KR101822784B1 - 신경혈관단위-온-칩 및 그 칩의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반고체(gel) 상태의 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 모사 물질(70)과 상기 세포외기질 모사 물질(70)을 관통하고 있으며 배양액이 관류되는 적어도 하나의 채널(channel, 75); 및 상기 세포외기질 모사 물질(70)과 상기 적어도 하나의 채널(75)을 둘러싸며, 상기 적어도 하나의 채널(75)과 유체적으로 연통하도록 상기 적어도 하나의 채널(75)과 동일 개수로 이루어진 통로(50)를 가지는 기판(10)을 포함하고, 상기 세포외기질 모사 물질(70)은 상기 채널(75)의 외벽에 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 함유하고, 상기 채널(75)의 내벽에는 뇌미세혈관내피세포 막(brain microvessel endothelial cell lining, 91)이 형성되고, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들과 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)은 상기 채널(75)을 통해 접촉되어 인간 뇌의 혈뇌 장벽(Blood Brain Barrier; BBB)과, 상기 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 상기 인간 뇌의 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 모사하고, 상기 기판(10)은 중앙 영역에서 상부 면(US)을 관통하여 상기 상부 면(US)으로부터 하부 면(LS)을 향해 소정 깊이로 연장되도록 상기 하부 면(LS) 및 상기 상부 면(US) 사이에 위치되는 셀 고정 웰(cell fixing well, 20)에 상기 세포외기질 모사 물질(70)을 안착시키는 것을 특징으로 하고, 상기 세포외기질 모사 물질(70)은, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 엘라스틴, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 마트리젤 (Matrigel) 를 포함하는 세포외기질, 알지네이트, 폴리에틸렌글라이콜, 실리콘 하이드로젤, 폴리아크릴아마이드, 폴리데틸렌옥사이드, 폴리피롤리딘, 글리코사미노글리칸 및 폴리헤마를 포함하는 하이드로젤, 상기 세포외기질과 상기 하이드로젤의 혼합물, 상기 세포외기질의 화학적 변형체, 상기 하이드로젤의 화학적 변형체, 또는 상기 세포외기질의 상기 화학적 변형체와 상기 하이드로젤의 상기 화학적 변형체의 혼합물을 포함하되,상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 혈관주위세포(pericyte, 96)로 이루어진 것을 특징으로 하며, 상기 혈뇌장벽(BBB)은 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91), 상기 별아교세포(astrocyte, 95)와 상기 혈관주위세포(pericyte, 96)를 포함하고, 상기 신경혈관단위는 상기 혈뇌장벽(BBB), 상기 뉴런(neuron, 92), 상기 신경줄기세포(neural stem cell, 93)와 상기 미세아교세포(microglia, 94)를 포함한다.

Description

신경혈관단위-온-칩 및 그 칩의 제조방법{NeuroVascular Unit(NVU)-On-a-Chip And Method Of Fabricating The Same}
본 발명은 체외에서 인간의 뇌를 모사할 수 있는 미세유체 칩에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 뇌질환과 관련한 신약 개발과 맞춤치료를 위하여 혈뇌 장벽 구조를 포함하는 인간 뇌조직과 유사한 환경을 체외에서 모사하고자 뇌조직세포 공배양 기술을 이용하여 미세 유체 플랫폼에 다양한 인간 유래 뇌조직 세포(human brain cell)를 3차원 집적시킨 신경혈관단위-온-칩 및 그 칩의 제조방법에 관한 것이다.
2차원 세포 배양(two-dimensional(2D)) 모델이 의생명과학 연구에서 가치를 인정받음에도 불구하고, 상기 2차원 세포 배양 모델은 세균 배양 접시(petri dish)를 이용하여 접시 바닥에 세포를 2차원으로 배양시키므로 많은 세포 타입의 조직 특이적 분화 기능들(tissue-specific, differentiated functions)을 설명하지 못하거나 생체내(in vivo)의 조직 기능과 약물 활성도를 정확하게 예측하지 못한다.
특히, 생체 내에서 3차원 접촉을 하고 있는 뉴런(neuron) 및 신경줄기세포(neural stem cell)를 가지는 뇌조직세포의 경우 상기 2차원 세포 배양 모델의 한계로 인해서, 살아있는 조직의 공간적 구조과 생화학적 복잡성을 잘 모사하는 3차원 세포 배양 모델에 대한 관심이 높아지고 있다.
3차원 세포 배양 모델은 생체내 상태(situation)를 잘 모방하므로 생체외 실험에서 방향적 성장과 세포-세포 연결의 복잡성을 구현할 수 있고, 더불어 3차원 세포 배양 모델은 2차원 세포 배양 모델에 비하여 개선된 세포 생존(improved cell survival)과 향상된 신경줄기세포 분화(enhanced neuronal differentiation)를 보여준다.
따라서, 3차원 세포 배양 모델은 분자 기반(molecular basis)의 조직 기능을 연구하는데 있어서 2차원 세포 배양 모델 대비 다양한 질병 상태의 신호기전(signaling pathway)과 약물 반응(drug responsiveness)을 잘 포착하는데 유용하다.
한편, 일 예로써, 3차원 세포 배양 모델이 'Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor' 의 제목을 갖는 논문(아래의 '선행기술문헌' 란에서 상세한 사항을 참조요)에 개시되었다.
상기 논문은 생체 외에서 신경혈관 미세유체 바이오반응기(neurovascular microfluidic bioreactor)를 이용하여 혈뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 모사하는 3차원 세포 배양 모델을 제시하였다. 여기서, 상기 혈뇌 장벽은 혈관내피세포(endothelial cells) 혈관주위세포(pericyte)와 별아교세포(astrocyte)로 구성되며 혈액과 뇌조직 사이에 물질의 이동을 제한하는 관문(gatekeeper)이다.
즉, 상기 혈뇌 장벽은 뇌조직에서 요구되는 혈액 내의 영양분을 혈액으로부터 뇌를 향해 들여보내고 잠재적으로 해로운 물질을 혈액으로부터 외부로 배출시키는 역할을 한다. 여기서, 상기 신경혈관 미세유체 바이오반응기는 유리(glass) 상에 순차적으로 적층되는 제1 내지 제3 폴리디메틸실록세인(PolyDiMethylSiloxane; PDMS) 층과, 제1 및 제2 폴리디메틸실록세인 층 사이에 폴리카보네이트 맴브레인(polycarbonate membrane)을 이용하여 동작된다.
상기 맴브레인은 반투과성이며, 미세유체 맥관구조(microfluidic vasculature) 및 뇌 격실들(brain compartments)을 만든다. 상기 제1 폴리디메틸실록세인 층은 내피 세포에 도관 중막 공급(vascular media supply)을 위한 두 개의 관류 포트를 가지며, 상기 제2 및 제3 폴리디메틸실록세인 층은 브레인 중막 공급(brain media supply)을 위한 네 개의 관류 포트를 갖는다.
상기 맴브레인의 양 측에 세포들을 성장시키기 위해, 우선적으로 상기 제1 폴리디메틸실록세인 층이 제2 및 제3 폴리디메틸실록세인 층보다 더 상위 레벨로 위치되어 맴브레인의 도관 측에 혈관내피 세포를 심기 위해 두 개의 관류 포트를 통해 관류된다.
다음으로, 상기 제1 폴리디메틸실록세인 층이 제2 및 제3 폴리디메틸실록세인 층보다 더 하위 레벨로 위치된 후에, 상기 제2 및 제3 폴리디메틸실록세인 층은 맴브레인의 브레인 측에 콜라겐(collagen)에 포함되는 뉴런(neuron), 별아교세포(astrocyte) 및 혈관주위세포(pericyte)를 심기 위해 네 개의 관류 포트를 통해 관류된다.
다음으로, 상기 혈관내피 세포, 뉴런, 별아교세포 및 혈관주위세포가 제1 내지 제2 폴리디메틸실록세인 층에서 세포 배양액을 통해 배양되어 멤브레인 주변에 혈뇌장벽을 형성한다. 그러나, 상기 신경혈관 미세유체 바이오반응기는 혈뇌장벽을 형성하는 동안 제1 폴리디메틸실록세인 층을 기준으로 뒤집어져야 하고, 혈관내피 세포, 별아교세포 및 혈관주위세포로 이루어지는 혈뇌장벽을 포함하는 생체내 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 충분히 구현하지 못한다.
왜냐하면, 상기 신경혈관단위는 생체내 혈뇌 장벽의 구조 관점에서 볼 때에 맴브레인의 도관 측과 브레인 측에 각각 위치되어 맴브레인으로 분리된 혈관내피 세포와 혈관주위세포를 가지므로 불완전하게 모사되었고 생체내 혈뇌 장벽과 그 주변의 구조적인 관점에서 볼 때에 혈관내피 세포, 혈관주위세포, 뉴런 및 별아교세포 이외에 다른 뇌조직 세포를 더 요구하기 때문이다.
또한, 상기 신경혈관 미세유체 바이오반응기는 혈관내피세포를 제1 폴리디메틸실록세인 층에서 맴브레인을 따라 2차원적으로 배양시켜 생체내 혈뇌 장벽을 충분히 구현하지 못하고, 공기 또는 약물을 흡수하는 특성을 갖는 폴리디메틸실록세인 층에 혈관내피세포와 배양액을 접촉시키므로 혈뇌장벽과 관련하여 생체내 기작과 다른 양상을 보여준다.
따라서 종래 개발된 생체 외 신경혈관단위의 모사 기술은 체내 기작과 다른 양상을 보이고 있어 후보 약물에 대한 효능과 독성 여부에 대한 예측도가 낮다는 문제점이 있는 바, 뇌질환 연구 및 뇌질환에 대한 우수한 신약 개발, 환자맞춤형 치료를 위해 모사도가 높은 신경혈관단위 모사칩의 개발이 필요한 실정이다.
Jacquelyn A. Brown 외 17인, 'Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor', BIOMICROFLUIDICS 9, 054124 (2015), pp.054124-1 to 054124-15, (Received 24 August 2015; accepted 10 October 2015; published online 26 October 2015)
본 발명은 종래 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 배양액을 관류시키는 미세유체 플랫폼기술을 이용하여 세포외기질(extra-cellular matrix, ECM)을 모사하는 단일 공간에서 인간 유래 뇌조직세포 5종 이상을 3차원으로 공배양함으로써 생체 외에서 인간 뇌의 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 최대한 재현하는데 적합한 신경혈관단위-온-칩 및 그 칩의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 반고체(gel) 상태의 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 모사 물질(70)과 상기 세포외기질 모사 물질(70)을 관통하고 있으며 배양액이 관류되는 적어도 하나의 채널(channel, 75); 및 상기 세포외기질 모사 물질(70)과 상기 적어도 하나의 채널(75)을 둘러싸며, 상기 적어도 하나의 채널(75)과 유체적으로 연통하도록 상기 적어도 하나의 채널(75)과 동일 개수로 이루어진 통로(50)를 가지는 기판(10)을 포함하고, 상기 세포외기질 모사 물질(70)은 상기 채널(75)의 외벽에 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 함유하고, 상기 채널(75)의 내벽에는 뇌미세혈관내피세포 막(brain microvessel endothelial cell lining, 91)이 형성되고, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들과 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)은 상기 채널(75)을 통해 접촉되어 인간 뇌의 혈뇌 장벽(Blood Brain Barrier; BBB)과, 상기 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 상기 인간 뇌의 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 모사하고, 상기 기판(10)은 중앙 영역에서 상부 면(US)을 관통하여 상기 상부 면(US)으로부터 하부 면(LS)을 향해 소정 깊이로 연장되도록 상기 하부 면(LS) 및 상기 상부 면(US) 사이에 위치되는 셀 고정 웰(cell fixing well, 20)에 상기 세포외기질 모사 물질(70)을 안착시키는 것을 특징으로 하고, 상기 세포외기질 모사 물질(70)은, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 엘라스틴, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 마트리젤 (Matrigel) 를 포함하는 세포외기질, 알지네이트, 폴리에틸렌글라이콜, 실리콘 하이드로젤, 폴리아크릴아마이드, 폴리데틸렌옥사이드, 폴리피롤리딘, 글리코사미노글리칸 및 폴리헤마를 포함하는 하이드로젤, 상기 세포외기질과 상기 하이드로젤의 혼합물, 상기 세포외기질의 화학적 변형체, 상기 하이드로젤의 화학적 변형체, 또는 상기 세포외기질의 상기 화학적 변형체와 상기 하이드로젤의 상기 화학적 변형체의 혼합물을 포함하되,상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 혈관주위세포(pericyte, 96)로 이루어진 것을 특징으로 하며, 상기 혈뇌장벽(BBB)은 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91), 상기 별아교세포(astrocyte, 95)와 상기 혈관주위세포(pericyte, 96)를 포함하고, 상기 신경혈관단위는 상기 혈뇌장벽(BBB), 상기 뉴런(neuron, 92), 상기 신경줄기세포(neural stem cell, 93)와 상기 미세아교세포(microglia, 94)를 포함한다.
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본 발명은 기판에 위치되는 셀 고정 웰과 셀 고정 웰의 양 측부에 서로 마주보는 통로들을 이용하여 통로들과 각각 연통하는 채널들을 갖는 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 모사 물질을 셀 고정 웰에 안착시키고 통로들과 채널들에 배양액의 반복적인 흐름 동안 각각의 채널에서 채널의 내벽을 충분히 덮는 뇌미세혈관내피세포 막과 채널의 외벽에서 뇌미세혈관내피세포 막을 따라 세포외기질(ECM) 모사 물질 내에 복수 종류의 인간 유래 뇌조직 세포들을 3차원 공배양시킬 수 있다.
본 발명은 채널의 내벽을 둘러싸는 뇌미세혈관내피세포 막과 채널을 한정하는 세포외기질(ECM) 모사 물질 내의 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 3차원으로 공배양시켜 채널을 통해 뇌미세혈관내피세포 막(brain microvascular endothelial cell lining)과 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 직접 접촉시키므로 인간 뇌의 혈뇌 장벽(Brain Blood Barrier; BBB)과 인간 뇌에서 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 모사하고 기판과 채널의 접촉을 최소화하여 시험 대상 약물이 기판에 흡착되어 생체내 기작과 다른 양상을 보이는 것을 피할 수 있게 한다.
본 발명은 기판 상에서 인간 뇌의 혈뇌 장벽(BBB)과 인간 뇌에서 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 신경혈관단위를 모사하는 난치성 뇌질환 유효성 평가 플랫폼을 통해 맞춤형 뇌질환 치료기술을 빠른 시간 내에 개발 가능하게 하고 난치성 뇌질환 유효성 평가 플랫폼의 개발 기술을 인간의 여타 질환에 확대 적용 가능하므로 뇌질환과 바이오 산업에서 새로운 시장을 형성할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명에 따른 신경혈관단위-온-칩을 개략적으로 보여주는 사시도이다.
도 2는 도 1의 A 영역에서 취해진 세포외기질 모사 물질을 개략적으로 보여주는 단면도이다.
도 3 내지 도 9는 도 1의 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법을 설명하는 개략도이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시 예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시 예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭하며, 길이 및 면적, 두께 등과 그 형태는 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시 예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 신경혈관단위-온-칩을 개략적으로 보여주는 사시도이고, 도 2는 도 1의 A 영역에서 취해진 세포외기질 모사 물질을 개략적으로 보여주는 단면도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명에 따르는 신경혈관 단위-온-칩(100)은 기판(10), 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 모사 물질(70) 및 복수의 채널(75)을 포함한다. 상기 기판(10)은 중앙 영역에서 상부 면(US)을 관통하여 상부 면(US)으로부터 하부 면(LS)을 향해 연장되도록 하부 면(LS) 및 상부 면(US) 사이에 위치되는 셀 고정 웰(cell fixing well, 20)에 세포외기질 모사 물질(70)을 안착시킨다.
상기 기판(10)은, 유리(glass)를 포함하는 투명 세라믹류, 폴리디메틸실록세인(PolyDiMethylSiloxane; PDMS)과 에코플렉스(ecoflex) 중 적어도 하나를 포함하는 실리콘고무류, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 폴리우레탄(polyurethane) 중 적어도 하나를 포함하는 엔지니어링 플라스틱류, 투명 세라믹류, 실리콘고무류와 엔지니어링 플라스틱류 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물, 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체, 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체, 또는 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체와 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 기판(10)과 셀 고정 웰(20)은 사각 형상으로 이루어져 제1 측벽(WS1)과 제2 측벽(WS2)을 각각 갖는다. 상기 제1 측벽(WS1)은 기판(10)의 두께 방향으로 제2 측벽(WS2)보다 큰 높이를 갖는다. 상기 제1 측벽(WS1)과 제2 측벽(WS2)은 상부 면(US)과 각을 이루면서 상부 면(US)과 접촉되어 서로 마주본다. 상기 세포외기질(ECM) 모사 물질(70)은 반 고체 상태(gel)이고 도 2에 도시된 바와 같이 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 함유한다. 바람직하게는, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron, 92), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 주피세포(pericyte, 96)를 포함한다.
일 예로써, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 혈관주위세포(pericyte, 96)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 신경혈관단위-온-칩(100)을 이용할 경우, 상기 신경혈관단위-온-칩(100)은 위에서 기술한 5가지 종류의 뇌조직 세포들을 동시에 공배양 할 수 있다.
뇌질환 치료제의 개발을 위한 효능분석 및 안정성 분석을 위해 사용되는 세포는 체외에서 배양된 단일 종류의 뇌세포를 사용하는 것이 대부분이었으며, 2~3 종류의 세포를 함께 사용하는 경우에도 2차원적으로 배양된 뇌세포를 대상으로 하는 경우가 다반사였다. 최근에는 단일 종류, 또는 2-3 종류의 세포를 작은 덩어리(spheroid) 모양으로 3차원 배양하는 기술이 개발되어 사용된다.
한편, 상기 신경혈관단위-온-칩(100)은 뇌미세혈관내피세포(brain microvessel endothelial cell lining, 91), 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 혈관주위세포(pericyte, 96)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 세포를 3차원 형태로 배양할 수 있는 효과가 있으며, 상기 세포들(91, 92, 93, 94, 95, 96)은 인간유래의 뇌조직으로부터 수득하여 사용할 수 있다.
뇌를 구성하고 있는 뇌조직 내 존재하는 세포의 한 종류로써, 상기 뉴런(neuron, 92)은 신경계를 이루는 단위로 신경세포를 일컫는다. 상기 신경줄기세포(neural stem cell, 93)는 자기 재생산이 가능하고 신경계통 세포로의 분화능을 가진 세포이다. 또한 상기 미세아교세포(microglia, 94)는 중배엽에서 유래한 중추 신경계의 신경아교세포, 소교세포라고도 하며 조직 안에서 물질의 운반, 파괴, 제거를 담당하는 식세포 작용을 하고, 중추 신경계의 조직을 지지하는 역할을 할 뿐만 아니라 신경세포에 필요한 물질을 공급하고 신경 세포의 활동에 적합한 화학적 환경을 조성하는 기능을 한다.
또한, 상기 별아교세포(astrocyte, 95)는 신경조직을 지지하는 신경아교를 이루는 세포중 하나로서 아스트로사이트 또는 성상교세포라고도 하며, 세포체가 작고 여러 방향으로 갈라져 나가는 돌기를 가지고 있으며 뉴런의 구조와 대사를 돕는 역할을 한다. 상기 혈관주위세포(pericyte, 96)는 모세혈관벽은 편평한 내피세포만으로 이루어지고 그 주위를 감싸는 명료한 평활근층이나 결합조직층이 없으며 내피세포의 기저막층에는 산재성으로 결합조직성 세포가 나타나는데 이 세포가 혈관주위세포로서, 식작용을 하는 것으로 알려져 있다.
이상에서 기술한 세포들(92, 93, 94, 95, 96)은 뇌조직 내에 존재하는 세포들로서 뇌 안에서 3차원적으로 존재하고 있으며, 상기 신경혈관단위-온-칩(100)은 혈뇌장벽을 포함하는 생체내 뇌조직을 모방할 수 있도록 이들 뇌조직세포들(92, 93, 94, 95, 96)을 체외에서 성공적으로 공배양할 수 있음을 확인하였다.
여기서, 세포배양이 세포 생물학, 조직엔지니어링, 바이오 메디컬 엔지니어링, 의약품 개발을 위한 약물 동태학 등에서 매우 중요한 단계로서, 시험관 내 세포 배양은 다양한 세포를 다량으로 배양하는 것을 가능하게 한다. 그러나 이 같이 시험관 내 배양된 세포가 생체 내에서 성장된 세포와는 동일하지 않는데, 이는 생물학적 시스템 환경이 체내와 체외가 상이하기 때문이다.
또한, 같은 조직 또는 같은 장기에서 유래된 서로 다른 세포들을 함께 배양하는 공배양은 배양하고자 하는 세포들이 잘 생존하면서 세포들이 가지고 있는 고유의 활성을 그대로 유지할 수 있어야 하는데, 서로 다른 세포들을 함께 배양할 경우 그 조건을 만족시키기 위한 조건을 확립하는 것이 쉽지 않다.
그러나 본 발명은 다양한 종류의 뇌조직세포를 혈뇌장벽을 포함하는 3차원의 뇌조직과 유사하도록 함께 공배양할 수 있는 조건을 조성해 준다. 또한, 본 발명에 따른 상기 세포외기질 모사 물질(70)은 세포외기질을 동일하게 또는 유사하게 구현할 수 있는 물질로서 이에 제한되지는 않으나, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 엘라스틴, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 마트리젤 (Matrigel) 중 적어도 하나를 포함하는 세포외기질, 알지네이트, 폴리에틸렌글라이콜, 실리콘 하이드로젤, 폴리아크릴아마이드, 폴리데틸렌옥사이드, 폴리피롤리딘, 글리코사미노글리칸 및 폴리헤마 중 적어도 하나를 포함하는 하이드로젤, 세포외기질과 상기 하이드로젤의 혼합물, 세포외기질의 화학적 변형체, 하이드로젤의 화학적 변형체, 또는 세포외기질의 화학적 변형체와 하이드로젤의 상기 화학적 변형체의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 복수의 채널(75)은 세포외기질 모사 물질(70)을 관통하여 형성된다. 상기 세포외기질 모사 물질(70)은 하나의 채널(75)을 한정할 수 있다. 상기 복수의 채널(75)은 세포외기질 모사 물질(70)에서 평행하게 위치되지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 복수의 채널(75)은 도 9의 배양액(88)을 관류시킬 수 있다. 각 채널(75)의 내벽에는 뇌미세혈관내피세포 막(91)이 형성되어 있다. 여기서, 상기 세포외기질 모사 물질(70)은 채널(75)의 외벽에 또는 채널(75)의 주변에 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 함유한다. 이 때에, 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)은 세포외기질 모사 물질(70)에 공배양되는 별아교세포(95) 및 혈관주위세포(96)와 함께 혈뇌 장벽(Blood Brain Barrier; BBB)을 형성하고 있다.
상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)은 채널(75)의 내벽을 따라 긴밀하게 위치되어 채널(75)의 내벽을 피복하거나 충분히 덮는다. 한편, 상기 기판(10)은 채널(75)과 동일 개수로 이루어지는 통로(50)를 포함한다. 상기 통로(50)는 셀 고정 웰(20)의 양 측부에서 제1 통로(35)와 제2 통로(45)로 분리되어 기판(10)을 관통하며 채널(75)과 유체적으로 연통되어 있다.
상기 제1 통로(35)와 제2 통로(45)는 제1 측벽(WS1)에서 개구된다. 상술한 바를 고려하면, 상기 신경혈관 단위-온-칩(100)은 기판(10), 세포외기질 모사 물질(70)과 복수의 채널(75)을 구비하여 복수의 채널(75)을 통해 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들과 뇌미세혈관내피세포 막(91)을 접촉시켜 인간 뇌의 혈뇌 장벽(Blood Brain Barrier; BBB)과, 인간 뇌에서 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)의 구조를 모사한다.
상기 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)는 혈뇌장벽(BBB), 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93) 및 미세아교세포(microglia, 94)를 바탕으로 구현된다. 또한, 상기 채널(75)의 외벽이 세포외기질 모사 물질(70)에 접촉함으로써, 상기 신경혈관 단위-온-칩(100)은 인간 뇌에서 혈뇌장벽(BBB)을 포함한 신경혈관단위(NVU)를 모사하는 3차원 공배양을 가능하게 한다.
또한, 상기 기판(10)과 채널(75)의 접촉을 최소화해서, 시험 대상 약물(도면에 미 도시)이 기판(10)에 흡착되어 생체내 기작과 다른 양상을 보이는 것을 피할 수 있다.
도 3 내지 도 9는 도 1의 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법을 설명하는 개략도이다.
도 3 내지 도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법은 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 함유하는 반고체(gel) 상태의 세포외기질 모사 물질(도 7의 70)을 관통하는 채널(도 7의 75)을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우에, 상기 세포외기질 모사 물질(70)은, 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 엘라스틴, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 마트리젤 (Matrigel) 중 적어도 하나를 포함하는 세포외기질, 알지네이트, 폴리에틸렌글라이콜, 실리콘 하이드로젤, 폴리아크릴아마이드, 폴리데틸렌옥사이드, 폴리피롤리딘, 글리코사미노글리칸 및 폴리헤마 중 적어도 하나를 포함하는 하이드로젤, 세포외기질과 하이드로젤의 혼합물, 세포외기질의 화학적 변형체, 하이드로젤의 화학적 변형체, 또는 세포외기질의 화학적 변형체와 하이드로젤의 화학적 변형체의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 채널(75)을 형성하는 단계는, 우선적으로, 평탄한 형상으로 이루어져 상하로 마주보는 하부 면(LS) 및 상부 면(US)과 함께 하부 면(LS) 및 상부 면(US)을 이어주는 제1 측벽(WS1), 상부 면(US)의 중앙 영역에서 상부 면(US)을 관통하여 상부 면(US)으로부터 하부 면(LS)을 향해 연장하도록 하부 면(LS) 및 상부 면(US) 사이에 제2 측벽(WS2)으로 한정되는 셀 고정 웰(20), 그리고 셀 고정 웰(20) 주변에서 적어도 하나의 통로(50)를 포함하는 기판을 준비하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 기판(10)은, 유리(glass)를 포함하는 투명 세라믹류, 폴리디메틸실록세인(PolyDiMethylSiloxane; PDMS)과 에코플렉스(ecoflex) 중 적어도 하나를 포함하는 실리콘고무류, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 폴리우레탄(polyurethane) 중 적어도 하나를 포함하는 엔지니어링 플라스틱류, 투명 세라믹류, 실리콘고무류와 엔지니어링 플라스틱류 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물, 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체, 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체, 또는 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체와 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 통로(50)는 셀 고정 웰(20)의 양 측부에 제1 통로(35)와 제2 통로(45)로 분리되어 형성될 수 있다. 상기 제1 통로(35)와 제2 통로(45)는 기판(10)을 관통하여 기판(10)의 제1 측벽(WS1), 그리고 제1 측벽(WS1)과 마주보는 셀 고정 웰(20)의 제2 측벽(WS2)에서 개구된다. 상기 제1 통로(35)와 제2 통로(45)는 셀 고정 웰(20)을 통해 일직선으로 마주하도록 기판(10)에 위치된다.
상기 제1 통로(35)와 제2 통로(45)의 각각은 제1 측벽(WS1)과 제2 측벽(WS2)에 유입구(IP) 및 유출구(OP)를 가질 수 있다. 상기 채널(75)을 형성하는 단계는, 제1 통로(35), 셀 고정 웰(20)과 제2 통로(45)에 마이크로니들(60)을 삽입하는 단계 및 반액체(sol) 상태의 세포외기질 모사 물질(도면에 미 도시)을 셀 고정 웰(20)에 채우는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 경우에, 상기 마이크로니들(60)은 제1 방향(D1)을 따라 제1 통로(35)를 지나 셀 고정 웰(20)을 경유하여 제2 통로(45)에 삽입될 수 있다.
상기 반액체(sol) 상태의 세포외기질 모사 물질은 셀 고정 웰(20)에서 마이크로니들(60)을 따라 위치하여 마이크로니들(60)과 접촉하고 마이크로니들(60)을 둘러싸서 마이크로니들(60)을 덮을 수 있다. 이 경우에, 상기 반액체 상태의 세포외기질 모사 물질 내에 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들이 함유되어 있는데, 바람직하게는, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron), 미세아교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte) 및 혈관주위세포(pericyte)를 포함할 수 있다.
일 예로써, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron), 신경줄기세포(neural stem cell), 미세아교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte) 및 혈관주위세포(pericyte)로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 채널(70)을 형성하는 단계는, 반액체(sol) 상태의 세포외기질 모사 물질을 경화하여 반고체(gel) 상태의 세포외기질 모사 물질(70)로 변환하는 단계, 및 반고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)로부터 마이크로니들(60)을 제거하여 반고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)을 관통하는 채널(75)을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 반고체(gel) 상태의 세포외기질 모사 물질(70)은 반액체(sol) 상태의 세포외기질 모사 물질에 소정 온도의 열을 가해서 형성될 수 있다. 상기 마이크로니들(60)은 제2 방향(D2)을 따라 기판(10)의 제2 통로(45)를 지나 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)을 경유하여 기판(10)의 제1 통로(35)로부터 분리될 수 있다. 상기 채널(75)을 형성하는 단계가 완료된 후에, 상기 채널(75)의 내벽에 뇌미세혈관내피세포 막(91)을 형성하는 단계가 수행될 수 있다.
상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)을 형성하는 단계는, 채널(75)에 뇌혈관내피 세포(brain endothelial cell, 84)를 주입하여 채널(75)의 내벽에 뇌혈관내피 세포(84)를 고정하는 단계; 및 뇌혈관내피 세포가 포함된 배양액(88)을 채널(75)에 유입시키면서 배양액(88)을 채널(75)의 내벽에 고정된 뇌혈관내피 세포(84)에 접촉시켜 채널(75)의 내벽을 뇌미세혈관내피세포 막(91)으로 피복시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양액(88)은 채널(75)의 내벽에서 뇌혈관내피 세포와 채널(75)의 외벽에서 반 고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)을 통해 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 공배양시킬 수 있다.
상기 뇌혈관내피 세포(83)의 고정은 제1 흐름선(F1)을 따라 기판(10)의 제1 통로(35), 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)과 기판(10)의 제2 통로(45)에 뇌혈관내피 세포 주입액을 흘려 보내고, 뇌혈관내피 세포 주입액의 흐름 동안 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)의 내벽에 뇌혈관내피 세포(84)를 드문드문 도 8과 같이 부착시켜 수행될 수 있다.
이 경우에, 상기 배양액(88)은 제2 흐름선(F2)을 따라 기판(10)의 제1 통로(35), 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)과 기판(10)의 제2 통로(45), 그리고 기판(10)의 제2 통로(45), 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)과 기판(10)의 제1 통로(35)에 반복적으로 흘려 보내질 수 있다. 상기 배양액(88)은 제2 흐름선(F2)을 따라 기판(10)과 세포외기질 모사 물질(70)에 흐르는 동안 채널(75)의 내벽에 드문 드문 부착된 도 8의 뇌혈관내피 세포(84)를 도 9와 같이 증식, 배양 또는 성장시켜 뇌혈관내피 세포(84)를 이용하여 채널(75)의 내벽에 뇌미세혈관내피세포 막(91)을 도 1과 같이 형성할 수 있다.
상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)은 채널(75)의 내벽을 따라 위치되어 채널(75)의 내벽을 덮는다. 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)이 형성된 후에, 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)과 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 이용하여 채널(75)을 통해 인간 뇌의 혈뇌 장벽(Blood Brain Barrier; BBB)과, 인간 뇌에서 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 모사하는 단계가 수행된다. 여기서, 상기 혈뇌 장벽(BBB)과 신경혈관단위(NVU)의 모사 단계는 채널(75) 내에 배양액(88)의 흐름 동안 배양액(88)을 세포외기질 모사 물질(70)에 접촉시켜 세포외기질 모사 물질(70)에서 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 배양시키는 단계; 및 상기 채널(75)을 통해 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 뇌미세혈관내피세포 막(91)에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
이 때에, 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 도 2에 도시된 바와 같이 뇌미세혈관내피세포 막(91)에 접촉되는 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 혈관주위세포(pericyte, 96)를 포함할 수 있다. 상기 혈뇌 장벽(BBB)은 뇌미세혈관내피 세포막(91), 별아교세포(astrocyte, 95)와 혈관주위세포(pericyte, 96)를 포함할 수 있다. 상기 신경혈관단위(NVU)는 혈뇌 장벽(BBB), 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93) 및 미세아교세포(microglia, 94)를 포함할 수 있다.
이를 통해서, 상기 기판(10)과 세포외기질 모사 물질(70)은 세포외기질 모사 물질(70)에서 구현되는 신경혈관단위(NVU)의 구조를 이용하여 신경혈관단위-온-칩(도 1의 100)을 구성하도록 수행될 수 있다. 여기서, 상기 채널(75)의 외벽이 세포외기질 모사 물질(70)에 접촉함으로써 인간 뇌에서 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 신경혈관단위(NVU)를 모사하는 3차원 공배양이 가능하고, 상기 기판(10)과 채널(75)의 접촉을 최소화하여 시험 대상 약물이 기판(10)에 흡착되어 생체내 기작과 다른 양상을 보이는 것을 피할 수 있다.
10; 기판, 20; 셀 고정 웰
35; 제1 통로, 45; 제2 통로
50; 통로, 70; 세포외기질 모사 물질
75; 채널, 91; 뇌혈관내피 세포막
100; 신경혈관단위-온-칩, BBB; 혈뇌 장벽
LS; 하부 면, US; 상부 면
WS1; 제1 측벽, WS2; 제2 측벽

Claims (25)

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  11. 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 함유하는 반고체(gel) 상태의 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 모사 물질(70)을 관통하는 채널(75)을 형성하는 단계;
    상기 채널(75)의 내벽에 뇌미세혈관내피세포 막(91)을 형성하는 단계; 및
    상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)과 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 이용하여 상기 채널(75)을 통해 인간 뇌의 혈뇌 장벽(Blood Brain Barrier; BBB)과, 상기 혈뇌 장벽(BBB)을 포함하는 상기 인간 뇌의 신경혈관단위(NeuroVascular Unit; NVU)를 모사하는 단계를 포함하고,
    상기 채널(75)을 형성하는 단계는 평탄한 형상으로 이루어져 상하로 마주보는 하부 면(LS) 및 상부 면(US)과 함께 상기 하부 면(LS) 및 상기 상부 면(US)을 이어주는 제1 측벽(WS1), 상기 상부 면(US)의 중앙 영역에서 상기 상부 면(US)을 관통하여 상기 상부 면(US)으로부터 상기 하부 면(LS)을 향해 소정 깊이로 연장하도록 상기 하부 면(LS) 및 상기 상부 면(US) 사이에 제2 측벽(WS2)으로 한정되는 셀 고정 웰(20), 그리고 상기 셀 고정 웰(20) 주변에서 상기 채널(75)과 유체적으로 연통하도록 상기 채널(75)과 동일 개수로 이루어진 적어도 하나의 통로(50)를 포함하는 기판(10)을 준비하는 단계를 포함하되,
    상기 세포외기질 모사 물질(70)은,
    피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 엘라스틴, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트, 케라탄 설페이트 및 마트리젤(Matrigel) 를 포함하는 세포외기질,
    알지네이트, 폴리에틸렌글라이콜, 실리콘 하이드로젤, 폴리아크릴아마이드, 폴리데틸렌옥사이드, 폴리피롤리딘, 글리코사미노글리칸 및 폴리헤마를 포함하는 하이드로젤,
    상기 세포외기질과 상기 하이드로젤의 혼합물,
    상기 세포외기질의 화학적 변형체,
    상기 하이드로젤의 화학적 변형체, 또는
    상기 세포외기질의 상기 화학적 변형체와 상기 하이드로젤의 상기 화학적 변형체의 혼합물을 포함하되,
    상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들은 뉴런(neuron, 92), 신경줄기세포(neural stem cell, 93), 미세아교세포(microglia, 94), 별아교세포(astrocyte, 95) 및 혈관주위세포(pericyte, 96)로 이루어진 것을 특징으로 하며,
    상기 혈뇌장벽(BBB)은 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91), 상기 별아교세포(astrocyte, 95)와 상기 혈관주위세포(pericyte, 96)를 포함하고,
    상기 신경혈관단위는 상기 혈뇌장벽(BBB), 상기 뉴런(neuron, 92), 상기 신경줄기세포(neural stem cell, 93)와 상기 미세아교세포(microglia, 94)를 포함하되,
    상기 통로(50)는 상기 셀 고정 웰(20)의 양 측부에 제1 통로(35)와 제2 통로(45)로 분리되어 형성되는 것을 특징으로 하고,
    상기 채널(75)을 형성하는 단계는, 상기 제1 통로(35), 상기 셀 고정 웰(20)과 상기 제2 통로(45)에 마이크로니들(60)을 삽입한 뒤에 반액체(sol) 상태의 세포외기질 모사 물질을 상기 셀 고정 웰(20)에 채우고,
    상기 반액체(sol) 상태의 세포외기질 모사 물질을 경화하여 상기 반고체(gel) 상태의 세포외기질 모사 물질(70)로 변환시키기 위해 소정 온도의 열을 가하며, 소정 온도의 열에 의해 경화된 상기 반고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)로부터 상기 마이크로니들(60)을 제거하여 상기 반고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)을 관통하는 상기 채널(75)을 형성시키는 것을 특징으로 하며,
    상기 마이크로니들(60)의 제거는 상기 기판(10)의 일측에서부터 상기 채널(75)을 경유하여 타측방향으로 분리되는 것을 특징으로 하고,
    상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)을 형성하는 단계는,
    상기 채널(75)에 뇌혈관내피 세포(brain endothelial cell, 84)를 주입하여 채널(75)의 상기 내벽에 상기 뇌혈관내피 세포(84)를 고정하는 단계;
    뇌혈관내피 세포(84)가 포함된 배양액(88)을 상기 채널(75)에 유입시키면서 상기 배양액(88)을 상기 채널(75)의 내벽에 고정된 상기 뇌혈관내피 세포(84)에 접촉시켜 상기 채널(75)의 내벽에 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)으로 피복시키는 단계를 포함하고,
    상기 배양액(88)은 상기 채널(75)의 내벽에서 상기 뇌혈관내피 세포(84)와 상기 채널(75)의 외벽에서 상기 반 고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)을 통해 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 공배양시키는 것을 특징으로 하고,
    상기 뇌혈관내피 세포(84)의 고정은 일측 방향으로 상기 기판(10)의 제1 통로(35)에서 상기 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)을 지나 상기 기판(10)의 제2 통로(45) 측으로 뇌혈관내피 세포 주입액을 흘려 상기 채널(75)의 내벽에 뇌혈관내피 세포(84)를 부분적으로 부착시키고,
    상기 배양액(88)은 상기 뇌혈관내피 세포 주입액을 주입시키는 방향과 동일한 방향으로 상기 기판(10)의 제1 통로(35)에서 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)을 지나 상기 기판(10)의 제2 통로(45)측으로 흘려 보낸 뒤 다시 상기 기판(10)의 제2 통로(45)에서 세포외기질 모사 물질(70)의 채널(75)을 지나 상기 기판(10)의 제1 통로(35)측으로 흘려 보내는 과정을 반복적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서,
    상기 기판(10)은,
    유리(glass)를 포함하는 투명 세라믹류,
    폴리디메틸실록세인(PolyDiMethylSiloxane; PDMS)과 에코플렉스(ecoflex) 중 적어도 하나를 포함하는 실리콘고무류,
    폴리스티렌(polystyrene),폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 폴리우레탄(polyurethane) 중 적어도 하나를 포함하는 엔지니어링 플라스틱류,
    상기 투명 세라믹류, 상기 실리콘고무류와 상기 엔지니어링 플라스틱류 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물,
    상기 투명 세라믹류의 화학적 변형체,
    상기 실리콘고무류의 화학적 변형체,
    상기 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체, 또는
    상기 투명 세라믹류의 상기 화학적 변형체, 상기 실리콘고무류의 상기 화학적 변형체와 상기 엔지니어링 플라스틱류의 상기 화학적 변형체 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 제1 통로(35)와 상기 제2 통로(45)는 상기 기판(10)을 관통하여 상기 기판(10)의 제1 측벽(WS1), 그리고 상기 제1 측벽(WS1)과 마주보는 상기 셀 고정 웰(20)의 제2 측벽(WS2)에서 개구되는 것을 특징으로 하는 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 제1 통로(35)와 상기 제2 통로(45)의 각각은 상기 제1 측벽(WS1)과 상기 제2 측벽(WS2)에 유입구(IP) 및 유출구(OP)를 가지는 것을 특징으로 하는 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제11항에 있어서,
    상기 혈뇌 장벽(BBB)과 신경혈관단위(NVU)의 모사 단계는,
    상기 채널(75) 내에 상기 배양액(88)의 흐름 동안 상기 배양액(88)을 상기 세포외기질 모사 물질(70)에 접촉시켜 상기 세포외기질 모사 물질(70)에서 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 공배양시키는 단계; 및
    상기 채널(75)을 통해 상기 복수 종류의 인간유래 뇌조직 세포들을 상기 뇌미세혈관내피세포 막(91)에 접촉시키는 단계를 포함하는 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제11항에 있어서,
    상기 채널(75)의 외벽이 상기 반 고체 상태의 세포외기질 모사 물질(70)에 접촉함으로써 상기 인간 뇌에서 상기 신경혈관단위를 모사하는 3차원 공배양이 가능하고, 기판(10)과 상기 채널(75)의 접촉을 최소화하여 시험 대상 약물이 상기 기판(10)에 흡착되어 생체내 기작과 다른 양상을 보이는 것을 피할 수 있는 것을 특징으로 하는 신경혈관단위-온-칩의 제조 방법.
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