WO2017078190A1 - 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치 및 이를 이용한 해마 신경 회로 재건 방법 - Google Patents

해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치 및 이를 이용한 해마 신경 회로 재건 방법 Download PDF

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WO2017078190A1
WO2017078190A1 PCT/KR2015/011761 KR2015011761W WO2017078190A1 WO 2017078190 A1 WO2017078190 A1 WO 2017078190A1 KR 2015011761 W KR2015011761 W KR 2015011761W WO 2017078190 A1 WO2017078190 A1 WO 2017078190A1
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WO
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microfluidic channel
channel device
cell culture
neural circuit
substrate
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PCT/KR2015/011761
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오용석
김삼환
성룡
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재단법인대구경북과학기술원
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/08—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a stream of discrete samples flowing along a tube system, e.g. flow injection analysis

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic channel device for hippocampal neural circuit reconstruction and a hippocampal neural circuit reconstruction method using the same.
  • brain research is a core technology field for the prevention and treatment of cerebral neurological diseases, which is increasing with the aging of society and the complexity of society, and is a human challenge to overcome for human health and happy life.
  • the hippocampus is also closely related to the prefrontal cortex and subcortical areas such as the nucleus and tonsils, which can be explained by relating cognitive dysfunction and emotional / behavioral disorders associated with each site.
  • cognitive dysfunction of schizophrenic patients is deeply related to the social and occupational inability of patients and that atypical antipsychotic drugs are more effective in improving the cognitive function of schizophrenic patients than conventional antipsychotic drugs. It suggests that the study of action is very important.
  • microfluidic channels Most neurosynthesis studies using microfluidic channels are used to observe the formation and characteristics of neurosynthesis by controlling fluid flow by controlling fluid flow in time and space within a microscale channel or by making a difference in fluid pressure using the structure of the channel. Is in progress.
  • microfluidic channel devices for the formation of neurosynaptic in vitro has been reported, but the reported microfluidic channel devices are closed in the upper region of the cell culture channel and are not smoothly supplied with oxygen and nutrients. There is a disadvantage that the reproducibility is lower than the cell experiments performed by.
  • the present inventors completed the present invention by modifying the structure of the conventional microfluidic channel device and opening the upper region of the cell culture channel to increase the reproducibility of cell experiments and devise a microfluidic channel device design suitable for reconstruction of the hippocampal neural circuit. .
  • Microfluidic channel elements stacked on the substrate
  • microfluidic channel device The microfluidic channel device,
  • a plurality of cell culture channels for cell culture A plurality of cell culture channels for cell culture
  • the micropath is formed connecting at least two of the plurality of cell culture channels.
  • Another object of the present invention is to provide a method for rebuilding the neural circuits of the entire hippocampus using the microfluidic channel device.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for partially reconstructing each region of the hippocampal neural circuit using the microfluidic channel device.
  • Microfluidic channel elements stacked on the substrate
  • microfluidic channel device The microfluidic channel device,
  • a plurality of cell culture channels for cell culture A plurality of cell culture channels for cell culture
  • a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuits, wherein a micropath is formed to connect at least two of the plurality of cell culture channels.
  • the substrate may be made of a cover glass (cover glass).
  • the layer laminated on the substrate may be made of polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the substrate and the microfluidic channel device may be bonded to each other by an oxygen plasma treatment.
  • the microfluidic channel device may be stacked on a substrate without a bonding process.
  • the micropath may be formed of a plurality of micropaths separated into a plurality of partitions.
  • the plurality of micro-path is a space through which the projections of the nerve cells pass.
  • the micro-path may have one inlet and the other outlet having the same width.
  • the micro-path may have a wide inlet and a narrow outlet on the other side.
  • the substrate bonded to the lower cell culture channel of the microfluidic channel device is Poly L Lysine (PLL), Poly D Lysine (PDL), laminin, collagen, fibrin, fibronectin and It may be coated with any one or more neuronal affinity material selected from the group consisting of Matrigel.
  • the bottom of the cell culture space may be further formed with a microstructure through the surface treatment.
  • a neural circuit reconstruction method of the entire hippocampus using the microfluidic channel device described above is provided.
  • the microfluidic channel device of the present invention modifies the structure of the conventional microfluidic channel device in which the upper region of the conventional cell culture space is closed and oxygen and mass transfer are not made smoothly, thereby opening the upper region of the cell culture space.
  • the reproducibility of the experiment can be improved.
  • microfluidic channel device of the present invention has a large number of cell culture channels, and thus can be used as a useful platform for brain research that is being actively progressed recently. It is useful for rebuilding neural circuits that are connected to each other through.
  • microfluidic channel device of the present invention is suitable for studying the morphology, differentiation and growth characteristics of neurons as well as neurosynthesis formation. After formation of hippocampal neural circuits, calcium imaging, electrophysiology, immunostaining and Western blot It is useful for analyzing the characteristics of neural communities.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a cross-sectional perspective view showing a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a cross-sectional perspective view showing the micropath of the microfluidic channel device for reconstruction of the hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a bottom perspective view of the microfluidic channel device for reconstruction of the hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a conceptual diagram showing the growth of neurites of cells through the micropath of the microfluidic channel device for reconstruction of the hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a cross-sectional perspective view showing a modified micropath of the microfluidic channel device for reconstruction of the hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a bottom perspective view showing a modified micropath of the microfluidic channel device for reconstruction of the hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view of a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to a modification of the present invention.
  • FIG. 10 is a plan view of a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a perspective view illustrating a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • the microfluidic channel device for reconstructing the hippocampal neural circuit may include a substrate 30 and a microfluidic channel element 10 stacked on the substrate 30.
  • the microfluidic channel device 10 includes a micropath connecting three cell culture channels 11a, 11b and 11c for cell culture and at least two of the plurality of cell culture channels 11a, 11b and 11c.
  • the portions 23a, 23b, 23c may be formed.
  • the substrate 30 is not limited thereto, but may be formed of, for example, a cover glass, and the microfluidic channel device 10 is not limited thereto, but may be formed of, for example, polydimethylsiloxane (PDMS). Can be.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the microfluidic channel device may be fabricated using PDMS, which is a transparent and biocompatible polymer material, for example, by forming a mold through a semiconductor process using photoresist and a silicon wafer as main materials.
  • PDMS transparent and biocompatible polymer material
  • the substrate 30 and the microfluidic channel element 10 may be bonded to each other by an oxygen plasma treatment.
  • the technique of bonding by oxygen plasma treatment has the advantage of easy bonding and strong bonding force.
  • the microfluidic channel device 10 may be stacked on the substrate 30 without the bonding process according to the purpose and need of the experiment.
  • the microfluidic channel device 10 stacked without the conjugation process may be separated from the cover glass at an appropriate time after culturing the cells, wherein the cells cultured on the cover glass are Western blot, real-time polymerase chain reaction, immunostaining, etc. It is possible to carry out further, which is useful for characterizing the cells or the formed neuropopulations.
  • the cell culture channels (11a, 11b, 11c) is a space for culturing the cells to the upper region is open can directly inject the cells through it and at the same time replace the culture medium.
  • the upper region of the cell culture channels (11a, 11b, 11c) is opened to facilitate the supply of oxygen and nutrients required for cell culture, thereby increasing the reproducibility of the cell experiment.
  • the shape of the cell culture channels (11a, 11b, 11c) may be a circle or polygon, the size and number of the cell culture channels (11a, 11b, 11c) may vary depending on the type and neural colonies to be tested. .
  • the substrate 30 bonded below the cell culture channels 11a, 11b, and 11c may be coated with a cell-friendly material to improve cell viability and persistence.
  • the cell affinity material is, for example, at least any one selected from the group consisting of Poly L Lysine (PLL), Poly D Lysine (PDL), laminin, collagen, fibrin, fibronectin and matrigel It may include one.
  • the substrate 30 bonded to the lower part of the cell culture channels 11a, 11b, and 11c of the microfluidic channel device 10 may further form a microstructure through surface treatment.
  • the microstructure is a micro nanostructure formed through a semiconductor process, for example, may be a fine rod.
  • the formed fine rods may serve to support the cells to help maintain and grow the cells.
  • FIG 3 is a cross-sectional perspective view showing a micropath of a hippocampal neural circuit reconstruction microfluidic channel device according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4 is a microfluidic channel device for hippocampal neural circuit reconstruction according to an embodiment of the present invention
  • 5 is a cross-sectional view of a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • the plurality of micropaths (15a, 15b 15c) of the microfluidic channel device 1 for reconstruction of the hippocampal neural circuit in accordance with an embodiment of the present invention is a cell culture channel (11a, 11b, 11c) In the space passing through the projections of the nerve cells cultured in, formed between the cell culture channels (11a, 11b, 11c) can be connected between at least two of the plurality of cell culture channels (11a, 11b, 11c).
  • the plurality of micropaths 15a, 15b, and 15c may be divided into a plurality of partitions 13a, 13b, and 13c.
  • the shape of the plurality of micro-paths (15a, 15b, 15c) may be in the form of a straight line, but is not limited to this, it may be a zigzag or curved form.
  • the length and width of the micropaths (15a, 15b, 15c) can also be adjusted in various ways depending on the type and characteristics of the neurons used.
  • the width of the micropath can be controlled within the general thickness range of the neurites, and is not particularly limited as long as the neurites can pass therethrough.
  • the three cell culture channels 11a, 11b, and 11c are arranged in a triangular shape, and the plurality of micropaths 15a, 15b, and 15c formed between the cell culture channels 11a, 11b, and 11c are partition walls 13a. , 13b and 13c are formed at regular intervals, and the micropaths 15a, 15b and 15c and the partitions 13a, 13b and 13c form the micropaths 23a, 23b and 23c.
  • the micro passage portion 23a may be formed between the cell culture channel 11a and the cell culture channel 11b, and the micro passage portion 23b between the cell culture channel 11b and the cell culture channel 11c. ) May be formed, and the microchannel 23c may be formed between the cell culture channel 11c and the cell culture channel 11a.
  • At least one of the three micropaths 23a, 23b, and 23c may be closed according to the purpose of the experiment.
  • the micro-paths (23a, 23b, 23c) is formed in the shape of the Y-crossing in the center and the junction 21 formed in the center of the three passages cross each of the three cell culture channels (11a, 11b, In step 11c), the nerve cell cultivation is prevented from meeting in one place.
  • both ends of each of the micropaths 15a, 15b and 15c have one inlet 17a, 17b and 17c and the other outlet 19a, 19b and 19c.
  • both ends of the micropath 15a formed between the cell culture channel 11a and the cell culture channel 11b have one inlet 17a and the other outlet 19a, and the cell culture channel 11b and the cell.
  • Both ends of the micropath 15b formed between the culture channels 11c have one inlet 17b and the other outlet 19b, and the micropaths formed between the cell culture channel 11c and the cell culture channel 11a ( Both ends of 15c have one inlet 17c and the other outlet 19c.
  • the width of the inlet (17a, 17b, 17c) and the outlet (19a, 19b, 19c) of the micro-path may be the same.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram illustrating neural protrusions of nerve cells 3 growing through the micropaths 15a, 15b, and 15c of the microfluidic channel device for reconstruction of the hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a perspective view showing a modification of the hippocampal neural circuit reconstruction microfluidic channel device according to an embodiment of the present invention
  • Figure 8 is a microfluidic channel device for hippocampal neural circuit reconstruction according to an embodiment of the present invention
  • 9 is a cross-sectional view illustrating a modified example of a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to an embodiment of the present invention.
  • the widths of the one inlets 16a, 16b, and 16c and the other outlets 18a, 18b, and 18c of the micropaths 15a, 15b, and 15c are modified.
  • the inlets 16a, 16b, 16c, the outlets 18a, 18b, 18c, the micropaths 15a, 15b, 15c and the partitions 14a, 14b, 14c of the micropaths 15a, 15b, 15c are formed.
  • the remaining portions except for the micro passage portions 24a, 24b, and 24c are the same as those of FIG. 3, and thus description thereof will be omitted.
  • a modified example of the microfluidic channel device 1 for reconstruction of the hippocampal neural circuit may include a plurality of microchannels 15a and 15b formed in the microfluidic channel element 10.
  • 15c are divided into partitions 14a and 14b 14c and are formed at regular intervals, and both ends of each of the micro-passages 15 have one inlet 16a, 16b, and 16c and the other outlet 18a, 18b, and 18c.
  • both ends of the micropath 15a formed between the cell culture channel 11a and the cell culture channel 11b have one inlet 16a and the other outlet 18a, and the cell culture channel 11b and the cell.
  • Both ends of the micropath 15b formed between the culture channels 11c have one inlet 16b and the other outlet 18b, and the microchannels formed between the cell culture channel 11c and the cell culture channel 11a ( Both ends of 15c have one inlet 16c and the other outlet 18c.
  • the width of the one inlet (16a, 16b, 16c) of the micro-path for the unidirectional neurites growth may be wider than the width of the other outlet (18a, 18b, 18c).
  • the width of the inlets 16a, 16b, and 16c of the micropaths 15a, 15b, and 15c may be increased to increase the growth probability of neurites through the micropaths 15a, 15b, and 15c. The higher the probability of neurites growth through 15b and 15c), the higher the probability of neural junctions with the cell populations present in the opposite cell culture channels.
  • micropaths 15a, 15b, and 15c and the partition walls 14a, 14b, and 14c form micropaths 24a, 24b, and 24c, and three micropaths 24a, 24b, 24c) is formed in a Y-shape that intersects at the center as shown in the micropath portions 23a, 23b, and 23c of FIG.
  • FIG. 10 is a plan view of a microfluidic channel device for rebuilding hippocampal neural circuit according to another embodiment of the present invention.
  • the microfluidic channel reconstruction device for hippocampal neural circuit reconstruction includes five cell culture channels 12a, 12b, 12c, 12d, and 12e and four micropaths in the microfluidic channel device 10. Except that the portions 25a, 25b, 25c, and 25d are formed, and the intersection portion 21 is not formed, all of the microfluidic channel devices shown in FIGS. 1 to 9 may include the same. Therefore, description of the same structure is abbreviate
  • the microfluidic channel device 1 for reconstructing the hippocampal neural circuit of the present invention includes five cell culture channels 12a, 12b, 12c, 12d, and 12e arranged in a pentagonal shape and the five cell cultures.
  • the microfluidic channel device 10 may include a microfluidic channel part 25a, 25b, 25c, and 25d connecting at least two of the channels 12a, 12b, 12c, 12d, and 12e.
  • the cell culture channels 12a, 12b, 12c, 12d, and 12e may be circular, but are not limited thereto and may be polygonal polygons.
  • the micro channel 25a may be formed between the cell culture channel 12a and the cell culture channel 12b, and the micro channel 25b is provided between the cell culture channel 12b and the cell culture channel 12c. It may be formed, the micropath portion 25c may be formed between the cell culture channel (12c) and the cell culture channel (12d), the micropath portion between the cell culture channel (12d) and the cell culture channel (12e) 25d can be formed. However, a micropath may not be formed between the cell culture channel 12e and the cell culture channel 12a and may be completely separated from each other.
  • the four micropath parts 25a, 25b, 25c, and 25d do not contact each other unlike the micropath parts 23a, 23b, and 23c of FIG. Do not.
  • the hippocampus consists of dentate gyrus (DG), Ammon's horn or hippocampus proper (CA1-CA4), and subiculum.
  • DG dentate gyrus
  • CA1-CA4 ammon's horn or hippocampus proper
  • Various information from the cerebral cortex reaches the upper layer (EC1, EC2 and EC3) of the enterorhinal cortex (EC) directly or indirectly, which in turn passes through the perforant pathway. layer) to the CA3 region.
  • the axon of the DG granules (moson fiber) is connected to the stratum lucidum-radiatum of CA3, and the Schaffer collateral from the vertebral cells of the CA3 region is the stratum radiatum of CA1.
  • EC5 deeper EC
  • the microfluidic channel device for hippocampal neural circuit reconstruction of the present invention can reconstruct the above-described hippocampal neural circuits in part or in whole to observe its characteristics.
  • microfluidic channel device of the present invention for reconstructing the hippocampal neural circuit can be prepared by the following steps:
  • the substrate may be a cover glass
  • the microfluidic channel element formed with a plurality of cell culture channels and the micro-path portion connecting each cell culture channel in the plurality of cell culture channels may be made of PDMS have.
  • the neuronal affinity material is selected from the group consisting of Poly L Lysine (PLL), Poly D Lysine (PDL), laminin, collagen, fibrin, fibronectin and matrigel. Any one or more of which may be, for example, the substrate may be coated with 1 mg / ml Poly L Lysine (PLL), but is not limited thereto.
  • the method for reconstructing the hippocampal neural circuit using the microfluidic channel device prepared through the above steps includes the following steps:
  • step (e) 4x10 6 cells / ml to 6x10 6 cells / ml may be injected into the cell culture space, and further, cells may be selectively injected into at least one cell culture channel according to the experimental purpose.
  • the cell culture solution may be replaced every two to three days while the cell culture is carried out in the step (e).
  • the size and number of cell culture spaces of the microfluidic channel device used in the reconstruction method of the hippocampal neural circuit may vary according to the neural colony and type to be tested.
  • microfluidic channel apparatus 1 having three or five cell culture spaces as shown in FIGS. 1 to 9 or 10 may be used to partially or completely reconstruct each region of the hippocampus. .
  • the microfluidic channel device including five cell culture channels 12a, 12b, 12c, 12d, and 12e as shown in FIG. 10 reconstructs neural circuits (EC2, DG, CA3, CA1 and EC5) of the hippocampus. Can be used for
  • one cell culture channel can culture cells corresponding to one area, and EC2, DG, CA3, CA1 and each corresponding to each area of the hippocampus in five cell culture channels in the same order of neural circuits.
  • EC5 can be cultured in sequence.
  • cells in the EC2 region are in cell culture channel 12a
  • cells in the DG region are in cell culture channel 12b
  • cells in CA3 region are in cell culture channel 12c
  • cells in CA1 region are in cell culture channel.
  • the cells of the EC5 region can be cultured in order in the cell culture channel 12e.
  • Microfluidic channel devices including three cell culture channels (11a, 11b, 11c) as shown in Figures 1 to 9 can be used for partial neural circuit reconstruction of the hippocampus consisting of DG, CA3 and CA1, but is not limited thereto. According to the experimental purpose, each region constituting the neural circuit of the whole hippocampus can be partially selected and cultured, and the culturing method is applied in the same manner as the neural circuit reconstruction of the entire hippocampus.
  • a region of the hippocampus cultured in each cell culture channel can be selected.
  • three microchannels 23a, 23b, and 23c are formed between the three cell culture channels to connect the cell culture channels 11a, 11b, and 11c.
  • the microfluidic channel device in which one of the three microchannels 23a, 23b, and 23c of FIG. 3 is not formed or is closed may also be selectively used according to the purpose of the experiment.
  • immunospecific chemistry is used to identify proteins unique to each hippocampus or calcium imaging, electrophysiology.
  • experiments can be performed to confirm the function of neurons, such as designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD).
  • the microfluidic channel device of the present invention modifies the structure of the conventional microfluidic channel device in which the upper region of the conventional cell culture space is closed and oxygen and mass transfer are not made smoothly, thereby opening the upper region of the cell culture space.
  • the reproducibility of the experiment can be improved.
  • microfluidic channel device of the present invention has a large number of cell culture channels, and thus can be used as a useful platform for brain research that is being actively progressed recently. It is useful for rebuilding neural circuits that are connected to each other through.
  • microfluidic channel device of the present invention is suitable for studying the morphology, differentiation and growth characteristics of neurons as well as neurosynthesis formation. After formation of hippocampal neural circuits, calcium imaging, electrophysiology, immunostaining and Western blot It is useful for analyzing the characteristics of neural communities.

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Abstract

본 발명은 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치 및 이를 이용한 해마 신경 회로 재건 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치는 기판(30) 및 상기 기판(30)에 적층되는 미세유체채널 소자(10)를 포함할 수 있으며, 상기 미세유체채널 소자(10)에는 세포배양을 위한 세 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)과 상기 복수 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 중 적어도 둘 사이를 연결하는 미세통로부(23a, 23b, 23c)가 형성될 수 있다.

Description

해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치 및 이를 이용한 해마 신경 회로 재건 방법
본 출원은 2015년 11월 2일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2015-0153420호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치 및 이를 이용한 해마 신경 회로 재건 방법에 관한 것이다.
우리 몸의 컨트롤 타워 역할을 하는 가장 중요한 부위인 뇌는 전 세계적으로 연구가 활발하게 진행되고 있지만 아직 태동기에 있으며 연구의 중요성이 증대되고 있다. 또한 뇌 연구는 고령화 및 사회의 복잡화가 진행됨에 따라 증가하고 있는 뇌신경질환의 예방 및 치료를 위한 핵심 기술분야이며, 인간의 건강과 행복한 삶을 위해 극복해야 할 인류의 난제이다.
BT, IT, NT 등 다학제적인 차원에서 뇌를 이해하고자 하는 시도가 계속 이루어지고 있다. 뇌에는 약 천억 개의 신경세포가 존재하며 하나의 신경세포는 약 만개의 신경연접을 형성하여 다른 신경세포들과 신호를 주고받는다. 신경연접은 신경세포간의 신호전달에 있어 아주 중요한 역할을 담당하며 다양한 뇌 질환과도 관련이 있다.
1952년 로마에서 열린 1차 국제 신경병리학회에서 정신분열병에 대한 신경병리는 없다고 하였다. 그러나 해마의 기능적 이상이 정신분열병을 일으킬 수 있음이 제시되었고 이 후 동물 실험 및 임상 연구를 통해 정신분열병과 해마의 이상 소견과의 관련성을 지지하는 수많은 결과들이 보고되어 왔다. 해마가 정신분열병의 병인과 관련된 부위로서 관심을 받는 주 이유는 해마의 기능인 여과 기능의 이상 또는 기억과 관련된 정보 처리 기능의 이상이 정신분열병 환자에서 보이는 연상(사고)의 장애 또는 인지 기능 장애를 설명할 수 있는 모델로 사용될 수 있기 때문이다.
또한 해마는 전전두피질 및 측좌핵이나 편도와 같은 피질 하 부위와도 밀접하게 연결되어 있기 때문에 각 해당 부위와 관련되는 인지 기능 장애와 정서/행동 장애를 연관하여 설명할 수 있다. 특히 최근 정신분열병 환자의 인지 기능 장애가 환자의 사회적 직업적 무능력과 관련이 깊고 비전형 항정신병 약물이 기존 전형적 항정신병 약물에 비해 정신분열병 환자의 인지 기능 개선에 좀 더 효과적이라는 보고들은 항정신병 약물의 해마 내 작용에 대한 연구가 매우 중요함을 제시한다.
한편 신경연접을 연구하기 위해 다양한 방법이 개발되었으며 최근 미세유체채널을 이용하여 연구가 이루어지고 있다. 대부분 미세유체채널을 이용한 신경연접 연구는 마이크로 스케일의 채널 내부에 시·공간적으로 유체흐름을 조절하거나 채널의 구조물을 이용하여 유체압력의 차이를 만들어 물질 흐름을 조절하여 신경연접 형성 및 특성을 관찰하는 형태로 진행 중이다.
생체 외에서 신경연접을 형성시키기 위한 미세유체채널 장치의 제작이 보고된 바 있으나, 보고된 미세유체채널 장치는 세포배양 채널의 상부영역이 닫혀있어 산소 및 영양분 공급이 원활하게 이루어지지 않아 세포접시에 배양하여 수행되는 세포 실험에 비해 재현성이 떨어진다는 단점이 있다.
나아가, 미세유체채널 장치를 이용하여 뇌의 해마 신경 회로를 재건하기 위한 시도가 이루어지고 있는데, 여러 층 또한 여러 신경군집이 신경연접을 통해 형성되어 있는 뇌 해마 신경 회로의 특성상, 종래의 미세유체채널 장치를 이용한 복잡한 신경회로의 재현은 장치의 구조적 관점에서 한계가 있다.
따라서 생체 외 뇌의 해마 신경 회로 재현과 신경연접 형성 연구에 보다 적합한 미세유체채널 장치 디자인이의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 종래의 미세유체채널 장치의 구조를 변형하고 세포배양 채널의 상부영역을 개방함으로써 세포 실험의 재현성을 높이고 해마 신경 회로 재건에 적합한 미세유체채널 장치 디자인을 고안함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은,
기판(substrate); 및
상기 기판 상에 적층되는 미세유체채널 소자;를 포함하고,
상기 미세유체채널 소자에는,
세포배양을 위한 복수 개의 세포배양 채널; 및
상기 복수 개의 세포배양 채널 중 적어도 둘 사이를 연결하는 미세통로부가 형성된, 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세유체채널 장치를 이용하여 해마 전체의 신경 회로를 재건하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세유체채널 장치를 이용하여 해마 신경 회로의 각 영역을 부분적으로 재건하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은,
기판(substrate); 및
상기 기판 상에 적층되는 미세유체채널 소자;를 포함하고,
상기 미세유체채널 소자에는,
세포배양을 위한 복수 개의 세포배양 채널; 및
상기 복수 개의 세포배양 채널 중 적어도 둘 사이를 연결하는 미세통로부가 형성된, 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치를 제공한다.
일 측면에 따르면, 상기 기판은 커버 글라스(cover glass)로 이루어질 수 있다.
일 측면에 따르면, 상기 기판 상에 적층되는 층은 폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxane, PDMS)으로 이루어질 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 기판과 미세유체채널 소자는 산소 플라즈마 처리에 의해 서로 접합될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 미세유체채널 소자는 접합 처리 없이 기판상에 적층될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 미세통로부는 복수 개의 격벽으로 분리된 복수 개의 미세통로로 형성될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 복수 개의 미세통로는 신경세포의 돌기가 통과하는 공간이다.
일 측에 따르면, 상기 미세통로는 폭이 동일한 일측 입구와 타측 출구를 가질 수 있다.
일측에 따르면, 상기 미세통로는 폭이 넓은 일측 입구와 폭이 좁은 타측 출구를 가질 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 미세유체채널 소자의 세포배양 채널 하부에 접합된 기판은 폴리 L 리신(Poly L Lysine; PLL), 폴리 D 리신(Poly D Lysine; PDL), 라미닌, 콜라겐, 피브린, 피브로넥틴 및 마트리젤로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상의 신경세포 친화 물질로 코팅될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 세포 배양 공간의 바닥은 표면처리를 통해 미세 구조물이 추가로 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 전술한 미세유체채널 장치를 이용한 해마 전체의 신경 회로 재건 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전술한 미세유체채널 장치를 이용한 해마 신경 회로의 각 영역을 부분적으로 재건 방법을 제공한다.
본 발명의 미세유체채널 장치는 종래의 세포배양 공간의 상부영역이 닫혀있어 산소 및 물질이동이 원활하게 이루어지지 않았던 종래의 미세유체채널 장치의 구조를 변형하여 세포배양 공간의 상부영역을 개방함으로써 세포 실험의 재현성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 미세유체채널 장치는 다수의 세포배양 채널을 가지고 있어 최근 활발하게 진행되고 있는 뇌 연구에서 유용한 플랫폼으로 사용할 수 있고, 본 발명의 미세유체채널 장치를 이용하여 다양한 신경군집이 신경연접을 통해 서로 연결되어 있는 신경 회로를 재건하기에 유용하다.
나아가, 본 발명의 미세유체채널 장치는 신경연접 형성뿐만 아니라 신경세포의 형태, 분화 및 성장 특성 등을 연구하는데 적합하며, 해마 신경 회로가 형성된 후에는 칼슘이미징, 전기생리측정, 면역염색법 및 웨스턴 블랏 등을 통해 신경군집의 특성을 분석하는데 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치를 도시한 사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치를 도시한 단면 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 미세통로를 보여주는 단면 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 저면 사시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치 단면도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 미세통로를 통하여 세포의 신경돌기가 성장하는 것을 보여주는 개념도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 변형된 미세통로를 보여주는 단면 사시도이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 변형된 미세통로를 보여주는 저면 사시도이다.
도 9는 본 발명의 변형예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 단면도이다.
도 10은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 평면도이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치를 도시한 사시도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 단면을 도시한 단면 사시도이다.
도 1 및 2를 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치는 기판(30) 및 상기 기판(30)에 적층되는 미세유체채널 소자(10)를 포함할 수 있으며, 상기 미세유체채널 소자(10)에는 세포배양을 위한 세 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)과 상기 복수 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 중 적어도 둘 사이를 연결하는 미세통로부(23a, 23b, 23c)가 형성될 수 있다.
상기 기판(30)은 이로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 커버 글라스로 이루어질 수 있으며, 상기 미세유체채널 소자(10)는 이로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 이루어질 수 있다.
이때 상기 미세유체채널 소자는, 예를 들어 감광액과 실리콘 웨이퍼를 주 재료로 하여 반도체공정을 통해 몰드를 만들고 투명하며 생체 적합한 고분자 물질인 PDMS를 이용하여 제작될 수 있다.
상기 기판(30)과 미세유체채널 소자(10)는 산소 플라즈마 처리에 의해 서로 접합될 수 있다. 산소 플라즈마 처리에 의해 접합하는 기술은 접합이 간편하고 접합력이 강하다는 장점이 있다.
상기 미세유체채널 소자(10)는 실험의 목적과 필요에 따라 접합 처리 없이 기판(30) 상에 적층될 수 있다. 접합 처리 없이 적층된 미세유체채널 소자(10)는 세포를 배양한 후 적정 시간에 커버 글라스로부터 분리될 수 있으며, 이때 커버 글라스 상에 배양된 세포는 웨스턴 블랏, 실시간 중합 효소 연쇄반응, 면역염색법 등을 추가 실시하는 것이 가능하여 세포 또는 형성된 신경군집의 특성을 분석하는데 유용하다.
상기 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)은 세포를 배양할 수 있는 공간으로 상부영역이 개방되어 이를 통해 세포를 직접 주입할 수 있고 동시에 배양액을 교체할 수 있다.
또한 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)의 상부영역이 개방되어 세포배양 시 요구되는 산소 및 영양분의 공급이 원활하게 이루어져 세포 실험의 재현성을 높일 수 있다.
이때, 상기 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)의 형태는 원 또는 다각형일 수 있고, 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)의 크기와 개수는 실험하고자 하는 신경 군집 및 종류에 따라 달라질 수 있다.
배양하는 세포의 종류에 따라, 상기 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 하부에 접합된 기판(30)은 세포의 생존성과 지속성을 향상시키기 위해 세포 친화 물질로 코팅될 수 있다.
상기 세포 친화 물질은, 예를 들어, 폴리 L 리신(Poly L Lysine; PLL), 폴리 D 리신(Poly D Lysine; PDL), 라미닌, 콜라겐, 피브린, 피브로넥틴 및 마트리젤로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 미세유체채널 소자(10)의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 하부에 접합된 기판(30)은 표면처리를 통해 미세 구조물이 추가로 형성될 수 있다.
구체적으로, 상기 미세 구조물은 반도체공정을 통해 형성된 마이크로 나노 구조이며, 예를 들어 미세 막대일 수 있다. 형성된 미세 막대는 세포를 지지하는 역할을 하여 세포의 유지 및 성장에 도움을 줄 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 미세통로를 보여주는 단면 사시도이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 저면 사시도이며, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 단면도이다.
도 2 및 3을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치(1)의 복수 개의 미세통로(15a, 15b 15c)는 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)에서 배양된 신경세포의 돌기가 통과하는 공간으로, 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 사이에 형성되어 복수 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 중 적어도 둘 사이를 연결할 수 있다.
도 3 내지 5를 참고하면, 상기 복수 개의 미세통로(15a, 15b, 15c)는 복수 개의 격벽(13a, 13b, 13c)으로 구분될 수 있다.
이때, 상기 복수 개의 미세통로(15a, 15b, 15c)의 형태는 직선의 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 지그재그 또는 곡선의 형태일 수 있다. 미세통로(15a, 15b, 15c)의 길이와 폭도 사용하는 신경세포의 종류 및 특성에 따라 다양하게 조절할 수 있다. 미세통로의 폭은 신경돌기의 일반적인 두께 범위 안에서 조절될 수 있으며, 신경돌기가 통과할 수 있는 범위라면 특별히 제한하지 않는다.
상기 세 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)은 삼각형 형태로 배치되어 있고 각각의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c) 사이에 형성된 복수 개의 미세통로(15a, 15b, 15c)는 격벽(13a, 13b, 13c)으로 구분되어 일정한 간격으로 형성되어 있으며, 미세통로(15a, 15b, 15c)와 격벽(13a, 13b, 13c)은 미세통로부(23a, 23b, 23c)를 형성한다.
구체적으로, 세포배양 채널(11a)과 세포배양 채널(11b) 사이에는 미세통로부(23a)가 형성될 수 있고, 세포배양 채널(11b)과 세포배양 채널(11c) 사이에는 미세통로부(23b)가 형성될 수 있으며, 세포배양 채널(11c)와 세포배양 채널(11a) 사이에는 미세통로부(23c)가 형성될 수 있다.
상기 3개의 미세통로부(23a, 23b, 23c) 중 적어도 어느 하나는 실험 목적에 따라 폐쇄될 수도 있다.
이때, 미세통로부(23a, 23b, 23c)는 중심에서 교차하는 Y자 형태로 형성되어 있고 세 개의 통로부가 교차하여 중심에 형성되는 접합부(21)는 각각 세 개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)에서 배양되는 신경세포의 돌기가 한곳에서 만나는 것을 방지해주는 역할을 한다.
또한 도 3 내지 도5를 참고하면, 각 미세통로(15a, 15b, 15c)의 양 끝은 일측 입구(17a, 17b, 17c)와 타측 출구(19a, 19b, 19c)를 갖는다. 구체적으로, 세포배양 채널(11a)과 세포배양 채널(11b) 사이에 형성된 미세통로(15a)의 양 끝은 일측 입구(17a)와 타측 출구(19a)를 가지고, 세포배양 채널(11b)과 세포배양 채널(11c) 사이에 형성된 미세통로(15b)의 양 끝은 일측 입구(17b)와 타측 출구(19b)를 가지며, 세포배양 채널(11c)과 세포배양 채널(11a) 사이에 형성된 미세통로(15c)의 양 끝은 일측 입구(17c)와 타측 출구(19c)를 가진다.
이때, 상기 미세통로의 입구(17a, 17b, 17c)와 출구(19a, 19b, 19c)의 폭은 동일할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 미세통로(15a, 15b, 15c)를 통하여 신경세포(3)의 신경돌기가 성장하는 것을 보여주는 개념도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 소자의 변형예를 도시한 사시도이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 소자의 변형예를 도시한 저면 사시도이며, 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 소자의 변형예를 도시한 단면도이다.
본 발명의 상기 변형예는 미세통로(15a, 15b, 15c)의 일측 입구(16a, 16b, 16c)와 타측 출구(18a, 18b, 18c)의 폭이 변형된 것이다. 따라서, 미세통로(15a, 15b, 15c)의 입구(16a, 16b, 16c)와 출구(18a, 18b, 18c), 미세통로(15a, 15b, 15c)와 격벽(14a, 14b, 14c)이 형성하는 미세통로부(24a, 24b, 24c)를 제외한 나머지 부분은 도 3의 구성과 동일하므로 설명을 생략한다.
도 7 내지 9를 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치(1)의 변형예는 미세유체채널 소자(10)에 형성된 복수 개의 미세통로(15a, 15b, 15c)가 격벽(14a, 14b 14c)으로 구분되어 일정한 간격으로 형성되어 있으며, 각 미세통로(15)의 양 끝은 일측 입구(16a, 16b, 16c)와 타측 출구(18a, 18b, 18c)를 갖는다.
구체적으로, 세포배양 채널(11a)과 세포배양 채널(11b) 사이에 형성된 미세통로(15a)의 양 끝은 일측 입구(16a)와 타측 출구(18a)를 가지고, 세포배양 채널(11b)과 세포배양 채널(11c) 사이에 형성된 미세통로(15b)의 양 끝은 일측 입구(16b)와 타측 출구(18b)를 가지며, 세포배양 채널(11c)과 세포배양 채널(11a) 사이에 형성된 미세통로(15c)의 양 끝은 일측 입구(16c)와 타측 출구(18c)를 가진다.
이때, 단방향의 신경돌기 성장을 위해 상기 미세통로의 일측 입구(16a, 16b, 16c)의 폭은 타측 출구(18a, 18b, 18c)의 폭 보다 넓을 수 있다. 이와 같이, 미세통로(15a, 15b, 15c)의 입구(16a, 16b, 16c) 폭을 넓혀 미세통로(15a, 15b, 15c)를 통한 신경돌기의 성장확률을 높일 수 있으며, 미세통로(15a, 15b, 15c)를 통한 신경돌기의 성장 확률이 높아질수록 반대편 세포배양 채널에 존재하는 세포군집과의 신경연접을 맺을 확률이 더 높아진다.
도 7을 참고하면, 상기 미세통로(15a, 15b, 15c)와 격벽(14a, 14b, 14c)은 미세통로부(24a, 24b, 24c)를 형성하며, 세 개의 미세통로부(24a, 24b, 24c)는 도 3의 미세통로부(23a, 23b, 23c)와 같이 중심에서 교차하는 Y자 형태로 형성되어 있다.
도 10은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치의 평면도이다.
상기 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치는 미세유체채널 소자(10)에 5개의 세포배양 채널(12a, 12b, 12c, 12d, 12e) 및 4개의 미세통로부(25a, 25b, 25c, 25d)가 형성되어 있고, 교차부(21)가 형성되어 있지 않는다는 것을 제외하고 도 1 내지 9에 도시된 미세유체채널 장치의 구성을 모두 동일하게 포함할 수 있다. 따라서, 동일한 구성에 대해서는 설명을 생략한다.
도 10을 참고하면, 본 발명의 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치(1)는 오각형의 모양으로 배치된 5개의 세포배양 채널(12a, 12b, 12c, 12d, 12e) 및 상기 5개의 세포배양 채널(12a, 12b, 12c, 12d, 12e) 중 적어도 둘 사이를 연결하는 미세통로부(25a, 25b, 25c, 25d)가 형성된 미세유체채널 소자(10)를 포함할 수 있다.
이때, 상기 세포배양 채널(12a, 12b, 12c, 12d, 12e)은 원 모양일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 다각형 다각형일 수 있다.
상기 세포배양 채널(12a)과 세포배양 채널(12b) 사이에는 미세통로부(25a)가 형성될 수 있고, 세포배양 채널(12b)과 세포배양 채널(12c) 사이에는 미세통로부(25b)가 형성될 수 있으며, 세포배양 채널(12c)과 세포배양 채널(12d) 사이에는 미세통로부(25c)가 형성될 수 있고, 세포배양 채널(12d)과 세포배양 채널(12e) 사이에는 미세통로부(25d)가 형성될 수 있다. 그러나, 세포배양 채널(12e)과 세포배양 채널(12a) 사이에는 미세통로부가 형성되지 않을 수 있고, 또한 서로 완전히 분리되어 있을 수 있다.
도 10을 참고하면, 상기 4개의 미세통로부(25a, 25b, 25c, 25d)는 도 3의 미세통로부(23a, 23b, 23c)와 달리 서로 교차하여 접하지 않으므로 접합부(21)가 형성되지 않는다.
다음으로 본 발명의 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치를 이용하여 해마 신경 회로를 재건하는 방법에 대하여 설명한다.
해마는 치상 회(dentate gyrus; DG), Ammon’s horn 또는 본 해마(hippocampus proper; CA1~CA4), 구상회(subiculum)로 이루어져 있다. 대뇌 피질로부터의 여러 정보는 내후각뇌피질(entorhinal cortex, EC)의 상층(EC1, EC2 및 EC3)부에 직접 또는 간접으로 도달하고 이것은 다시 천공 경로(perforant pathway)를 통해서 치상 회의 분자 층(molecular layer)으로 가며 CA3 영역으로 이어진다. 이때 DG 과립 세포의 축삭(axon)인 태상섬유(mossy fiber)는 CA3의 stratum lucidum-radiatum으로 연결되고, CA3 영역의 추체 세포로부터 나오는 쉐퍼 콜레터럴(schaffer collateral)은 CA1의 방사상층(stratum radiatum)으로 연결되어 최종적으로 EC5(EC의 심층부) 영역으로 신호를 보낸다.
본 발명의 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치는 상기와 같은 일련의 해마 신경 회로를 부분 또는 전체적으로 재건하여 그 특성을 관찰할 수 있다.
해마 신경 회로 재건에 사용되는 본 발명의 미세유체채널 장치는 다음과 같은 단계를 거쳐 준비될 수 있다:
(a) 기판, 및 복수 개의 세포배양 채널과 각각의 세포배양 채널 사이에 형성된 복수 개의 미세통로가 형성된 미세유체채널 소자를 오토클레이브를 이용하여 소독하는 단계;
(b) 상기 소독된 기판, 및 복수 개의 세포배양 채널과 각각의 세포배양 채널 사이에 형성된 미세유체채널을 포함하는 층을 드라이 오븐에서 완전히 말린 후 기판에 신경세포 친화 물질을 코팅하는 단계; 및
(c) 상기 신경세포 친화 물질이 코팅된 기판, 및 복수 개의 세포배양 채널과 각각의 세포배양 채널 사이에 형성된 복수 개의 미세유체채널을 포함하는 층을 산소 플라즈마 처리하여 접합시키는 단계.
상기 (a) 단계에 있어서, 기판은 커버 글라스일 수 있고, 복수 개의 세포배양 채널과 상기 복수 개의 세포배양 채널에서 각각의 세포배양 채널을 연결하는 미세통로부가 형성된 미세유체채널 소자는 PDMS로 이루어질 수 있다.
상기 (b) 단계에 있어서, 신경세포 친화 물질은 폴리 L 리신(Poly L Lysine; PLL), 폴리 D 리신(Poly D Lysine; PDL), 라미닌, 콜라겐, 피브린, 피브로넥틴 및 마트리젤로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 1mg/ml의 폴리 L 리신(Poly L Lysine; PLL)으로 상기 기판을 코팅할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
상기와 같은 단계를 거쳐 준비된 미세유체채널 장치를 이용하여 해마 신경 회로를 재건하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(d) 기판과 복수 개의 세포배양 채널 및 복수 개의 미세유체채널을 포함하는 층이 접합되어 형성된 세포 배양 공간에 세포를 주입하기 최소 1시간 전에 각 세포 배양 공간에 세포 배양액을 채우는 단계; 및
(e) 신경 세포를 세포 배양 공간에 주입하여 배양하는 단계.
상기 (e) 단계에서 세포 배양 공간에 4x106 세포/ml ~ 6x106 세포/ml가 주입될 수 있으며, 나아가 실험 목적에 따라 적어도 하나의 세포배양 채널에 선택적으로 세포가 주입될 수 있다.
또한, 상기 (e) 단계에서 세포 배양이 이루어지는 동안 세포 배양액은 2~3일에 한번씩 교체될 수 있다.
상기 해마 신경 회로의 재건 방법에 사용되는 미세유체채널 장치의 세포 배양 공간의 크기와 개수는 실험하고자 하는 신경 군집 및 종류에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 도 1 내지 9 또는 10에 도시된 바와 같이 3개 또는 5개의 세포 배양 공간을 가지는 미세유체채널 장치(1)를 이용하여 해마의 각 영역을 부분적으로 재건하거나 또는 전체적으로 재건할 수 있다.
더욱 상세하게는, 도 10과 같이 5개의 세포배양 채널(12a, 12b, 12c, 12d, 12e)을 포함하는 미세유체채널 장치를 해마 전체의 신경회로(EC2, DG, CA3, CA1 및 EC5) 재건에 사용할 수 있다.
구체적으로, 하나의 세포배양 채널은 하나의 영역에 해당하는 세포를 배양할 수 있으며, 신경회로의 순서와 동일하게 5개의 세포배양 채널에 해마의 각 영역에 해당하는 EC2, DG, CA3, CA1 및 EC5를 순서대로 배양할 수 있다.
예를 들어, EC2 영역의 세포는 세포배양 채널(12a)에, DG 영역의 세포는 세포배양 채널(12b)에, CA3 영역의 세포는 세포배양 채널(12c)에 CA1 영역의 세포는 세포배양 채널(12d)에, 마지막으로 EC5 영역의 세포는 세포배양 채널(12e)에 순서대로 배양될 수 있다.
도 1 내지 9와 같이 3개의 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)을 포함하는 미세유체채널 장치는, DG, CA3 및 CA1로 이루어지는 해마의 부분 신경 회로 재건에 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 실험 목적에 따라 해마 전체의 신경회로를 구성하는 각 영역을 부분적으로 선택하여 배양할 수 있고, 배양방법은 상기 해마 전체의 신경회로 재건 방법과 동일하게 적용된다.
또한, 해마 전체의 신경회로 재건 및 해마의 부분 신경 회로 재건을 위해 각 해마 신경회로 영역이 돌출(projection)하는 방향을 고려하여 각 세포배양 채널에 배양하는 해마의 영역을 선택할 수 있다.
나아가 도 3과 같이 세 개의 세포배양 채널 사이에 세 개의 미세통로부(23a, 23b, 23c)가 형성되어 각 세포배양 채널(11a, 11b, 11c)을 연결하는 형태의 미세유체채널 장치(1)를 사용할 수 있고, 도 3의 세 개의 미세통로부(23a, 23b, 23c) 중 어느 하나가 형성되지 않거나 폐쇄된 형태의 미세유체채널 장치 또한 실험 목적에 따라 선택적으로 사용할 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 해마 신경 회로의 재건 방법으로 재건된 해마 신경 회로에서 각 영역간의 신경세포가 시냅스를 형성하면 면역세포화학 (immunocytochemistry)를 이용해 해마 각 영역 고유의 단백질을 확인하거나 칼슘 이미징, 전기생리학, DREADD(designer receptors exclusively activated by designer drugs)와 같은 신경세포의 기능을 확인하는 실험을 수행할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
본 발명의 미세유체채널 장치는 종래의 세포배양 공간의 상부영역이 닫혀있어 산소 및 물질이동이 원활하게 이루어지지 않았던 종래의 미세유체채널 장치의 구조를 변형하여 세포배양 공간의 상부영역을 개방함으로써 세포 실험의 재현성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 미세유체채널 장치는 다수의 세포배양 채널을 가지고 있어 최근 활발하게 진행되고 있는 뇌 연구에서 유용한 플랫폼으로 사용할 수 있고, 본 발명의 미세유체채널 장치를 이용하여 다양한 신경군집이 신경연접을 통해 서로 연결되어 있는 신경 회로를 재건하기에 유용하다.
나아가, 본 발명의 미세유체채널 장치는 신경연접 형성뿐만 아니라 신경세포의 형태, 분화 및 성장 특성 등을 연구하는데 적합하며, 해마 신경 회로가 형성된 후에는 칼슘이미징, 전기생리측정, 면역염색법 및 웨스턴 블랏 등을 통해 신경군집의 특성을 분석하는데 유용하다.

Claims (13)

  1. 기판(substrate); 및
    상기 기판 상에 적층되는 미세유체채널 소자; 를 포함하고,
    상기 미세유체채널 소자에는,
    세포배양을 위한 복수 개의 세포배양 채널; 및
    상기 복수 개의 세포배양 채널 중 적어도 둘 사이를 연결하는 미세통로부가 형성된, 해마 신경 회로 재건용 미세유체채널 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기판은 커버 글라스(cover glass)로 이루어짐을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미세유체채널 소자는 폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxane, PDMS)으로 이루어짐을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기판과 미세유체채널 소자는 산소 플라즈마 처리에 의해 서로 접합된 것을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미세유체채널 소자는 접합 처리 없이 기판 상에 적층되는 것을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미세통로부는 복수 개의 격벽으로 분리된 복수 개의 미세통로로 형성됨을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미세통로는 신경세포의 돌기가 통과하는 공간임을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  8. 제6항에 있어서, 상기 미세통로는 폭이 동일한 일측 입구와 타측 출구를 가지는 것을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  9. 제6항에 있어서, 상기 미세통로는 폭이 넓은 일측 입구와 폭이 좁은 타측 출구를 가지는 것을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미세유체채널 소자의 세포배양 채널 하부에 접합된 기판은 폴리 L 리신(Poly L Lysine; PLL), 폴리 D 리신(Poly D Lysine; PDL), 라미닌, 콜라겐, 피브린, 피브로넥틴 및 마트리젤로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상의 신경세포 친화 물질로 코팅됨을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미세유체채널 소자의 세포배양 채널 하부에 접합된 기판은 표면처리를 통해 미세 구조물이 추가로 형성됨을 특징으로 하는 미세유체채널 장치.
  12. 제1항 내지 제11항의 미세유체 채널 장치를 이용하여 해마 전체의 신경 회로를 재건하는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항의 미세유체 채널 장치를 이용하여 해마 신경 회로의 각 영역을 부분적으로 재건하는 방법.
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