CN110106081B - 用于构建脑功能单元模型的微流控芯片及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于构建脑功能单元模型的微流控芯片及其构建方法。微流控芯片包括具有第一培养室、进液口和出液口的第一弹性层、具有第二培养室、进液口和出液口的第二弹性层、位于第一弹性层和第二弹性层之间的中间层以及与第二弹性层的底部贴合的基板。将附着于中间层的微血管内皮细胞等第一细胞培养于第一培养室，将原代神经干细胞等第二细胞培养于第二培养室中，进液口和出液口通过微通道与各自的培养室相连接而形成灌流培养通道，实现了以相对简单的方法和最少的细胞种类模拟构建相对复杂的脑结构功能单元。本发明可应用于各类神经系统疾病的模型构建，用于药物的安全性和有效性评价、剂量筛选等，为临床药物筛选提供优良载体和技术支持。

Description

用于构建脑功能单元模型的微流控芯片及构建方法
技术领域
本发明属于组织工程-组织功能单元的体外构建研究领域，具体涉及一种用于构建脑功能单元模型的微流控芯片及构建方法。
背景技术
神经-血管单元，即由内皮细胞及细胞外基质、星形胶质细胞、周细胞、神经元及其轴突和其它支持细胞(小胶质细胞、少突胶质细胞)等共同组建的复合体，是神经系统的结构和功能的基本单位。这些组成部分之间紧密接触、相互协调，共同构成一个完整的解剖学和功能学单位，高效而精密地调节脑血流，共同维持脑组织内环境的稳态。神经-血管单元概念的提出旨在强调神经元、神经胶质细胞和脑血管之间相互联系及相互影响的重要性，为整体研究神经元损伤及保护机制，寻找临床治疗的新靶点提供依据。
神经-血管单元是通向脑的大门，作为基本的功能单元，它反映了中枢神经系统结构和功能的复杂性、精密性。在维持脑组织内环境稳态的过程中，神经血管网络的重要性已被充分证实。由于神经-血管单元是维持大脑稳态的重要结构，一个或多个成分的功能障碍将会产生严重的后果。研究指出，疾病会导致神经血管单元各组成成分间的细胞交流发生异常或障碍，从而导致大脑功能受损，如外伤性脑损伤、中风、蛛网膜下腔出血，以及一些慢性疾病，如阿尔茨海默病和其他痴呆症等。在所有这些病理过程中，均伴随有血脑屏障渗透性和选择性的丧失，细胞外基质和基底膜的退化以及炎症反应。除了这些常见的特征外，每种疾病还有其区别于其他疾病的特征。例如，周细胞对缺血等损伤极为敏感，这一现象就与阿尔茨海默病相关。此外，脑血管功能障碍在中枢神经系统肿瘤中同样被发现，包括原发性(源自中枢神经系统的肿瘤)和继发性(转移性)肿瘤。无论是哪种形式的肿瘤，在疾病早期，肿瘤细胞都可在神经-血管单元血管周围的空间内存活，随后破坏、重塑并产生新的神经-血管单元成分和功能异常或畸变的新生脉管系统。了解神经-血管单元在脑肿瘤发病过程中的病理演变将启发新的治疗策略，这是由于神经-血管单元这个特定的小生境对肿瘤的发展和药物的转运至关重要。因此，对神经-血管网络各组成部分发育维持、功能特点和病理过程的进一步研究和认知，将为各类神经血管疾病提供可靠的治疗依据，挖掘潜在的治疗靶点，促进药物研发。
神经-血管单元扩充了血脑屏障的内涵与外延，具有多种细胞组成的动态微环境结构特征。最初的神经-血管单元体外模型仅包含一或两个神经血管单元成分。常采用Transwell构建血脑屏障模型，其中可以包含一个或几个神经-血管单元的细胞成分。Transwell法主要用于构建静止状态下的细胞模型，无法包含血流、脑脊液流动因素。此外，有研究者应用脑切片技术来研究神经-血管单元，这为探究神经-血管单元所有组成成分提供了良好条件，即不破坏它的细胞结构和解剖学关系，并对氧分压和代谢产物进行严格控制。然而，这项技术需要对氧和营养物质的供应进行精确调控，以使其最大限度地接近脑脊液的真实状态。
发明内容
鉴于上述所述的现有技术中有待解决的上述技术问题，本发明提供一种用于构建脑功能单元模型的微流控芯片及基于该微流控芯片的体外脑功能单元的构建方法。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种微流控芯片装置，具有：第一弹性层，其贯通设置有第一进液口、第一出液口、第二进液口、第二出液口和第一培养室，所述第一培养室通过微通道分别与所述第二进液口和第二出液口相连通；第二弹性层，其贯通设置有第三进液口、第三出液口和第二培养室，所述第二培养室通过微通道分别与所述第三进液口和所述第三出液口连通；中间层，其设置在所述第一弹性层和所述第二弹性层之间；以及基板，其与所述第二弹性层的底部贴合，所述第一进液口与所述第三进液口位于同轴线上且无缝隙地连通，所述第一出液口和所述第三出液口位于同轴线上且无缝隙地连通。
在上述技术方案中，所述第一培养室和所述第二培养室为同轴配置。
在上述技术方案中，所述第一培养室的底面面积小于或等于所述第二培养室的上口面积。所述第一培养室和所述第二培养室的形状可采用多种形状，如可选用圆柱形。
在上述技术方案中，中间层能够完全覆盖所述第二培养室上口且能够无缝隙地封闭所述第一培养室的底面。
在上述技术方案中，构成所述第一弹性层和所述第二弹性层的材料为PDMS、PMMA、硅、纸、玻璃中的一种，所述中间层为聚碳酸酯膜，聚酯膜，纤维素膜中的一种。
在上述技术方案中，所述第一弹性层经由中间层与第二弹性层贴合。
在上述技术方案中，所述基板的表面由构成所述第一弹性层或第二弹性层的材料来涂层。其中，优选的，所述基板的表面由与所述第二弹性层的材料相同材料来涂层。
本发明的第二方面，提供一种基于微流控芯片的脑功能单元的构建方法，该构建方法采用上述的微流控芯片装置，包括如下步骤：
a)将第一细胞接种于无菌中间层上培养，使第一细胞附着于中间层；
b)按照底部贴合有基板的第二弹性层、附着有第一细胞的中间层、第一弹性层的顺序进行封合，其中，中间层的附着有第一细胞的表面朝向第一弹性层底部并位于第一培养室的下方，第一培养室和所述第二培养室通过中间层被隔离；
c)从第二进液口以流速0.5～3μL/min灌入第一细胞培养液，第一细胞培养液经过第一培养室，再从第二出液口回收，进行灌流培养；
d)依次经过第一进液口和第三进液口灌入含有第二细胞的培养液，使第二细胞到达第二培养室，静置培养，使第二细胞附着于第二培养室，然后进行灌流培养。
在上述技术方案中，在所述步骤d)中所述灌流培养包括如下步骤：依次经过第一进液口和第三进液口以流速0.5～3μL/min灌入第二细胞培养液，第二细胞培养液经过第二培养室，依次经过第三出液口和第一出液口回收，进行灌流培养。
在上述技术方案中，所述第一细胞为血管内皮细胞、平滑肌细胞中的一种，所述第二细胞为神经干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞中的一种。
在上述技术方案中，所述微通道未贯通地形成在第一弹性层以及第二弹性层的外表面上，优先的，从第一弹性层或第二弹性层的下表面向上方凹陷形成凹槽，这样形成的微通道的底面与所述第一培养室的底面或所述第二培养室的底面在同一水平面上，利于培养液的顺畅流通。
本发明的有益效果：
1)本发明利用一种组装型、集成化、三维动态灌注培养微流控装置，结合原代提取培养的人源性细胞(而非经过基因改造的细胞系或动物细胞)，实现了集空间三维结构(神经模块 +血管模块)、剪切应力(持续可控灌流)、细胞多样性等为一体，提供了一种安全可靠、通用性强、操作方便的脑功能单元模型，最大程度地模拟人体真实的细胞微环境。
2)本发明利用神经干细胞多向分化且易于调控、体外培养增殖能力强的特点，于体外，经诱导分化该一种细胞类型，即可获得原代提取过程复杂、体外增殖能力弱且不易于传代培养的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞三种神经细胞，实现了以相对简单的方法和最少的细胞种类模拟构建相对复杂的脑功能单元。
3)本发明可应用于各类神经系统疾病的模型构建及个体化用药评价体系，为临床药物筛选提供优良载体和技术支持。
附图说明
图1为用于体外脑神经-血管功能单元构建的微流控芯片分解侧视图。
图2为用于体外脑神经-血管功能单元构建的微流控芯片集成俯视图。
图3为体外培养脑微血管内皮细胞和神经干细胞的形态，以及流式细胞鉴定表面标记物表征结果；其中：A为脑微血管内皮细胞光镜下形态图，B为流式细胞术检测脑微血管内皮细胞表面标记物血小板-内皮细胞粘附分子CD31的表达，C为神经干细胞光镜下形态图，D 为流式细胞术检测神经干细胞特异性蛋白标记物巢蛋白Nestin的表达。
图4为于微流控芯片上诱导培养7天后，血管及神经胶质组分的活性表征结果；其中： A为聚碳酸酯膜上脑微血管内皮细胞光镜下形态图，B为聚碳酸酯膜上脑微血管内皮细胞共聚焦显微镜下荧光表征图，C为脑微血管内皮细胞存活率百分比柱状图，D为下层PDMS层中，神经干细胞分化后的神经胶质组分光镜下形态图，E为下层PDMS层中，神经干细胞分化后的神经胶质组分荧光显微镜下荧光表征图，F为分化后神经胶质组分存活率百分比柱状图。
图5为于微流控芯片上诱导培养7天后，脑功能单元的完整性及渗透性能力表征结果；其中：A为聚碳酸酯膜上脑微血管内皮细胞完整性荧光表征图，以血管性血友病因子vWF表达阳性计，B为不同时间点下，脑功能单元渗透性表征折线图，以FITC标记的右旋糖酐吸光度值计。
图6为于微流控芯片上诱导培养7天后，脑功能单元对炎症因子刺激的反应性表征结果；以上层通道中TNF-α灌流2h后右旋糖酐透过率(即吸光度值)变化计。
符号说明：1为第一弹性层、11为第一进液口、12为第一出液口、13为第二进液口、14 为第二出液口、15为第一培养室、3为第二弹性层、31为第三进液口、32为第三出液口、33为第二培养室、2为中间层、4为基板。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明加以详细说明，借以阐述本方法的工作原理及工作方式，但并不因此而限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1
利用一种组装型、集成式微流控装置，进行体外神经-血管单元的构建，模拟脑功能单元。
设计、制备模拟脑功能单元的功能化微流控芯片：
1)用于模拟脑功能单元的功能化微流控芯片的装置，如图1、2所示。整个装置是从上层至底层依次由第一弹性层1、中间层2、第二弹性层3及基板4来构成。所述第一弹性层1和第二弹性层3分别为PDMS层，所述中间层2为聚碳酸酯膜，所述基板4为玻璃基板。
其中，所述第一弹性层1，其贯通设置有第一进液口11、第一出液口12、第二进液口13、第二出液口14和第一培养室15，所述第一培养室15通过微通道分别与所述第二进液口和第二出液口相连通。
所述第二弹性层3，其贯通设置有第三进液口31、第三出液口32和第二培养室33，三者的底部被基板封闭，所述第二培养室33通过微通道分别与所述第三进液口31和所述第三出液口32连通。所述中间层2，其设置在所述第一弹性层1和所述第二弹性层3之间。
所述基板4的表面由PDMS涂层，所述涂层的基板4与第二弹性层3的底部贴合，以此封闭贯通设置在第二弹性层3上的第三进液口31、第三出液口32和第二培养室33的底部。
所述第一培养室15和所述第二培养室33均为圆柱状，直径相同，且在装置中以同轴配置，上下夹合着中间层2所述第一培养室15的底部和所述第二培养室33的上口对准，所述中间层能够完全覆盖所述第二培养室33的上口且能够无缝隙地封闭所述第一培养室15的底面。
所述第一进液口11与所述第三进液口31位于同轴线上且无缝隙地连通，所述第一出液口12和所述第三出液口32位于同轴线上且无缝隙地连通。所述第一进液口11、所述第三进液口31、所述第一出液口12和所述第三出液口32均呈圆柱状。
为实现不同细胞的分区域共培养、交互联系与动态观测，所用芯片以集成式复合结构划分各个功能区域。如图1所示，微流控芯片由包括模拟脑部微血管血流的上层PDMS层(第一弹性层1)、用于负载内皮细胞以模拟血脑屏障的聚碳酸酯膜(中间层2)、用于模拟神经胶质单元的下层PDMS层(第二弹性层3)及底层玻璃基片(基板4)构成。根据各单元功能需求，优选微尺度条件及集成界面设计：模拟脑部微血管血流的上层PDMS层中，灌流微通道及细胞培养室(第一培养室15)尺寸与细胞接种相适应，且细胞培养室尺寸适合于聚碳酸酯膜在上层PDMS层与下层PDMS层之间的紧密封合；用于模拟神经胶质单元的下层PDMS 层中，灌流微通道及细胞培养室33尺寸与细胞接种相适应。作为重要的条件，需保证所述复合结构中的流体既通过中间层(即多孔聚碳酸酯膜)存在交互界面，又通过各自的灌流通道保持各自流动状态，如图1所示，这样的结构实现了液体的持续灌流及细胞的动态培养。
2)如图1所示的微流控芯片的制备：采用软光刻技术进行制备，第一弹性层1和第三弹性层3采用PDMS层时为例，包括如下步骤：
芯片模板的制作和PDMS芯片的浇注成型：应用负性光刻胶SU-8，按照标准的软光刻技术制备阳膜模具，并以此阳模反转出PDMS阴模。分别得到上、下两层PDMS层(第一弹性层1和第三弹性层3)，在该PDMS层按第一培养室15、第一进液口11、第一出液口12、第二进液口13、第二出液口14、第三进液口31、第三出液口32、第二培养室33相应位置进行打孔，打孔位置形成贯通PDMS层的通孔结构。在上层PDMS层中，从PDMS层的下表面向上方凹陷形成灌流微通道，以连接第一培养室15、第二进液口11和第二出液口；同样从下层PDMS层的下表面向上方凹陷形成灌流微通道，以连接第二培养室33、第三进液口31、第三出液口32，所述灌流微通道均未贯通地形成在上层以及下层PDMS层中，两层PDMS 层中灌流微通道长1cm，高度为200μm、宽度为100μm；第一、第二培养室、各进液口和各出液口均为圆柱形；其中，位于上层PDMS层的第一培养室15直径为8mm、高度为200μm；位于下层PDMS层的第二培养室33直径为8mm、高度为2mm。基板4选用刚性玻璃片，并用PDMS对其表面进行涂层。作为中间层2的生物膜选用孔径为0.4μm的多微孔聚碳酸酯膜片材料。
实施例2
利用微流控芯片构建脑功能单元模型：
(1)培养、鉴定人脑微血管内皮细胞及神经干细胞：
1)脑微血管内皮细胞的培养及鉴定。
人脑微血管内皮细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，单层贴壁生长，待细胞90％融合后，胰酶消化传代。表型鉴定时，以胰酶消化贴壁细胞成单细胞悬液，PBS清洗后加入FITC标记的CD31抗体，避光孵育。PBS清洗后流式细胞仪上机检测。脑微血管内皮细胞形态如图3A所示，流式细胞定量表征如图3B所示，CD31阳性率达99.9％。
2)神经干细胞的原代提取、培养和干性鉴定。
神经干细胞原代提取自6-12孕周的流产胚胎，孕妇自愿捐献且身体健康。将完整的胚胎置于盛有无菌PBS的培养皿中，反复冲洗直至胚胎表面无血渍。眼科镊固定胎头，眼科剪沿枕骨大孔、前额方向，分别剪开头部皮肤及颅骨，打开颅腔、暴露脑组织，用弯头镊将胎脑移入一个新的盛有预冷的DMEM/F12完全培养液的培养皿中。操作时，应注意保持胎脑的完整性。剥离脑膜及血管，取前脑皮质部位，置于提前预冷的DMEM/F12中，剪刀剪碎脑组织。将DMEM/F12与组织混合液移至离心管中，玻璃管轻柔吹打，静置，取上清液体移至另一个离心管中离心，弃上清，将细胞沉淀与AccutaseTM细胞分离液混合，移至新培养皿中，放入培养箱孵育。取出培养皿，轻柔吹打，加入DMEM/F12终止消化，细胞混合液移至离心管中离心。弃上清，加入神经干细胞培养基，细胞计数，将细胞密度调至2×105cell/mL，种于培养瓶。放入培养箱培养。每2天半定量加入神经干细胞培养基，观察神经干细胞成球大小。当神经干细胞细胞球直径为150μm-200μm时，可传代。干性鉴定时，以AccutaseTM消化干细胞细胞球成单细胞悬液，PBS清洗后加入Triton-100，PBS清洗后加入BSA封闭。加入Nestin 一抗孵育，PBS清洗后加入FITC标记的二抗，避光孵育。PBS清洗后流式细胞仪上机检测。神经干细胞形态如图3C所示，流式细胞定量表征如图3D所示，Nestin阳性率达96％。
(2)将神经干细胞和微血管内皮细胞负载于实施例1的微流控装置构建脑功能单元模型。
分四个步骤完成整个芯片装置的组装，配合完成神经干细胞和内皮细胞在芯片的接种。
1)芯片组装前48小时，将脑微血管内皮细胞接种于无菌聚碳酸酯膜上培养，接种密度 5×105cells/mL，备用。
2)将涂覆有PDMS的玻璃基片与下层PDMS芯片含通道的一面不可逆键合，此时，第三进液口31、第三出液口32、第二培养室33处通孔结构的底面被玻璃基片封闭，仅上面(上口)敞开；将上层PDMS芯片与已组装的下层PDMS芯片-玻璃基片紫外消毒灭菌，等离子处理后，依次将下层PDMS芯片-玻璃基片与附着有内皮细胞的聚碳酸酯膜、上层PDMS芯片封合；附着有内皮细胞的聚碳酸酯膜，长有细胞的一面朝上，与上层PDMS芯片含通道的一面键合；注意第一进液口11对齐第三进液口31，第一出液口12对齐第三出液口32；封合后，自上至下，分别为上层PDMS芯片、附着有细胞的聚碳酸酯膜、下层PDMS芯片和玻璃基片。自第二进液口13灌注内皮细胞培养液，到达培养室15，流速设定1.0μL/min，灌注液经第二出液口14回收。
3)上、下两层PDMS芯片之间的聚碳酸酯膜及其上培养的内皮细胞，模拟了血脑屏障；自第二进液口13(血管单元进液口)引入内皮细胞培养液并实现上层PDMS芯片的液体灌流，完成上层PDMS芯片中脑内微血管的构建，模拟口服或静脉药物吸收转运的主要通道，药物通过中间血脑屏障层进入下层脑组织。
4)选取第2-5代神经干细胞，将神经球分离成单细胞悬液，调整密度为5×105cells/mL。依次经第一进液口11和第三进液口31灌入神经干细胞的单细胞悬液，到达第二培养室33，于37℃，5％CO2培养箱中静置过夜，使神经干细胞贴附于第二培养室33底层涂覆有PDMS 的玻璃基片表面上；次日，持续灌注分化培养液，流速设定1.0μL/min，灌注液依次流经第三出液口32和第一出液口回收。经过7天的灌流培养，诱导神经干细胞分化成不同的神经、胶质细胞，实现下层PDMS芯片中特定区域脑组织神经-胶质单元的模拟。其中，通过培养基成分的调整、灌流流速的调节，可以实现该脑组织中神经细胞成分的调控，即调控神经干细胞向特定神经细胞类型分化，如以神经元细胞为主、以星形胶质细胞为主、或者以少突胶质细胞为主。此外，在该生理模型基础上，可以添加致病/损伤因素对脑组织/脑组织特定细胞产生杀伤作用，制造损伤病理模型；再者，通过向该病理模型添加药物等治疗因素，作用于下层脑组织，构造损伤后的修复评价模型。
实施例3
实施例2制备的脑功能单元模型中的 各细胞组分的存活情况的鉴定：
1)脑功能单元模型中微血管内皮细胞活性鉴定。
灌注培养7天后，将两层PDMS层拆开，小心取出附着有微血管内皮细胞的聚碳酸酯膜放入小皿中，以PBS清洗后加入Calcein和PI染料，避光孵育。吸弃染料，加入PBS后共聚焦荧光显微镜下检测。将样本扫描20个层面，取其中5个层面等间隔的扫描图片，统计Calcein表达细胞数及PI表达细胞数，计算活细胞百分比。聚碳酸酯膜上脑微血管内皮细胞形态如图 4A所示，聚碳酸酯膜上脑微血管内皮细胞存活率免疫荧光及定量表征如图4B及4C所示，活细胞数为96.8±5.7％，死细胞数为3.2±2.5％。
2)脑功能单元模型中神经干细胞分化后神经胶质细胞活性鉴定。
灌注培养7天后，将两层PDMS层拆开，吸净底层PDMS细胞培养室中的灌流液，以PBS清洗后加入Calcein和PI染料，避光孵育。吸弃染料，加入PBS后正置荧光显微镜下观察。随机选取5个视野采集图像，统计Calcein表达细胞数及PI表达细胞数，计算活细胞百分比。芯片下层分化后神经胶质细胞形态如图4D所示，芯片下层分化后神经胶质细胞存活率免疫荧光及定量表征如图4E及4F所示，活细胞数为95.2±3.2％，死细胞数为4.8±2.2％。
实施例4
实施例2制备的脑功能单元模型的完整性及渗透性鉴定：
1)脑功能单元的完整性鉴定。
灌注培养7天后，将两层PDMS层拆开，小心取出附着有微血管内皮细胞的聚碳酸酯膜放入小皿中，PBS清洗后多聚甲醛固定，PBS清洗后加入Triton-100破膜，PBS清洗后加入BSA封闭。加入vWF一抗4℃过夜。吸弃抗体稀释液，PBS清洗后加入二抗稀释液，避光孵育。吸弃二抗稀释液，PBS清洗后加入核染料Hoechst避光孵育。吸弃核染料，PBS清洗后倒置荧光显微镜下观察。微血管内皮细胞vWF荧光表征如图5A所示，可见模型中的微血管内皮细胞形态规则、紧密生长，呈铺路石样排列，稳定表达vWF(阳性率＞95％)。
2)脑功能单元的渗透性鉴定。
灌注培养7天后，将芯片上层灌注液换为含有FITC标记的右旋糖酐，分别于第1、2、3、 4、5、6小时收集芯片下层废液口流出的灌流液，加入96孔板中，于酶标仪中检测，吸收光波长为450nm。右旋糖酐在脑功能单元中的透过率表征如图5B所示，4小时后透过率即达到稳定状态。
实施例5
实施例2制备的脑功能单元模型对炎症因子刺激的反应性鉴定：
脑神经血管单元灌注培养7天后，将芯片上层灌注液换为含有TNF-α的培养基，持续灌注2小时后，将芯片上层灌注液换为含有FITC标记的右旋糖酐，分别于第1、2、3、4、5 小时收集芯片下层废液口流出的灌流液，加入96孔板中，于酶标仪中检测，吸收光波长为450nm。右旋糖酐在经过TNF-α刺激前后在脑功能单元中的透过率变化表征如图6所示，经TNF-α作用2小时后，神经血管单元对右旋糖酐的通透性明显增大，前3个小时与未加TNF-α组相比均具有统计学意义，自第4小时开始，透过率无明显变化。

Claims (9)

1.一种基于微流控芯片的脑功能单元的构建方法，其特征在于，该构建方法采用微流控芯片装置，所述微流控芯片装置具有：
第一弹性层(1)，其贯通设置有第一进液口(11)、第一出液口(12)、第二进液口(13)、第二出液口(14)和第一培养室(15)，所述第一培养室(15)通过微通道分别与所述第二进液口(13)和第二出液口(14)相连通；
第二弹性层(3)，其贯通设置有第三进液口(31)、第三出液口(32)和第二培养室(33)，所述第二培养室(33)通过微通道分别与所述第三进液口(31)和所述第三出液口(32)连通；
中间层(2)，其设置在所述第一弹性层(1)和所述第二弹性层(3)之间；以及
基板(4)，其与所述第二弹性层(3)的底部贴合，
所述第一进液口(11)与所述第三进液口(31)位于同轴线上且无缝隙地连通，所述第一出液口(12)和所述第三出液口(32)位于同轴线上且无缝隙地连通；
所述构建方法包括如下步骤：
a)将第一细胞接种于无菌中间层(2)上培养，使第一细胞附着于中间层(2)；
b)按照底部贴合有基板(4)的第二弹性层(3)、附着有第一细胞的中间层(2)、第一弹性层(1)的顺序进行封合，其中，中间层(2)的附着有第一细胞的表面朝向第一弹性层(1)底部并位于第一培养室(15)的下方，第一培养室(15)和所述第二培养室(33)通过中间层(2)被隔离；
c)从第二进液口(13)以流速0.5～3μL/min灌入第一细胞培养液，第一细胞培养液经过第一培养室(15)，再从第二出液口(14)回收，进行灌流培养；
d)依次经过第一进液口(11)和第三进液口(31)灌入含有第二细胞的培养液，使第二细胞到达第二培养室(33)，静置培养，使第二细胞附着于第二培养室(33)，然后进行灌流培养。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一培养室(15)和所述第二培养室(33)为同轴配置。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述第一培养室(15)的底面面积小于或等于所述第二培养室(33)的上口面积。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，中间层(2)能够完全覆盖所述第二培养室(33)的上口且能够无缝隙地封闭第一培养室(15)的底面。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的构建方法，其特征在于，构成所述第一弹性层(1)和所述第二弹性层(3)的材料为PDMS、PMMA、硅、纸、玻璃中的一种，所述中间层为聚碳酸酯膜、聚酯膜、纤维素膜中的一种。
6.根据权利要求1～4的任一项所述的构建方法，其特征在于，所述第一弹性层(1)经由中间层(2)与第二弹性层(3)贴合。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述基板由构成所述第一弹性层(1)或第二弹性层(3)的材料来涂层。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤d)中所述灌流培养包括如下步骤：依次经过第一进液口(11)和第三进液口(31)以流速0.5～3μL/min灌入第二细胞培养液，第二细胞培养液经过第二培养室(33)，再依次经过第三出液口(32)和第一出液口(12)回收，进行灌流培养。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一细胞为血管内皮细胞、平滑肌细胞中的一种；所述第二细胞为神经干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞中的一种。
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