, 토끼 등과 같은 다양한 종의 동물을 이용한 약물 평가를 하게 되었지만 이 또한 윤리적인 문제에서 자유로울 수 없었으며, 인간과 다른 이온채널의 존재, 약동학적 차이 등 종간 차이(inter-species differences)라는 한계점을 지니고 있어 동물실험 결과가 인간에게 똑같이 적용되지 않는 경우가 많고, 동물실험을 거쳐 임상실험을 통과한다고 하더라도 부작용으로 다시 퇴출되는 경우가 종종 있는 실정이다. 현재 동물실험을 이용한 신약개발에는 10-15년의 오랜 기간과 약 5조원의 고비용이 필요하며, 이러한 비효율성에도 불구하고 여전히 동물실험을 진행하는 이유는 현재로선 마땅히 이를 대체할만한 방법이 없기 때문이다. 따라서 이를 대체할 수 있는 보다 효율적인 효능 및 독성평가 시스템의 개발이 절실하다.
동물실험을 대체하여 생체 외(in-vitro)에서 약물 효능 및 독성을 보다 정확하게 평가 할 수 있는 기술로써 장기 생체모방칩(Organ on a chip; OOC)이 최근 주목 받고 있다. 이 기술은 특정 장기의 내부 미세환경(microenvironment) 구조를 모방하여 해당 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써 그 기능과 특성을 구현할 수 있으며, 단순히 칩 위에서 세포를 배양하는 것이 아니라 산소 및 영양분의 이동과 흡수, 신호전달물질의 이동 등이 마이크로미터 내지 수 밀리미터 단위 내에서 벌어진다는 점에 착안하며, 미세유체기술 및 반도체 미세공정으로부터 발전시킨 소프트 리소그래피(soft-lithography) 공정으로 인체 조직 내 마이크로미터 단위의 미세 환경을 구현하여, 지속적인 관류시스템으로 연결된 마이크로 챔버 내에서 살아있는 세포를 배양하고, 이러한 챔버들을 배열하여 조직 또는 장기 수준의 생리활성을 구현함으로써 기존의 신약개발 및 효능 및 독성평가 방법을 대체할 수 있는 플랫폼으로 기대되고 있다.
그러나 선행된 연구들에서의 장기 생체모방칩을 구성하는 세포들은 대부분 쉬운 접근성으로 인해 동물 유래 세포 혹은 암유래 세포주(cancer cell line)을 사용하고 칩 내에서 2차원적인 세포 수준의 배양이 주를 이루고 있기 때문에 실제 생체 내(in-vivo) 에서의 기전을 정확하게 반영하지 못한다는 한계가 있다.
장기 생체모방칩 중에서도 심장 생체모방칩에 대한 국내 선행연구는 미비한 실정이며, 국외 선행연구에서 본 발명과 유사하며 가장 최근 발표된 심장 생체모방 칩 연구인 2015년에 발표된 A. Mathur et al.그룹의 연구 역시 유의적인 연구임에 불구하고, 세포외기질 (extracellular matrix)의 부재 등 심근세포의 주변 미세환경 을 완벽하게 구현했다고는 보기 어렵다.
인체 내 생리현상 특히 장기수준에서 발생하는 생리현상은 매우 복잡하고 체계적인 시스템으로 이루어져 있으므로 이 모든 것을 모방하기에는 현재로썬 기술적인 한계가 존재한다. 따라서, 생체 내의 특정 생리현상에 대한 기전을 파악하기 위한 좋은 방법으로는 가장 단순하고 기본적인 단위로부터 스케일을 조절하면서 관찰하는 것이다. 다만, 오히려 이러한 작은 스케일의 미세구조를 칩 내에서 완벽하게 구현하기에는 세포 주입 및 배양, 미세유체학적 특성변화 등 실험적인 어려움이 많이 발생함에 따라 대부분 비율적으로 확대하여 칩을 제작하는 실정이다.
또한, 인체는 모든 약물들을 외부 물질로 인식하여 이들의 제거에 적합한 다양한 화학적 과정으로 처리하게 되는데 이러한 과정들은 대부분 간에서 발생하는 대사작용에 의해 변화되어 작용하게 된다. 간에서의 약물대사는 신장에서의 약물 배출을 촉진하기 위해 약물의 친수성을 증가시키거나 약물 대사체들의 효과를 감소시키는 효과를 나타내지만, 늘 그런 것은 아니며, 때로는 약물 대사체들도 약효를 나타내거나 원래의 약물보다 더 강한 약효를 나타내기도 하고 원래의 약물 은 효과를 나타내지 않지만 약물 대사체가 효과를 나타내는 경우도 있다. 따라서 간에 의한 약물대사는 약물 효능 및 독성평가에 있어서 필수적으로 고려돼야 할 요소이지만 대부분의 장기 생체모방칩은 이러한 약동력학적인 시스템을 간과하는 경우가 많다.
본 발명자들은 생체 외에서 심근내막 수준으로 심근세포를 구현하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 심근세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 심근세포를 포함하는 심근세포 공급부를 포함하는 심장칩을 이용할 경우, 심근세포의 박동수를 측정하여 심근세포에 미치는 약물의 효능과 독성을 용이하게 평가할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 심근세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 심근세포를 포함하는 심근세포 공급부를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 심근내막 모방 심장칩을 이용하여 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 심근내막 모방 심장칩을 이용하여 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 사용하면, 심장연구에 있어서 동물실험의 이종간의 차이에 따른 부정확성을 극복할 수 있고, 심근세포를 단독으로 사용하거나 또는 심근세포와 간세포를 함께 사용하여 생체 내 조건과 유사한 조건에서 약물의 보다 정확한 효능 및 독성을 평가하는 플랫폼으로의 사용이 가능하며, 심장 내 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구 등에 응용될 수 있으므로, 약물 유효성 및 독성 등을 효과적으로 분석할 수 있는 휴먼온어칩(human-on-a-chip) 개발에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 입체도 및 칩 내 구성요소가 포함된 전체 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 입체도이다.
도 3은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 평면도이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 심근세포 채널과 배양액 채널의 부분 확대도이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 미세 기둥 구조물 및 미세 둑 구조물의 부분 확대도이다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 실제 사진과 칩 내부의 각 채널 내로 식용 색소를 주입한 결과를 나타내는 부분 확대사진이다.
도 7a는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에서 심근세포를 7일 동안 배양하고, 심근박동수의 변화를 주는 약물인 이소프로테레놀을 처리한 다음, 심근세포의 박동수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에서 심근세포를 7일 동안 배양하고, 심근박동수의 변화를 주는 약물인 니페디핀을 처리한 다음, 심근세포의 박동수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 심근세포와 간암세포를 공동배양한 결과를 나타내는 사진 및 부분 확대사진이다.
도 9는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에서 심근세포와 간암세포를 공동배양하고, 이소프로테레놀을 처리한 다음, 심근세포의 박동수의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 심근세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 심근세포를 포함하는 심근세포 공급부를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩은 (a) 배양액 공급 챔버; 배양액 회수 챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부; 및 (b) 일 측단에 구비된 심근세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 잔류물 유출구; 및, 상기 심근세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 구비되고, 상기 잔류물 유출구와의 연통부에 미세 둑 구조물이 구비되며, 상기 배양액 채널과 동일한 방향으로 연장되어 상기 배양액 채널의 일부와 연접하고, 상기 배양액 채널과의 연접부위에 배양액이 상호 교류할 수 있는 믹싱영역을 형성하는 심근세포 채널;을 포함하는 심근세포 공급부로 구성된다.
본 발명에서 제공하는 심장칩의 전체적인 구조물의 재질은 심근세포의 고정 및 배양을 저해하거나 좋지않은 영향을 미치지 않는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리락틱산(polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO) 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 광학적으로 투명하고, 내구성이 강하며, 생물 친화적이고, 유연하여, motion-tracking 이라는 광학적 방법을 이용하여 심근세포의 박동 상태를 용이하게 분석할 수 있는 PDMS 등이 될 수 있다.
이때, 상기 재질을 이용하여 제조된 심장칩은 이에 포함된 심근세포 채널에 심근세포가 정착되고, 배양액 채널에 배양액을 유입하는 과정을 원활하게 수행하기 위하여, 1차적으로 형태를 형성한 심장칩을 대상으로 후처리 공정을 수행할 수 있다. 이때, 1차적으로 형태를 형성한 심장칩 전체를 대상으로 후처리 공정을 수행할 수도 있고, 심근세포 채널과 배양액 채널 부위에 한정하여 후처리 공정을 수행할 수도 있으며, 배양액 채널과 심근세포 채널이 연접한 믹싱영역에 한정하여 후처리 공정을 수행할 수도 있다. 또한, 상기 후처리 공정은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 70 내지 90℃에서 36 내지 60시간 동안 가열처리하여 수행할 수 있고, 다른 예로서, 75 내지 85℃에서 44 내지 52시간 동안 가열처리하여 수행할 수 있으며, 또 다른 예로서, 80℃ 오븐에서 48시간 동안 가열처리하여 수행할 수 있다.
상기 배양액 공급부에 포함된 배양액 공급 챔버는 믹싱영역을 통해 심근세포 채널에 공급하기 위한 심근세포 배양용 배양액을 저장하고, 저장된 배양액을 배양액 채널을 통해 심근세포에 공급하는 역할을 수행한다.
아울러, 약물의 독성을 평가하기 위하여, 상기 배양액 공급 챔버는 간세포를 배양하기 위한 배양용기로서 사용될 수도 있다.
상기 배양액 공급부에 포함된 배양액 회수 챔버는 상기 배양액 공급 챔버로부터 공급된 배양액이 배양액 채널을 통과한 후, 최종적으로 저장되는 부위로서, 심근세포 배양 후 오염된 배양액을 회수하는 역할을 수행하는데, 배양 후 심근세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등으로 오염된 배양액으로 인한 주변환경 오염을 방지하기 목적으로 사용된다.
상기 배양액 공급부에 포함된 배양액 채널은 배양액 공급 챔버로부터 배양액 회수 챔버로 배양액이 유통하는 배양액의 메인 유로로서의 역할을 수행하는데, 상기 배양액 채널의 일부가 믹싱영역을 형성하고, 상기 형성된 믹싱영역을 통해 심근세포에 배양액을 공급하고, 심근세포 배양에 사용된 배양액을 회수하는 역할을 수행한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양액 채널은 생체 내에 존재하는 심근세포에 영양을 공급하기 위한 모세혈관을 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 배양액 채널의 폭은 모세혈관의 기능을 모사할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 40㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 35㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 30㎛의 폭을 가질 수 있다.
상기 심근세포 공급부에 포함된 심근세포 유입구는 심근세포 채널에 공급하기 위한 심근세포 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는데, 예를 들어, 심근세포 혼합물이 로딩된 심근세포 유입구에 주사기의 노즐이 연결될 수 있는 구조를 갖도록 구성될 수 있다.
상기 심근세포 혼합물은 심근세포와 상기 심근세포의 유통과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 심장칩은 이에 포함된 심근세포 채널내부에 정렬되어 고정된 형태로 존재하는 심근세포를 포함하게 되는데, 상기 심근세포 채널 내부에 심근세포를 주입하고, 주입된 심근세포가 상기 심근세포 채널 내부에 고정되기 위해서는 이를 보조하는 보조성분을 필요로 한다. 상기 보조성분은 심근 세포 주변의 미세환경에 존재하는 세포외기질(ECM)을 모방한 것으로서, 심근세포의 3차원 세포배양에 필수적이며, 배양된 심근세포의 구조 및 기능이 생체 내의 것과 유사하도록 유지하는 역할을 수행할 수 있다. 상기 보조성분은 심근세포의 유입과 고정을 보조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 하이드로젤을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 콜라겐 하이드로젤, 알지네이트 하이드로젤, 젤마(GelMa) 하이드로젤 등을 사용할 수 있다.
상기 하이드로젤은 심근세포와 혼합되어, 심근세포의 3차원 배양을 보조하고, 추가적으로 상기 심근세포에 유동성을 부여하여, 상기 심근세포가 심근세포 유입구로부터 심근세포 채널로 이동할 수 있게 한다.
뿐만 아니라, 상기 하이드로젤은 다양한 조건에 의해 경화될 수 있는데, 예를 들어, 콜라겐 하이드로젤은 인큐베이터 내에 1시간 이상 두어 온도상승을 유도하여 경화시킬 수 있고, 알지네이트 하이드로젤은 배양액 채널에 배지를 대체하여 CaCl2 용액을 주입하여 경화시킬 수 있으며, 젤마 하이드로젤은 자외선을 조사하여 경화시킬 수 있다.
상기 심근세포 혼합물이 심근세포 채널로 이동한 후, 이에 포함된 하이드로젤이 경화되면, 상기 경화된 하이드로젤 내에 포함된 심근세포가 자연스럽게 고정될 수 있는데, 하이드로젤의 내재적인 다공성 특징으로 인하여, 하이드로젤을 통해 외부의 배양액이 심근세포에 전달될 수 있어, 고정된 심근세포의 배양을 보조할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용된 심근세포는 심장칩의 심근세포 채널 내부에 고정되어 생체 내 심장의 기능을 모사할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 줄기세포로부터 분화된 심근세포가 될 수 있다.
상기 심근세포 공급부에 포함된 심근세포 채널은 상술한 바와 같이, 심근세포 유입구를 통해 공급된 심근세포 혼합물이 저장 및 고정될 뿐만 아니라, 고정된 심근세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 심근세포 채널은 심장에서 가장 기본적인 단위인 심근섬유(muscle fiber)와 이를 감싸고 있는 근내막(endomysium)이라는 미세구조를 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 심근세포 채널의 폭은 심근세포의 고정 및 배양을 수행할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 50 내지 70㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 55 내지 65㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 60㎛의 폭을 가질 수 있다.
상기 심근세포 채널은 심근세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 연통된 통로의 형태가 될 수 있는데, 상기 잔류물 유출구와 연통된 부위에는 내부에 미세 둑 구조물이 구비되어 있고, 이러한 미세 둑 구조물은 심근세포 채널의 가운데에 위치하여, 심근세포 채널의 단면적을 감축시켜서 부분적으로 차단하는 역할을 수행한다. 이에 따라, 심근세포 유입구를 통해 공급된 심근세포 혼합물에 포함된 심근세포가 잔류물 유출구로 이동되지 않고, 심근세포 채널 내에 잔류하게 된다.
이러한 미세 둑 구조물의 형상은 특별히 이에 제한되지 않으나, 차단기둥과 역방향 사선형태의 채널 표면으로 구성되는데, 심근세포 채널의 내부에 한 개가 구비될 수 도 있고, 복수 개가 구비될 수 도 있으며, 심근세포가 심근세포 채널에서 이탈하는 것을 보다 효과적으로 방지하기 위하여 심근세포 채널의 내부에 복수 개의 미세 둑 구조물이 구비됨이 바람직하다.
상기 미세 둑 구조물에 포함된 차단기둥의 크기는 심근세포 채널의 단면적을 감축시킬 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 가로 5 내지 30㎛ 및 세로 5 내지 30㎛의 크기를 나타낼 수 있고, 다른 예로서, 가로 10 내지 25㎛ 및 세로 10 내지 25㎛의 크기를 나타낼 수 있으며, 또 다른 예로서, 가로 20㎛ 및 세로 20㎛의 크기를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "가로"는 심근세포 채널의 바닥에서 수직으로 세워진 미세기둥의 면 중에서, 배양액 채널 및 심근세포 채널의 연장방향과 평행한 방향의 면을 의미한다.
본 발명의 용어 "세로"는 심근세포 채널의 바닥에서 수직으로 세워진 미세기둥의 면 중에서, 배양액 채널 및 심근세포 채널의 연장방향과 수직인 방향의 면을 의미한다.
상술한 바와 같이, 상기 심근세포 채널의 내부에 잔류한 심근세포 혼합물은 이에 포함된 보조성분의 경화에 의하여, 심근세포가 심근세포 채널의 내부에 고정될 수 있다.
상기 심근세포 공급부에 포함된 잔류물 유출구는 심근세포 채널에 고정된 심근세포를 배양하면서 상기 심근세포로부터 생성된 대사산물 또는 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있다. 이처럼 오염물을 배출하는 역할은 잔류물 유출구 뿐만 아니라 심근세포 유입구도 함께 수행할 수 있다. 즉, 심근세포를 심근세포 채널에 유입하는 역할이 종료된 심근세포 유입구는 심근세포 채널에 고정된 심근세포를 배양하면서 생성되는 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수도 있다.
상기 잔류물 유출구의 형상은, 앞서 설명한 배양액 회수 챔버와 마찬가지로, 심근세포 혼합물에 포함된 심근세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 오염물로 인한 심근세포 주변환경의 오염을 방지하기 위하여 튜브 또는 주사기의 노즐이 결합될 수 있는 형태로 구성될 수 있다.
한편, 앞서 간략하게 설명한 바와 같이, 배양액 채널의 일부는 심근세포 채널의 일부와 믹싱영역을 형성하고, 상기 믹싱영역을 통해 심근세포에 배양액을 공급하고, 심근세포 배양에 사용된 배양액을 회수함으로써, 결과적으로는 고정된 심근세포를 배양할 수 있다.
상기 믹싱영역은 배양액 채널의 일부, 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 심근세포 채널의 일부, 상기 각 채널의 연접부에 형성된 부분 차단부재로 구성될 수 있다.
이때, 부분 차단부재는 상호 연접된 배양액 채널의 일부와 심근세포 채널의 일부를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하는 역할을 수행하는데, 이는 심근세포의 고정 이전에 심근세포 채널 내부에 저장된 심근세포 혼합물에 포함된 심근세포가 배양액 채널의 내부로 이동하거나 또는 배양액에 의해 보조성분이 희석되는 것을 방지하면서도, 상기 부분적으로 개통된 부위를 통해, 배양액 채널에 공급된 배양액이 심근세포 채널에 고정된 심근세포로 이동하는 것을 허용하여, 결과적으로는 효과적인 심근세포 배양에 일조한다.
상기 부분 차단부재는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 이격되어 각 채널의 연장방향을 따라서 일렬로 배치된 미세 기둥 구조물이 될 수 있는데, 이는 그의 이격된 영역을 통해, 배양액 채널의 일부영역과 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 심근세포 채널의 일부영역 사이로 배양액의 상호 유통을 허용하는 역할을 수행할 수 있다.
구체적으로, 상기 미세 기둥 구조물은 그의 이격된 영역을 통해, 상호 연접된 배양액 채널의 일부와 심근세포 채널의 일부를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하는 역할을 수행하는데, 이를 통해 심근세포의 이동, 보조성분의 희석을 방지하고, 배양액의 상호 유통을 허용할 수 있다.
이를 위하여, 상기 미세 기둥 구조물의 형태는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 단면의 형상이 모서리가 둥근 사각형 형태를 나타내는 형태가 될 수 있는데, 이는 배양액 채널에 배양액을 주입할 때, 미세 기둥 구조물의 둥근 모서리가 시작되는 부분에서 표면장력에 의해 경계가 형성되게끔 유도하고, 마찬가지로 심근세포 채널에 심근세포 혼합물을 주입할 때, 미세 기둥 구조물의 둥근 모서리가 시작되는 부분에서 표면장력에 의해 경계가 형성되게끔 유도함으로써, 상기 미세 기둥 구조물을 중심으로 심근세포 채널과 배양액 채널 사이에 빈 간격(gap)이 형성됨에 따라 분리 밸브 혹은 분리막의 존재가 없어도 각각의 분리 주입이 원활하게 수행되게 하기 위함이다.
또한, 상기 미세 기둥 구조물의 크기는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 가로 50 내지 70㎛ 및 세로 40 내지 60㎛의 크기를 나타낼 수 있고, 다른 예로서, 가로 55 내지 65㎛ 및 세로 45 내지 55㎛의 크기를 나타낼 수 있으며, 또 다른 예로서, 가로 60㎛ 및 세로 50㎛의 크기를 나타낼 수 있다. 이처럼 미세 기둥 구조물의 가로길이와 세로길이를 달리 설정한 이유는 가로길이를 세로길이보다 길게 하여, 배양액의 흐름을 방해하지 않고 배양액이 배양액 채널로부터 심근세포 채널로 유입되도록 하고, 세로길이는 상기 유도된 경계 형성부위의 거리를 충분히 하여 심근세포 채널과 배양액 채널 사이의 빈 간격(gap)이 재현성있게 형성되도록 유도하기 위한 것이다.
아울러, 상기 각 미세 기둥 구조물간의 이격 길이는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 10 내지 30㎛의 길이를 나타낼 수 있고, 다른 예로서, 15 내지 25㎛의 길이를 나타낼 수 있으며, 또 다른 예로서, 20㎛의 길이를 나타낼 수 있다. 이는 심근세포 채널의 폭과 약 3:1의 비율을 유지하여, 배양액과 심근세포 혼합물의 유입을 원활하게 하기 위한 것이다.
본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩은 적어도 하나의 배양액 공급부와 하나의 심근세포 공급부를 기본적으로 포함하지만, 상기 심장칩을 사용하는 목적에 따라, 다수의 배양액 공급부와 심근세포 공급부를 포함할 수도 있다.
예를 들어, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 심근세포 공급부를 포함하거나, 하나의 배양액 공급부와 복수개의 심근세포 공급부를 포함하거나, 또는 복수개의 배양액 공급부와 복수개의 심근세포 공급부를 포함할 수 있다.
특히, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 심근세포 공급부를 포함하는 경우, 믹싱영역은 복수개의 배양액 채널과 하나의 심근세포 채널사이에 형성되는데, 이때, 각 배양액 채널간의 간섭을 배제하기 위하여, 각 배양액 채널은 인접하지 않도록 구성되거나 또는 인접하더라도 상호 완전 격리되도록 구성함이 바람직하다.
이하, 본 발명의 도 1 내지 도 5를 참조하여, 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 구조를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 제공하는 심장칩(2)은 슬라이드 글라스(1)위에 구비된 구조물의 형태로서, 심근세포 유입구(5), 잔류물 유출구(6) 및 심근세포 채널(8)로 구성된 심근세포 공급부를 중심으로, 배양액 공급 챔버(3), 배양액 회수 챔버(4) 및 배양액 채널(7 및 9)로 구성된 두 세트의 배양액 공급부가 상단과 하단에 각각 구비된 형태이다. 상기 심근세포 채널(8)의 일부와 배양액 채널(7 및 9)의 일부는 믹싱영역을 형성하는데, 상기 믹싱영역은 이격되어 각 채널의 연장방향을 따라서 일렬로 배치된 미세 기둥 구조물(10)에 의해 각각 구별되고, 상기 심근세포 채널(8)과 잔류물 유출구(6)가 연통된 부위에는 미세 둑 구조물(11)이 구비되어 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하여, 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법은 (a) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계; (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 심근세포의 박동수를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 심근세포를 배양하게 되면, 배양 후, 약 1 내지 2일이 경과된 시점에서 심근세포의 박동이 확인되며, 이러한 심근세포의 박동은 배양 후 7일이 경과될 때까지 일정한 수준으로 유지된다. 따라서, 상기 심근세포를 배양하여, 심근세포의 박동이 시작된 후, 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 심근세포의 박동수가 변화될 수 있다. 따라서, 상기 심근세포의 박동수를 측정하여, 상기 약물이 심근세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 약물의 투여 후, 심근세포의 박동수가 증가되면, 상기 약물은 생체 내에서 심장의 박동을 증가시키는 강심제 또는 혈압강화제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다. 이에 반하여, 약물을 투여한 후, 심근세포의 박동수가 감소되면, 상기 약물은 생체 내에서 심장의 박동을 감소시키는 혈압저하제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 심장칩에 이소프로테레놀을 처리하면 심근세포의 박동수가 증가하고, 니페디핀을 처리하면 심근세포의 박동이 감소되거나 정지됨을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하여, 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하여, 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법은 (a) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하여 배양된 간세포를 수득하는 단계; (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 간세포에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (d) 상기 배양된 심근세포의 박동수를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 배양액 공급 챔버에 간세포를 배양하고, 상기 배양된 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하면, 상술한 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 응용하여, 생체 내에 유입된 약물이 간세포에 의해 변형된 후, 상기 변형된 산물이 심근세포에 미치는 효능을 평가할 수 있다.
구체적으로, 상기 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 간세포를 배양한 후, 심근세포를 배양하고, 상기 배양된 간세포에 약물을 투여하면, 상기 약물이 간세포를 통해 변형된 후, 변형된 산물이 심근세포에 처리되고, 이로 인하여 상기 심근세포는 약물이 아닌 약물이 간세포에서 변형된 산물을 통해 영향을 받게 되므로, 보다 생체 내 환경과 유사한 환경에서 약물이 심근세포에 미치는 효능을 평가할 수 있다.
이때, 상기 간세포는 정상적인 간세포를 사용할 수도 있고, 배양의 편의성을 위하여 불멸화된 간암세포를 사용할 수도 있는데, 예를 들어, 간암세포의 일종인 HepG2를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 간암세포의 일종인 HepG2를 배양액 공급 챔버에서 배양하고, 심근세포를 배양한 결과, 심근세포만을 단독으로 배양한 경우보다도 심근박동수가 2.5배로 증가됨을 확인하였다. 이 후, 상기 간암세포에 이소프로테레놀을 처리한 결과, 심근세포만을 단독으로 배양한 경우보다도 심근박동수의 증가폭이 더욱 향상됨을 확인하였다. 이에 반하여, 증가된 심근박동수가 유지되는 시간은 간암세포와 심근세포를 공동배양한 경우에 비하여, 심근세포만을 단독으로 배양한 경우에 더욱 증가됨을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하여, 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법은 (a) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계; (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 심근세포의 박동여부 및 손상여부를 평가하는 단계를 포함한다.
상술한 바와 같이, 심근세포를 배양하여, 심근세포의 박동이 시작된 후, 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 심근세포의 박동수가 변화될 수 있는데, 상기 약물이 심근세포에 대하여 독성을 나타내는 경우에는, 심근세포의 박동수가 변화되는 수준이 아니라, 심근세포의 본질적 기능을 변화시킬 수 있다. 상기 투여된 약물이 심근세포에 대해 독성을 나타낼 경우, 심근세포에 독성을 나타내는지의 여부를 평가하는 방법은 심근세포의 박동이 지속적으로 또는 급격히 중지되거나 또는 심근세포가 지속적으로 또는 급격히 손상되는지의 여부를 확인하여 수행될 수 있다.
일 예로서, 상기 투여된 약물이 심근세포에 대해 독성을 나타낼 경우, 약물 투여에 의해 심근세포의 박동수가 일정수준으로 유지하도록 감소되지 않고, 시간의 경과에 비례하여 심근세포의 박동수가 지속적으로 감소되어, 최종적으로는 심근세포의 박동이 중지되는 증상이 나타날 수 있다. 다른 예로서, 상기 투여된 약물이 심근세포에 대해 독성을 나타낼 경우, 약물 투여에 의해 심근세포가 충격을 받아 심근세포의 박동이 급격히 중지되는 증상이 나타날 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 투여된 약물이 심근세포에 대해 독성을 나타낼 경우, 약물 투여에 의해 심근세포가 손상되어 시간의 경과에 비례하여 심근세포의 기능이 지속적으로 저하되고, 최종적으로는 심근세포가 사멸하는 증상이 나타날 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 투여된 약물이 심근세포에 대해 독성을 나타낼 경우, 약물 투여에 의해 심근세포가 급격히 손상되어 심근세포가 괴사하는 증상이 나타날 수 있다.
따라서, 상기 심근세포의 박동여부 및 손상여부를 평가하여, 상기 약물이 심근세포에 독성을 나타내는지의 여부를 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 배양된 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하여, 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하여, 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법은 (a) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하여 배양된 간세포를 수득하는 단계; (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 간세포에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (d) 상기 배양된 심근세포의 박동여부 및 손상여부를 평가하는 단계를 포함한다.
상술한 바와 같이, 배양된 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하면, 보다 생체 내 환경과 유사한 환경에서 약물이 심근세포에 미치는 효능을 평가할 수 있는데, 동일한 이유로, 상기 배양된 간세포를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩을 이용하면, 보다 생체 내 환경과 유사한 환경에서 약물이 심근세포에 독성을 나타내는지의 여부를 평가할 수 있다.
즉, 상기 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 간세포를 배양한 후, 심근세포를 배양하고, 상기 배양된 간세포에 약물을 투여하면, 상기 약물이 간세포를 통해 변형된 후, 변형된 산물이 심근세포에 처리되고, 이로 인하여 상기 약물이 아닌 약물이 간세포에서 변형된 산물이 심근세포의 박동을 지속적으로 또는 급격히 중지시키는 증상을 나타내는지 또는 심근세포를 지속적으로 또는 급격히 손상시키는 증상을 나타내는지를 확인할 수 있으므로, 보다 생체 내 환경과 유사한 환경에서 약물이 심근세포에 미치는 독성을 평가할 수 있다.
이때, 상기 "간세포"에 대하여는 상술한 바와 동일하고, "심근세포에 독성을 나타내는지의 여부를 평가하는 방법" 역시 상술한 바와 동일하다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및/또는 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명의 실시양태가 기재되었지만, 이들 실시양태가 본 발명의 모든 가능한 형태를 기재하지는 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 제한하려기보다는 설명을 위한 용어이며, 본 발명의 취지와 범주에서 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1: 인간 줄기세포 기반 심근세포 및 간세포의 배양
NEXEL 사의 인간 줄기세포(hPSCs)로부터 분화된 심근세포(Cardiosight-S)를 콜라젠(collagen) 혹은 젤마(GelMa)와 같은 하이드로젤(hydrogel)과 섞어서 본 발명의 심장칩 내로 주입하고, Supplement(100X)를 보충한 Cardiosight-S Media로 7일 동안 배양하였다. Korean Cell Line Bank(KCLB)의 간암세포(HepG2)는 배양접시 (culture dish)에서 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Penicillin/Strepto-mycin, P/S)을 보충한 MEM(Gibco사) 배지에서 배양 및 계대 후, 본 발명의 심장칩 내 마트리젤(matrigel)로 코팅한 배양액 공급 챔버에 로딩하여 심근세포와 같은 NEXEL사에서 제공하는 배지로 1일 이상 공동 배양하였다. 모든 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 가습한 인큐베이터에 보관하였다.
실시예 2: 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩의 제작
본 발명의 심장칩은 PDMS(polydimethylsiloxane)탄성중합체와 슬라이드글라스 (slide glass)를 이용하여 제작하였다.
본 발명의 심장칩은 심장의 근내막(endomysium)에 둘러싸인 심근섬유 (muscle fiber)를 모방하여 설계하였으며, AutoCAD 프로그램으로 칩 도면을 디자인하였다. 50㎛ 높이의 주형(mold)을 생성하기 위한 필름 마스크(film mask)를 제작하고, 이를 이용하여 포토레지스트 (photoresist; PR)인 감광액 SU-8(MICROCHEM)과 광식각(photolithography)기법을 사용하여 주형(mold)을 제작하여, 칩 내 미세구조 가 구현된 PDMS 기반 미세유체소자를 제작하였다.
구체적인 방법은 다음과 같다: 실리콘 웨이퍼(wafer) 위에 감광액을 약 1.5㎖ 가량 떨어뜨린 후 스핀 코터 (spin coater)를 이용하여 50㎛ 두께로 고르게 도포(PR coating)하였다. 이후 95℃로 가열된 핫플레이트(hot plate) 위에 웨이퍼를 올려 약 2분가량 소프트 베이킹(soft baking)을 수행함으로써 습기를 제거하고 웨이퍼 위의 감광액이 표면에 단단하게 부착될 수 있게 하여, 감광액 현상(PR developing) 시 자외선에 노출된 부분이 떨어져 나가지 않도록 방지하였다. 감광액이 도포된 웨이퍼 위에 필름 마스크를 정렬한 뒤 그 위에 자외선 노광 마스크 얼라이너(UV exposable mask aligner)를 이용하여 자외선을 조사하였다. 자외선 노광(UV exposure)을 받은 네거티브 포토레지스트는 자외선이 노출된 부분이 더욱 단단해지며, 웨이퍼를 약 3분 동안 95℃에 두어 노광 후 베이킹(post exposure baking) 과정을 수행하였다. 이후 감광액 현상액(PR developer; SU-8 developer, MICROCHEM)에 약 1분 동안 담가 감광액을 현상(PR developing)하여 자외선에 노출되지 않은 부분을 선택적으로 제거하였다. 마지막으로, 탈이온수(Deionized water; DI water)로 웨이퍼를 세척하고 질소로 건조시키면 미세구조가 패터닝된 최종 주형(mold)을 수득하였다.
상기 감광액 패터닝(PR patterning)이 완료된 주형(mold) 위에 PDMS 실리콘계 엘라스토머(silicone base elastomer)와 경화제(curing agent, SYLGARD 184 silicone elastomer kit, Dow Corning)의 비율을 10:1로 섞어 SU-8 주형 위에 부은 뒤 85℃에서 8시간 동안 열처리를 가해 고형화 하였다. 이를 주형으로부터 분리해낸 후, PDMS를 칩의 크기에 따라 자른 뒤 원통형 1.2mm 및 8mm 직경의 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 세포 및 하이드로젤 혼합물 유입구 및 유출구와 배지 저장 및 유입구 및 유출구를 각각의 크기에 맞게 펀치아웃(punch out)하여 미세유체소자를 제작하였다. 상기 제작된 미세유체소자를 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)이 담겨있는 초음파 발생 장치(sonicator)에 PDMS 기반 미세유체소자를 담가 초음파 처리(sonication)를 수행하여 세척한 후, 질소 에어건(air-gun)으로 완전히 건조시켰다.
세척이 완료 된 PDMS기반 미세유체소자와 슬라이드글라스는 70℃ 드라이 오븐(dry oven) 내에서 5분 동안 건조시킨 뒤 자외선에 노출시켜 멸균시켰다. 최종적으로, PDMS 기반 미세유체소자와 슬라이드 글라스를 플라즈마 처리기(plasma processing system, CUTE, FEMTO Science)에 넣고 산소 플라즈마 처리(oxygen plasma treatment)를 통해 접착시켜 심장칩을 제작하였다.
접착된 심장칩과 슬라이드글라스를 35mm 페트리 디쉬(petri dish)에 넣고, 플라즈마 처리에 의한 접착력을 단단하게 하기 위해 80℃로 가열된 핫플레이트(hot plate) 위에서 30분 동안 열을 가한 후 추후 분리 주입을 위한 후처리 공정을 80℃ 오븐에서 48시간 동안 유지하였다. 이 같은 후처리 공정은 심근세포 채널에만 심근세포 혼합물을 선택적으로 주입하기 위하여 수행하였다.
상기와 같이 제작된 심장칩의 전체 크기는 가로 19mm 및 세로 19mm 이고, 칩 내 모든 채널 미세구조의 높이는 50㎛이며, 심근세포 채널의 폭 사이즈는 60㎛임을 확인하였다. 상기 심근세포 채널의 폭은 생체 내 심근세포의 직경인 약 20㎛의 3배 정도의 크기이며 심근세포를 둘러싸고 있는 근내막과 여러 가닥으로 길게 이어지는 심근섬유 (muscle fiber)와 유사한 형태로 구현하기 위해 디자인하였다.
심근세포 채널의 유출구(outlet) 방향에 위치한 미세 둑 구조물(micro-weir)은 상기 채널 중간에 가로 20㎛ 및 세로 20㎛ 크기의 차단기둥과 주입 역방향의 사선형태의 채널 표면으로 구성되도록 구비하고, 주입되는 심근세포와 하이드로젤을 포함하는 심근세포 혼합물이 잔류물 유출구쪽으로 빠져나가지 않고 채널 내에 누적되게끔 디자인 하였다. 상기 미세 둑 구조물은 심근세포가 누출될 수 있는 예외의 상황을 예방하고 재현성을 확보하기 위하여 2번 반복구조로 구성하였다.
심근세포 채널과 배양액 채널 사이에 존재하는 미세 기둥 구조물(micro-post)은 모서리가 둥근 직사각형 형태로 디자인하였는데, 이는 심근세포 채널에 심근세포 혼합물을 주입할 때 미세기둥의 둥근 모서리가 시작되는 부분에서 경계가 형성되게끔 유도하고, 이와 유사하게 배양액 채널에 배양액만을 주입할 때 동일한 위치에 경계 형성을 유도하였다. 이에 따라, 각 심근세포 채널과 배양액 채널 사이에 빈 간격(gap)이 형성되어, 심근세포 혼합물과 배양액이 용이하게 주입되도록 디자인하였다. 상기 미세 기둥 구조물의 사이즈는 가로 60㎛ 및 세로 50㎛이고, 각 미세 기둥 구조물 사이의 간격은 20㎛가 되도록 디자인 하였다. 미세 기둥 구조물의 사이즈를 가로 60㎛ 및 세로 50㎛로 설정 한 이유는, 가로는 미세 기둥 구조물의 세로 사이즈보다는 크게 하면서도 최대한 짧게 배양액의 흐름을 방해하지 않고 충분히 심근세포 채널로 유입되도록 하기 위함이며, 세로는 경계를 이루는 거리를 충분히 하여 심근세포 채널과 배양액 채널 사이의 빈 간격(gap)이 재현성있게 형성되게 하도록 디자인하였다. 또한, 미세 기둥 구조물 사이의 간격을 20㎛으로 설정한 이유는 심근세포 채널의 폭 사이즈인 60㎛와, 최소 3:1의 비율이 되도록 디자인하여, 심근세포 혼합물과 배양액의 주입을 원활하게 하였다.
아울러, 배양액 채널의 폭은 30㎛ 이며, 이는 생체 내 모세혈관의 직경인 10㎛의 3배 정도이고, 이를 심근세포 채널을 중심으로 양쪽 외각에 배치함으로써, 심근 섬유 의 사이사이에 위치하고 있는 모세혈관들을 모방하고, 일정 조건에서 배양액이 미세 기둥 구조물 사이를 통과하여 근내막을 모방한 하이드로젤에 감싸져 있는 심근세포에 영양분이 도달할 수 있도록 디자인 하였다. 상기 심근세포 혼합물을 주입하는 심근세포 유입구와 잔류물 유출구의 지름은 각각 1.2mm가 되도록 디자인 하였고, 배양액 공급 챔버 및 배양액 회수 챔버의 지름은 8mm가 되도록 디자인 하였다.
실시예 3: 심근세포를 포함하는 심장칩을 이용한 약물의 효능 및 독성 평가
실시예 3-1: 심장칩의 기능 평가
상기 실시예 2에서 제작한 본 발명의 심장칩이 정상적으로 기능을 수행하는지를 평가하였다.
대략적으로, 붉은색 및 노란색 식용색소를 적절한 농도 및 점도(원액의 10배 희석)로 설정하여 붉은색 식용색소 용액을 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕ 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 식용색소용액을 채운 다음, 나머지 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에도 각각 200㎕을 로딩하여 각 챔버간에 붉은색소 용액의 흐름이 연결되도록 하였다. 이때, 미세 기둥 구조물의 배양액 채널 쪽 방향으로 둥그런 모서리가 시작되는 부분에 소수성에 의해 배지가 경계를 이루는 것을 확인하였다. 이 후 노란색 식용색소용액을 주사기 펌프(syringe pump, NE-1000, NEWERA)를 이용하여 30㎕/ min의 속도로 심근세포 채널에 주입하였다(도 6).
도 6은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 심장칩의 실제 사진과 칩 내부의 각 채널 내로 식용 색소를 주입한 결과를 나타내는 부분 확대사진이다.
도 6에서 보듯이, 미세 기둥 구조물의 심근세포 채널 쪽 방향으로 둥그런 모서리가 시작되는 부분에 표면장력에 의해 노란색소용액이 경계를 이루는 것을 확인함으로써, 성공적으로 선택적 분리 주입되었음을 확인하였다.
실시예 3-2: 생체유사환경 구축
먼저, 상기 실시예 2에서 제작한 본 발명의 심장칩에 포함된 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕의 배양액을 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 배양액을 채운 다음, 나머지 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에도 각각 200㎕의 배양액을 로딩하여 각 챔버간에 배양액의 흐름이 연결되도록 하였다. 이때, 미세 기둥 구조물의 배양액 채널 쪽 방향으로 둥그런 모서리가 시작되는 부분에 표면장력에 의해 배지가 경계를 이루는 것을 확인하였다. 추가적으로, 심근세포 유입구에 파이펫을 이용하여 심근세포 혼합물(2 x 106개 /2㎕의 비율로 제작 후 여러 개 칩에 주입)을 로딩하고, 주사기 펌프(syringe pump, NE-1000, NEWERA)를 이용하여 30㎕/ min의 속도로 심근세포 채널에 주입하였다. 이번에는, 미세 기둥 구조물의 심근세포 채널 쪽 방향으로 둥그런 모서리가 시작되는 부분에 표면장력에 의해 심근세포 혼합물이 경계를 이루는 것을 확인함으로써, 심근세포 혼합물과 배양액이 각각 성공적으로 분리 주입되었음을 확인하였다.
이어, 주입된 심근세포 혼합물에 포함된 하이드로젤을 경화시켜서, 심근세포 채널 내에 심근세포를 고정시켰다. 상기 하이드로젤이 경화된 심장칩에서 미세 기둥 구조물을 중심으로 형성된 간격(gap)은 일시적으로 형성됨에 따라 실온에서 자연스럽게 사라지며, 심장칩 내부에 형성된 모든 간격이 사라지게 되면 인큐베이터에서 심근세포를 배양하였다. 배양 2일까지 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 모두 200㎕의 배양액을 로딩함으로써, 배지의 흐름을 최소화하여 심근세포가 새로운 심장칩 내 환경에서 적응할 수 있는 시간을 부여하였고, 이후 배양 7일까지는 배양액 공급 챔버에는 200㎕의 배양액을 로딩하고, 배양액 회수 챔버에는 150㎕의 배양액을 로딩하여 배지의 높낮이 차이를 줌으로써 중력에 의해 배지흐름이 발생하도록 유도하였다. 상기 배양액은 매일 신선한 배양액으로 교체하여 지속적인 배지흐름과 신선한 영양분을 제공하였고, 배지교체 시 각 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 있는 기존에 있던 배양액을 제거함으로써 노폐물을 제거하면서 배양하였다.
한편, 상기 심장칩 내 심근세포의 박동은 빠르면 배양 1~2일쯤에 발생하기 시작하는데, 배양시간이 지나면서 심근박동 수는 증가하고, 적당한 1분 내 심근박동수(beat per minute, BPM)를 기준으로 최적 배양기간을 7일로 설정하였다.
실시예 3-3: 약물의 효능 및 독성 평가
상기 실시예 3-2를 통해 생체유사환경이 조성된 본 발명의 심장칩의 배양액 공급 챔버에 심근박동수에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 약물인 이소프로테레놀(isoproterenol)과 니페디핀(nifedipine)을 각기 다른 농도로 처리하였고, 이에 따른 변화를 광학현미경으로 관찰하고, 심근 세포의 박동수 및 박동 간격을 측정한 다음, 이를 분석하였다(도 7a 및 7b).
먼저, 도 7a에서 보듯이, 이소프로테레놀을 처리하기 전 1분당 심근박동수(bpm)는 약 40~50 정도로 약간 서맥 상태를 나타내었다. 약물의 농도는 1, 5, 10 μM로 총 3가지 농도를 처리하였고, 1시간 간격으로 총 12시간 동안 관찰하였을 때, 모든 농도에의 전체 적인 경향은 약물 처리 후 박동수가 증가하고 최고 박동수에서 시간이 흐를수록 박동수가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 1μM의 농도는 상대적으로 낮은 농도의 약물처리였으므로 최고 박동수로 올라가는 시간 3시간으로 좀 더 오래 걸리고, 이 후 박동수가 천천히 그리고 정상 박동수 수준까지만 감소하는 것을 봐서는 효능 및 독성도 상대적으로 낮은 상태임을 확인할 수 있었다. 5μM의 농도는 1μM의 농도와는 다르게 최고 박동수까지 증가하는 시간이 3시간에서 1시간으로 단축되었고, 이 후 박동수가 감소하는 폭도 훨씬 크며 최종적으로 감소하고 유지되는 박동수도 약 60정도에서 45까지 더 낮은 상태를 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 10μM의 농도는 5μM의 농도와는 마찬가지고 최고 박동수 수준까지 증가하는 시간이 1시간으로 매우 빨랐으며, 5μM의 농도와는 다르게 처리 5시간까지 높은 박동수를 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 이 후 박동수가 감소하는 폭은 5μM만큼 이나 크지만 전반적으로 5μM 처리조건보다 박동수가 높은 것을 관찰할 수 있는데, 이는 높은 농도에서는 약물의 효과를 더 오랫동안 지속시키기 때문이라고 해석 되었다. 최종적으로 박동수는 약 40까지 지속적으로 감소를 하고 있으며 처리 후 12시간쯤에는 박동의 간격이 일정하지 않는 부정맥의 현상도 확실하게 관찰되었다.
따라서, 심근세포가 이소프로테레놀의 효능에 의해서 심근박동수가 증가하나 최대 심근박동수를 기록한 후의 약물처리 시간을 오래하였을 때 동 약물의 독성에 의해 세포기능 감소로 오히려 심근박동수가 감소되는 것을 확인 할 수 있었으며, 이는 약물의 농도에 비례하여 효능 및 독성이 관찰됨을 확인할 수 있었다.
다음으로, 도 7b에서 보듯이, 니페디핀을 처리하기 전 1분당 심근박동수(bpm) 역시 약 40 내지 50 정도로 약간 서맥 상태이었다. 전체적인 경향은 1, 5, 10μM의 농도에서 약물 처리 후 약물의 효능에 의해 동일하게 1시간만에 박동이 사라졌다가 그 이후부터는 1μM에서는 다시 박동 수 및 세기가 회복되어 이 상태를 유지함을 확인할 수 있었으며, 5μM에서 역시 다시 박동 수 및 세기가 회복되어 이 상태를 유지하였지만 8시간 째 돌연 박동이 멈추게 되고, 10μM에서는 다시 박동 수 및 세기가 회복되지 않음을 확인할 수 있었다. 1μM의 농도는 상대적으로 낮은 농도의 약물처리였으므로 독성이 약해 박동을 회복함과 동시에 이를 유지할 수 있었던 것으로 예상되며, 5μM의 농도 역시 10μM보다 상대적으로 낮은 농도의 약물처리였으므로 독성이 약해 박동을 회복할 수 있었지만 이를 유지하기에는 독성이 강해 돌연 박동이 사라진 것으로 해석되며, 10μM의 농도는 워낙 독성이 강해 심근박동이 회복되지 않았던 것으로 판단되었다.
따라서, 니페디핀 역시 농도에 비례하여 약물 효능 및 독성이 관찰됨을 확인할 수 있는 결과라 할 수 있었다.
실시예 4: 심근세포와 간암세포를 포함하는 심장칩을 이용한 약물의 효능 및 독성 평가
실시예 4-1: 간암세포의 배양
상기 실시예 2에서 제작한 본 발명의 심장칩의 배양액 공급 챔버에 간암세포(HepG2)를 배양 하였다. 대략적으로, 간암세포를 로딩하기 이전에 배양할 공간에 마트리젤(matrigel)을 100㎕을 로딩하고, 인큐베이터에서 30분 동안 코팅을 수행한 다음, NEXEL사의 Cardiosight-S 배지를 150㎕을 로딩한 뒤 추가적으로 간암세포(5 x 104개)를 로딩하여 2일 정도 배양하였다.
간암세포가 배양된 후, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 생체유사환경을 구출하였다(도 8).
실시예 4-2: 약물의 효능 및 독성 평가
상기 실시예 4-1을 통해 생체유사환경이 조성되고, 간암세포와 심근세포가 공동으로 배양된 본 발명의 심장칩의 배양액 공급 챔버(간암세포)에 5μM의 이소프로테레놀(isoproterenol)을 처리하고, 이에 따른 변화를 광학현미경으로 관찰하고, 심근 세포의 박동수 및 박동 간격을 측정한 다음, 이를 분석하였다(도 9).
도 9에서 보듯이, 간암세포 유무에 따라 약물을 처리하기 전부터 심근박동수의 차이가 관찰되었다. 간암세포와 공동배양 시 하지 않을 경우 보다 심근박동수가 약 2.5배 높았다. 이소프로테레놀을 처리하고 1시간 간격으로 6시간 동안 관찰하였을 때, 1시간 후 두 개의 조건 모두 심근 박동이 크게 증가하였다. 다만 간암세포를 공동배양 할 경우 그 증가 폭이 상대적으로 높았으며 높아진 박동 수를 유지하는 측면에서는 오히려 간암세포가 없는 조건에서 더 긴 시간을 유지함 을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통하여 간세포와의 공동배양과 같은 생체모방 포인트에 따라 실험결과가 다르게 나올 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 간에 의한 약물대사가 적용된 약물 효능 및 독성평가 연구의 필요성을 보여주는 것으로 분석되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[부호의 설명]
1 : PDMS 기반 미세유체 소자
2 : 슬라이드 글라스
3 : 배양액 공급 챔버
4 : 배양액 회수 챔버
5 : 심근세포 유입구
6 : 잔류물 유출구
7 : 배양액 채널
8 : 심근세포 채널
9 : 배양액 채널
10 : 미세 기둥 구조물
11 : 미세 둑 구조물

Claims (24)

  1. (a) 배양액 공급 챔버; 배양액 회수 챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부; 및
    (b) 일 측단에 구비된 심근세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 잔류물 유출구; 및, 상기 심근세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 구비되고, 상기 잔류물 유출구와의 연통부에 미세 둑 구조물이 구비되며, 상기 배양액 채널과 동일한 방향으로 연장되어 상기 배양액 채널의 일부와 연접하고, 상기 배양액 채널과의 연접부위에 배양액이 상호 유통할 수 있는 믹싱영역을 형성하는 심근세포 채널;을 포함하는 심근세포 공급부로 구성된, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 공급 챔버는 믹싱영역을 통해 심근세포 채널에 공급하기 위한 심근세포 배양용 배양액을 저장하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  3. 제1항에 있어서,
    약물의 효능 및 독성 평가를 위하여, 상기 배양액 공급 챔버에서 간세포를 추가로 배양하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널은 상기 배양액 공급 챔버로부터 배양액 회수 챔버로 배양액이 유통하는 경로인 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 심근세포 유입구는 심근세포 채널에 공급하기 위한 심근세포 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 심근세포 혼합물은 심근세포 및 심근세포의 유통과 고정을 보조하는 하이드로젤을 포함하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 심근세포 채널은 심근세포 유입구를 통해 공급된 심근세포 혼합물에 포함된 심근세포가 정렬하여 고정되고, 고정된 심근세포를 배양하는 배양용기로서의 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 심근세포의 고정은 심근세포 혼합물에 포함된 하이드로젤의 경화에 의해 수행되는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 심근세포의 배양은 믹싱영역을 통해 배양액 채널로부터 공급된 배양액이 심근세포에 공급되어 수행되는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 미세 둑 구조물은 차단기둥과 역방향 사선형태의 채널 표면으로 구성되어, 심근세포 채널에 정렬된 심근세포가 고정되기 전에 잔류물 유출구로 이동하는 것을 방지하는 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 잔류물 유출구는 심근세포 채널에 고정된 심근세포를 배양하면서 상기 심근세포로부터 생성된 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 믹싱영역은 배양액 채널의 일부, 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 심근세포 채널의 일부, 상기 각 채널의 연접부에 형성된 부분 차단부재로 구성되는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 부분 차단부재는, 이격되어 각 채널의 연장방향을 따라서 일렬로 배치된 미세 기둥 구조물인 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 미세 기둥 구조물은, 그의 이격된 영역을 통해, 배양액 채널의 일부영역과 상기 배양액 채널의 일부와 연접한 심근세포 채널의 일부영역 사이로 배양액의 상호 교류를 허용하는 역할을 수행하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 심장칩은 하나의 배양액 공급부와 하나의 심근세포 공급부를 포함하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 심장칩은 복수개의 배양액 공급부와 하나의 심근세포 공급부를 포함하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 심장칩은 하나의 배양액 공급부와 복수개의 심근세포 공급부를 포함하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 심장칩은 복수개의 배양액 공급부와 복수개의 심근세포 공급부를 포함하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  19. 제1항에 있어서,
    두 개의 배양액 공급 챔버(3), 두 개의 배양액 회수 챔버(4), 두 개의 배양액 채널(7 및 9), 한 개의 심근세포 유입구(5), 한 개의 잔류물 유출구(6) 및 상기 두 개의 배양액 채널(7 및 9) 사이에 위치하고, 일부가 상기 각 배양액 채널의 일부와 연접하며, 상기 배양액 채널과의 연접부에 각 채널의 연장방향을 따라서 이격되어 일렬로 배치된 복수개의 미세 기둥 구조물(10)을 포함하고, 잔류물 유출구(6)와의 연통부에 미세 둑 구조물(11)이 구비된 심근세포 채널(8)을 포함하는 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널의 폭은 20 내지 40㎛ 이고, 심근세포 채널의 폭은 50 내지 70㎛ 이며, 미세 둑 구조물에 포함된 차단기둥은 가로 5 내지 30㎛ 및 세로 5 내지 30㎛ 이고, 미세 기둥 구조물은 가로 50 내지 70㎛ 및 세로 40 내지 60㎛ 이며, 미세 기둥 구조물간의 이격 길이는 10 내지 30㎛인 것인, 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩.
  21. (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 심근세포의 박동수를 측정하는 단계를 포함하는, 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  22. (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (d) 상기 배양된 심근세포의 박동수를 측정하는 단계를 포함하는, 심근세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  23. (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심근내막 모방 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 심근세포의 박동여부 및 손상여부를 평가하는 단계를 포함하는, 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
  24. (a) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 약물의 효능 및 독성 평가용 심장칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 약물의 효능 및 독성 평가용 심장칩에 포함된 심근세포 채널에 포함된 심근세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (d) 상기 배양된 심근세포의 박동여부 및 손상여부를 평가하는 단계를 포함하는, 심근세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023073276A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Probiont Oy Microfluidic chip
WO2023083455A1 (en) * 2021-11-11 2023-05-19 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Microfluidic devices

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230110153A (ko) * 2022-01-14 2023-07-21 주식회사 휴먼에이스 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도
KR20230110031A (ko) 2022-01-14 2023-07-21 주식회사 휴먼에이스 콜라겐층이 구비된 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도
WO2024025177A1 (ko) * 2022-07-25 2024-02-01 주식회사 휴먼에이스 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013061849A1 (ja) * 2011-10-28 2013-05-02 国立大学法人東京医科歯科大学 心筋毒性検査および心筋細胞評価のための方法および装置
KR20130131326A (ko) * 2010-09-29 2013-12-03 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 세포 상호작용의 고 처리량 조사를 위한 장치
KR101426056B1 (ko) * 2013-04-08 2014-08-01 서울대학교산학협력단 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 혈관 투과성 측정 방법
KR20180055894A (ko) * 2015-10-02 2018-05-25 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 자발적으로 박동하는 심장 오르가노이드 구조체 및 그를 포함하는 통합된 바디-온-칩 장치
KR101916393B1 (ko) * 2016-09-08 2018-11-08 한국화학연구원 인간 다능성 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 in vitro 심장독성 평가 기술

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101644635B1 (ko) 2014-05-30 2016-08-03 서울대학교산학협력단 혈관형성을 위한 미세유체칩 및 이를 이용한 암전이 분석방법
KR101964918B1 (ko) 2017-10-17 2019-04-02 연세대학교 산학협력단 심장 전압 지도와 전위 활성화 지도에 기반한 심장 모델 생성 장치 및 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130131326A (ko) * 2010-09-29 2013-12-03 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 세포 상호작용의 고 처리량 조사를 위한 장치
WO2013061849A1 (ja) * 2011-10-28 2013-05-02 国立大学法人東京医科歯科大学 心筋毒性検査および心筋細胞評価のための方法および装置
KR101426056B1 (ko) * 2013-04-08 2014-08-01 서울대학교산학협력단 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 혈관 투과성 측정 방법
KR20180055894A (ko) * 2015-10-02 2018-05-25 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 자발적으로 박동하는 심장 오르가노이드 구조체 및 그를 포함하는 통합된 바디-온-칩 장치
KR101916393B1 (ko) * 2016-09-08 2018-11-08 한국화학연구원 인간 다능성 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 in vitro 심장독성 평가 기술

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023073276A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Probiont Oy Microfluidic chip
WO2023083455A1 (en) * 2021-11-11 2023-05-19 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Microfluidic devices

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