WO2020262656A1

WO2020262656A1 - マイクロ流体デバイス及びその製造方法、並びに立体組織の培養方法

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Publication number: WO2020262656A1
Application number: PCT/JP2020/025358
Authority: WO
Inventors: 隆司横川; 龍岡田; 良一亀田
Original assignee: 国立大学法人京都大学
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2020-12-30
Also published as: JP2022120216A

Abstract

本発明に係るマイクロ流体デバイスは、デバイス本体と、デバイス本体に設けられた第一の流路と、デバイス本体における第一の流路に隣接し、第一の壁部を介して設けられた血管床保持チャンバーと、デバイス本体に設けられ、血管床保持チャンバーと連通する開口部と、開口部を塞ぐように設けられた隔壁とを備え、第一の壁部には複数の第一のスリットが形成されており、隔壁は除去可能である。

Description

マイクロ流体デバイス及びその製造方法、並びに立体組織の培養方法

　本発明、マイクロ流体デバイス及びその製造方法、並びに該マイクロ流体デバイスを用いた立体組織の培養方法に関する。

　実験動物から摘出した組織、又はＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞等から人工的に作った立体組織を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで長期間培養するために、外部から血管を通じて栄養及び酸素を供給する必要がある。これまで、立体組織培養のための血管床（Vascular Bed）を人工的に構築し、当該血管床を用いて立体組織を培養しながら、立体組織内にある血管と血管床の血管を融合させたり、立体組織内において新たに血管状組織又は血管網（Vascular network）を構築させたりする方法がいくつか報告された。

　特許文献１には、血管形成細胞を含フッ素ポリイミド膜表面上で培養した後、当該膜を反転させてゲル上に載置し、あるいはゲルでポリイミド膜表面を被い、培養を続けることを特徴とする血管様組織形成方法が開示されている。さらに、該血管様組織を内在させたゲル層上にスフェロイドを播種することによって血管・スフェロイド融合体を形成する方法が開示されている。この方法では、血管状組織の周囲を覆うようにスフェロイドが成長しているのが観察され、また、一部においてはスフェロイドと血管状組織の融合も認められた。

　特許文献２には、ゲル内部に培地を灌流するための流路を設け、血管内皮細胞を誘導させ、ゲル内に血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させることを特徴とする細胞シート積層化物の製造方法が開示されている。

　非特許文献１には、血管網と細胞組織を共培養するためのマイクロ流体デバイスが開示されている。該デバイスは、Ｏｐｅｎ－ｔｏｐデバイスと呼ばれ、天井にマイクロポアを有するマイクロ流路（microchannel）で構成されており、リザーバーからマイクロ流路への直接の流体アクセスを提供する。非特許文献１の図１には、細胞スフェロイドがマイクロポアの上に形成され、血管網が該マイクロポアを通して該細胞スフェロイドにまで伸びていることが開示されている。

　しかしながら、特許文献１の方法によって作製した血管・スフェロイド融合体は、一部においてスフェロイドと血管状組織の融合も認められたものの、不完全なものであった。特許文献２の方法では、ゲル内に構築させた血管床上へ細胞シートを積層しても、血管網と細胞シートとは直接接触しておらず、ゲル内の血管が細胞シートまで延びにくいと考えられる。また、非特許文献１のＯｐｅｎ－ｔｏｐデバイスを用いる場合も、細胞スフェロイドと血管床とが直接的に接触できず、血管網はマイクロポアを通じしてしか細胞スフェロイドに延びることできないため、生体組織に近い状態で立体組織を培養することができない。

　一方、マイクロ流体デバイス（microfluidic device）は、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術等の微細加工技術を利用して、微小流路や反応容器を作成し、バイオ研究や化学工学へ応用するためのデバイスを総称している。ｍｉｃｒｏＴＡＳ（micro Total Analysis Systems）又はＬａｂ　ｏｎ　ａ　Ｃｈｉｐ等とも呼ばれている。

特開２００９－２１３７１６号公報国際公開第２０１２／０３６２２５号

Soojung Oh et al.,"Open-top" microfluidic device for in vitro three dimensional capillary beds, Lab Chip,2017,17,3405-3414 Nishimoto Y et al., Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device, Integr., Biol., 2017, 9, 506-518

　本発明は、人工的に血管床を構築し、生体組織により近い状態で立体組織を培養できるデバイス、及び該デバイスを用いて立体組織を培養する方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、上記本発明の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた。本発明者らは以前、マイクロ流体デバイスを用いて、灌流可能な血管網を持つ三次元細胞スフェロイドを構築する方法を開示した（非特許文献２）。具体的には、マイクロ流体デバイスの流路内にヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト肺線維芽細胞（ｈＬＦ）との細胞相互作用により、血管形成性新芽がデバイスからスフェロイドに向かって誘導され、連続的な管腔（血管網）を形成したことも確認した。しかしながら、この血管状組織の誘導形成方法は、ＨＵＶＥＣとｈＬＦとの組み合わせに限定されるものであり、他の細胞種では血管誘導因子を十分に産生できない等の理由で管腔を有する血管網をスフェロイドにつなぐことができない。

　そこで、本発明者らはあらゆる立体組織を培養できるように、上記デバイスをさらに改良し、血管床と立体組織とを近接して培養し、デバイス一つであらゆる立体組織を簡便に培養できる新規なマイクロ流体デバイスを見出した。本発明は、この新しい知見に基づくものである。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスを用いれば、まず隔壁によって塞がれた血管床保持チャンバー内に血管床を構築したのち、隔壁を取り除いて、開口部から立体組織を上記血管床の上に直接的に導入し、さらに培養することで、立体組織内にある血管と血管床の血管とを接続させるか、或いは、血管床から血管が延びて立体組織内において新たに血管網を構築しることで、生体組織により近い状態で立体組織を培養することができる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、第一の流路が一対設けられ、一対の第一の流路のそれぞれが、血管床保持チャンバーに第一の壁部を介して隣接していてもよい。これにより、血管床が血管床保持チャンバーの両側へ延びることができ、より生体組織に近い血管床を構築することができる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、隔壁が血管床保持チャンバーと開口部との間に設けられてもよい。これにより、血管床保持チャンバーの天井（開口部側）に段差が生じず、それにより血管床がより構築し易くなる。一方、本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、隔壁が開口部の高さ方向における一端と他端の間に設けられてもよい。これにより、血管床保持チャンバーの天井（開口部側）に段差が生じるが、血管床が形成できる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、隔壁が化学的方法又は物理的方法によって除去可能な隔壁であってもよく、また、隔壁が水溶性材料から形成される膜状隔壁であってもよい。これにより、隔壁が除去されやすくなる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、第一の壁部における第一のスリットは、スリット幅が５０μｍ～２００μｍとなるように等間隔に形成されていてもよい。これにより、血管床保持チャンバーへの血管床構築に必要な成分を供給しやすく、また最適な太さを有する血管ができ、さらに、等間隔により血管床ができやすくなる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、第一の流路に連通する第一の流体供給部をさらに備えてもよい。これにより、第一の流路への細胞又は血管新生因子を含む流体の供給又は交換が容易にできる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、デバイス本体に設けられた第二の流路をさらに備え、第二の流路は、第一の流路に第二の壁部を介して隣接し、第二の壁部には、複数の第二のスリットが形成されていてもよい。これにより、第一の流路及び血管床保持チャンバーへの血管床構築に必要な成分等を供給できる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、第一の流路が一対設けられ、一対の第一の流路のそれぞれが、血管床保持チャンバーに第一の壁部を介して隣接しており、第二の流路が一対設けられ、一対の第二の流路のそれぞれが、一対の第一の流路のそれぞれに、第二の壁部を介して隣接していてもよい。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、第二の壁部における第二のスリットは、スリット幅が５０μｍ～２００μｍとなるように等間隔に形成されていてもよい。これにより、第一の流路及び血管床保持チャンバーへの血管床構築に必要な成分等を供給しやすくなる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、第二の流路に連通する第二の流体供給部をさらに備えてもよい。これにより、第二の流路への細胞又は血管床構築に必要な成分等を含む流体を容易に供給又は交換できる。

　本発明に係るマイクロ流体デバイスの製造方法は、第一の溝部と、第一の溝部に隣接し、第一の壁部を介して設けられた凹部とを備える第一の基板と、貫通孔を備える第二の基板と、除去可能な隔壁とを用意する工程と、第二の基板の、第一の基板と接する面に、貫通孔を塞ぐように隔壁を設置することで、貫通孔を開口部として形成する工程と、隔壁を介して、第二の基板の、第一の基板と接する面に、開口部が凹部の少なくとも一部に対応する位置に設置されるように、第一の基板を設置することで、凹部を血管床保持チャンバーとして形成する工程とを含む。本発明に係るマイクロ流体デバイスは複雑な構造を有するため、一体成型が不可能である。本発明に係る製造方法によれば、第一の基板、隔壁及び第二の基板を別々に用意し、順に設置することにより、本発明に係るマイクロ流体デバイスを製造することができる。

　本発明に係る製造方法において、第一の基板を設置する工程において、第一の基板と第二の基板とが接するそれぞれの面がプラズマ加工されており、第一の基板が第二の基板と接合するように設置されてもよい。これにより、第一の基板と第二の基板とが強固に接合できる。

　本発明に係る立体組織の培養方法は、本発明に係るマイクロ流体デバイスを用いて、第一の流路に血管新生因子を含む流体を供給し、血管床保持チャンバーに血管内皮細胞を含む培地を供給し、血管床保持チャンバーに血管床を形成させる工程と、隔壁を除去し、形成された血管床の上に立体組織を設置し、培養する工程とを含む。これにより、デバイス一つで生体組織により近い状態で、あらゆる細胞からなる立体組織を長期間に培養することができる。また、第一の流路及びそれにつながった血管床を通して立体組織の内部への経血管的な養分又は薬剤の投与も可能であるため、デバイス上で立体組織を培養しながら、創薬研究、発生若しくは再生医療研究等に利用し得る。

　本発明に係る培養方法において、マイクロ流体デバイスがデバイス本体に設けられた第二の流路をさらに備える場合、第一の流路への血管新生因子の供給は、第二の流路に線維芽細胞を含む培地を供給することによって行ってもよい。

　本発明に係る培養方法において、血管床を形成する工程が、第一の流路に血管内皮細胞を導入することをさらに含んでもよい。これにより、血管床保持チャンバー内の血管内皮細胞が、血管床保持チャンバー外の血管内皮細胞と繋がる傾向にあり、血管床がより構築しやくなる。

　本発明に係る培養方法において、得られた立体組織を単離する工程をさらに含んでもよい。単離された立体組織は、立体組織を用いたｉｎ　ｖｉｖｏの実験、生体移植等に利用され得る。

　本発明のマイクロ流体デバイス及び立体組織の培養方法によれば、より生体組織に近い状態で立体組織を培養することが可能となる。

一実施形態のマイクロ流体デバイスの平面図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスのＡ－Ａ’断面図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスのＢ－Ｂ’断面図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスのＢ－Ｂ’断面図の矩形枠内の拡大図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスの製造方法に用いられる第一の基板の平面図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスの製造方法に用いられる隔壁の平面図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスの製造方法に用いられる第二の基板の平面図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスの第一の基板の作製工程を示す図である。一実施形態のマイクロ流体デバイスの第二の基板の作製工程を示す図である。一実施形態の立体組織の培養方法における血管床を構築する工程を示す図である。一実施形態の立体組織の培養方法における立体組織を構築する工程を示す図である。実施例３の結果を示す図である。実施例４の結果を示す図である。実験例５の隔壁無しデバイスの模式図である。実験例５の結果を示す図である。オープントップのマイクロ流体デバイスの一実施形態の断面図である。オープントップのマイクロ流体デバイスの一実施形態の作製工程を示す図である。オープントップのマイクロ流体デバイスの一実施形態を用いた立体組織の培養方法における血管床及び立体組織を構築する工程を示す図である。オープントップのマイクロ流体デバイスの一実施形態を用いた立体組織の培養方法における血管床及び立体組織を構築する工程を示す図である。実施例７の結果を示す図である。実施例７の結果を示す図である。

　以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、各図において同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

〔マイクロ流体デバイス〕
　図１～図４は、本発明に係るマイクロ流体デバイスの一実施形態を示すが、本発明のマイクロ流体デバイスはこれに限定されない。図１は一実施形態の平面図、図２は該実施形態のＡ－Ａ’断面図、図３は該実施形態のＢ－Ｂ’断面図、図４は図３の矩形枠内部分の拡大図をそれぞれ示す。

　図１～図４に示されるように、一実施形態のマイクロ流体デバイス１は、デバイス本体１と、デバイス本体１に設けられた第一の流路４、デバイス本体１における第一の流路４に隣接し、第一の壁部３を介して設けられた血管床保持チャンバー２と、デバイス本体１に設けられ、血管床保持チャンバー２と連通する開口部６と、開口部６を塞ぐように設けられた隔壁５とを備える。

　マイクロ流体デバイス１は、細胞培養に適した材料から形成されるものであれば、特に限定されない。材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のプラスチック樹脂を挙げることできるが、これらに限定されない。マイクロ流体デバイスの形状も限定されず、大きさはマイクロ流体デバイスとしての通常の大きさであればよく特に限定されない。

　血管床保持チャンバー２は、血管床を形成するための細胞及び培地を収容し、血管床を構築させ、保持するためのチャンバー（空間）である。その形状及び大きさは特に限定されない。血管床保持チャンバー２の高さ（深さ）は、形成する血管床の大きさに応じて適宜設定できるが、例えば、５０μｍ～５００μｍであってもよく、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２５０μｍ、又は１００μｍ～２５０μｍであってもよい。図２における血管床保持チャンバー２の径（最大径）が１～１０ｍｍ、２～８ｍｍ、３～７ｍｍ、３～５ｍｍであってよい。

　マイクロ流体デバイス１は、図１又は図３に示されるように、血管床保持チャンバー２に連通する血管内皮細胞供給部１１をさらに備えてもよい。血管内皮細胞供給部１１によれば、血管床保持チャンバー２に血管床を形成するための血管内皮細胞等の細胞及び各種成分を含む培地等の流体を供給できるようになる。血管内皮細胞供給部１１の形状は特に限定されず、また、その径（最大径）も特に限定されず、目的に応じて適宜に設定できる。

　第一の壁部３は、血管床保持チャンバー２と第一の流路４との間に介在しており、第一の壁部３には複数の第一のスリット２１が形成されている。第一の壁部３は血管床保持チャンバー２を形成するための壁であるとともに、血管床保持チャンバー２と第一の流路４との間に、細胞を含むゲル状細胞外基質が通過しないが、低分子化合物又はタンパク質等の成分が通過できるようにするための壁でもある。ここで、低分子化合物としては、細胞培養に必要な炭素源（糖類）、アミノ酸、ビタミン類、無機塩類等、合成化学物質等が挙げられ、タンパク質としては、窒素源としてのタンパク質、増殖因子や栄養因子など血清由来成分、血管床形成に必要な血管新生因子等が挙げられる。

　血管床保持チャンバー２側の、第一の壁部３の高さは、血管床保持チャンバー２の高さを決定し、第一の流路４側の、第一の壁部３の高さは、第一の流路４の高さを決定し、両者が同じ高さであることが好適である。第一の壁部３の厚さは特に限定されず、例えば、５０μｍ～５００μｍであってもよく、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２５０μｍ、又は１００μｍ～２５０μｍであってもよい。また、第一の壁部３の長さは特に限定されず、例えば、５０μｍ～５００μｍであってもよく、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２５０μｍ、又は１００μｍ～２５０μｍであってもよい。

　第一の壁部３には、複数の第一のスリット２１が形成されており、すなわち、第一の壁部３はマイクロピラー構造を有している。第一の壁部３において、一部の領域にのみ複数の第一のスリット２１が形成されていてもよく、全長にわたって複数の第一のスリット２１が形成されていてもよい。第一のスリット２１は第一の壁部３に設けられた第一の壁部３の高さとほぼ同じ高さの隙間である。第一のスリット２１の形状は特に限定さない。スリット幅は、第一の壁部３の厚さ方向において（例えば、血管床保持チャンバー２側から第一の流路４側へ向かって）同じ幅を有してもよく、異なる幅を有してもよい。例えば、図４に示されるように、断面が台形であるスリットであってもよい。ここで、スリット幅とは最も狭い幅をいう。第一のスリット２１のスリット幅は、細胞を含むゲル状細胞外基質が通過しないが、低分子化合物又はタンパク質等の成分が通過できる幅であればよく、例えば３０μｍ～５００μｍであってよく、４０μｍ～４００μｍ、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２００μｍ、又は５０μｍ～１５０μｍであってよい。また、第一の壁部３において、複数の第一のスリット２１が等間隔で形成されることが好適である。それによって、複数の血管が等間隔かつ等直径で形成され得、均一な流れを立体組織に与えることができる。また、このスリット幅は、血管床保持チャンバー内に液状のゲル培地を充填する際に、液状のゲル培地が表面張力によって漏れ出さない程度のスリット幅である。

　第一の流路４は、流体を収容し、血管床保持チャンバー２へと供給するための流路である。該流体は、血管床保持チャンバー２に保持される、血管床を形成するための細胞が血管床を形成するために必要な血管新生因子等の成分を含む。また、第一の流路４は細胞を収容してもよい。該細胞は、血管床保持チャンバー２に保持される、血管床を形成するための細胞と同じ細胞であってよい。第一の流路４は、第一の壁部３を介して、血管床保持チャンバー２に隣接している。これにより、第一の流路４に収容される流体に含まれる成分が、濃度勾配によって、第一の壁部３上の複数の第一のスリット２１を通過して血管床保持チャンバー２へと拡散されていく。第一の流路４は、第一の壁部３を介して血管床保持チャンバー２と隣接する領域のほかに、後述の第一の流体供給部へと連通する領域を含んでもよい。この第一の流体供給部へと連通するための領域の壁は、スリットを有さなくてもよい。

　第一の流路４の形状は特に限定されず、例えば、血管床保持チャンバー２の全体を囲むように形成される１本の流路であってもよく、血管床保持チャンバー２の周りを部分的に又は断続的に囲むように形成される２本以上の流路であってもよい。また、第一の流路４の底面の形状も限定されない。一実施形態では、図１～図３に示されるように、第一の流路４が一対設けられ、一対の第一の流路４のそれぞれが、血管床保持チャンバー２に第一の壁部３を介して隣接している。一対の第一の流路４は、血管床保持チャンバー２と隣接するそれぞれの領域において、平行して延伸していることが好適である。すなわち、血管床保持チャンバー２が一対の第一の流路４によって挟まれている。これにより、左右対称構造を有する血管床を形成され得、形成された血管床を介した立体組織への酸素や養分の供給が均一にできる。

　第一の流路４の高さ（深さ）は特に限定されず、例えば３０μｍ～５００μｍであってよく、４０μｍ～４００μｍ、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２００μｍ、又は５０μｍ～１５０μｍであってもよい。均一の血管床を形成するために、第一の流路４の高さを、血管床保持チャンバー２及び第一の壁部３の高さと同じ高さにするのが好適である。第一の流路４の幅は例えば１００μｍ～５０００μｍであってよく、３００μｍ～３０００μｍ、５００μｍ～２０００μｍ、又は５００μｍ～１５００μｍであってもよい。

　隔壁５は、後述の開口部６を塞ぐように設けられた蓋である。ここで、開口部６を塞ぐこととは、開口部６が実質的に塞がれていることをいい、すなわち、隔壁５によって血管床保持チャンバー２に保持されている血管内皮細胞を含む培地が隔壁５の外（開口部６側）に漏れ出さない程度に塞がれていることをいう。血管内皮細胞を含む培地が漏れ出さなければ、例えば通気できる程度の隙間があってもよい。これにより、血管床保持チャンバー２の開口部６側（天井側）が塞がれ、すなわち、この隔壁５が血管床保持チャンバー２の天井の一部となる。それによって、血管床が形成されやすくなる。一方で、血管床を構築したのち、隔壁５があると、立体組織を血管床に接触させることができず、立体組織を培養することができない。したがって、隔壁５が除去可能である必要がある。血管床を構築したのち、隔壁５を除去することで、立体組織を血管床に接触さることができ、立体組織を培養することができる。

　隔壁５は、開口部６を実質的に塞ぐことができれば、血管床保持チャンバー２と開口部６との間、又は、開口部６内の任意の領域、すなわち、開口部６の高さ方向における一端と他端の間の任意の位置に設けられてもよい。デバイスの作製容易さの観点から、隔壁５は血管床保持チャンバー２と開口部６との間に設けられることが好適である。この場合、血管床保持チャンバー２の天井が凡そ平らであり、そのため、血管床保持チャンバー２は深さ方向において段差がないため、後述の血管内皮細胞の均一な播種ができ、それによって血管床が形成されやすいと考えられる。一方、隔壁５は開口部６内に設けられる場合、血管床保持チャンバー２の天井は、開口部６へ一部突出することとなり、そのため、血管床保持チャンバー２は深さ方向において段差があり、後述の血管内皮細胞の均一な播種ができない場合があるが、血管床が形成し得る。したがって、血管床保持チャンバー２の天井における、隔壁５とそれ以外の天井部分との段差が小さければ小さいほどよくて、段差がないことが最も好ましい。段差がある場合、この段差は例えば５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１００μｍ以下又は５０μｍ以下であることが好ましい。ここで、段差とは、開口部６の高さ方向において、血管床保持チャンバー２に近い末端から隔壁５までの距離を意味する。

　隔壁５は、血管床に影響を与えることなく除去できるものであれば特に限定されず、例えば、化学的方法又は物理的方法によって除去可能であってよい。化学的方法としては、例えば、キレート剤又は酵素によって溶解することによって除去する方法が挙げられ、物理的方法としては、例えば、熱、紫外線、ピンセット等によって除去する方法が挙げられる。

　隔壁５の形状は、開口部６を塞ぐことができれば特に限定されないが、例えば、シート状若しくは膜状であってよく、栓状であってもよい。隔壁５がシート状又は膜状である場合は、その大きさが開口部６の断面と同じ又はそれよりも大きくてもよく、その厚みは例えば１～１００μｍ又は１０～５０μｍであってよい。隔壁５は、水溶性材料から形成されてもよい。ここで、水溶性材料とは、水又は水溶液に溶ける性質を有する材料をいう。水溶性材料としては、例えばキレート剤又は酵素によって溶解可能な材料であってもよく、血管床を構築するまでの数日間の長期培養によって自然に溶解可能な材料であってよい。隔壁５はこれらの水溶性材料から形成される膜状隔壁であってよい。水溶性材料としては、アルギン酸、ヒアルロン酸、セルロース、キトサン、キチン、澱粉、デキストラン、ヘパリン、カルボキシメチルセルロース、アガロース等の多糖類及びそれらの塩、コラーゲン、フィブリン等のタンパク質、並びに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール塩（ＰＧＡ）等のポリマーが挙げられ、特にアルギン酸塩が好ましく用いられる。アルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。また、このような材料を溶解できるキレート剤としては、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸等が挙げられ、酵素としては、セルラーゼ、キチナーゼ、コラーゲナーゼ、プラスミン等が挙げられる。

　開口部６は、デバイス本体１に設けられ、血管床保持チャンバー２と連通する開口である。ここで、開口部６と血管床保持チャンバー２とが連通することとは、隔壁５の位置によって、使用する前において連通している場合と、使用時において隔壁５を除去することによって連通可能となる場合の両方を含む。すなわち、隔壁５が開口部６の内部に位置する場合、開口部６と血管床保持チャンバー２とが、使用前に連通しているが、隔壁５が開口部６と血管床保持チャンバー２との間に位置する場合、開口部６と血管床保持チャンバー２とが使用前に連通しておらず、使用時において隔壁５の除去によって連通する。開口部６は、立体組織を投入するための投入口となっており、また、立体組織を収容し、培養するための空間でもある。隔壁５を除去することによって、開口部６を介して投入された立体組織は、血管床保持チャンバー２に形成され、保持された血管床と直接接触することになる。開口部６の形状は特に限定されず、また、その径（最大径）も特に限定されず、所望の立体組織の大きさによって適宜に設定できる。開口部６は、血管床保持チャンバー２の上部開口（開口部６側の開口）と同じ大きさであるか、それよりも小さい開口であってよい。開口部６の高さは、所望の立体組織を収容できる高さであれば、特に限定されない。開口部６は、高さ方向において同じ径を有する空間であってもよく、異なる径を有する複数の空間（部分）を有してもよい。

　マイクロ流体デバイス１は、図１又は図３に示されるように、第一の流路４に連通する第一の流体供給部９をさらに備えてもよい。第一の流体供給部９によれば、第一の流路４に血管新生因子等の成分のみならず細胞をも含む培地等の流体を供給できるようになり、これにより、血管新生因子等の成分が、第一の流路４を通じて血管床保持チャンバー２へ供給される。第一の流体供給部９の形状は特に限定されず、また、その径（最大径）も特に限定されず、目的に応じて適宜に設定できる。

　マイクロ流体デバイス１は、デバイス本体に設けられた第二の流路８をさらに備えてもよく、第二の流路８は、第一の流路４に第二の壁部７を介して隣接し、第二の壁部７には、複数の第二のスリット２２が形成されていてもよい。第二の流路８は第一の流路４と同様な構造を有し、また、第二の壁部７及び第二のスリット２２は、それぞれ第一の壁部３及び第一のスリット２１と同様な構造を有してよい。第二の流路８によれば、第一の流路４に血管新生因子等の血管床を構築するために必要な成分を供給できる。第二の流路８は、第一の流路４と同様に、血管新生因子等の成分を含む流体のほか、細胞を含む培地をも収容し得る。第二の流路８に収容される細胞は、例えば血管新生因子を産生する細胞であってよい。

　マイクロ流体デバイス１において、一実施形態では、第一の流路４が一対設けられ、一対の第一の流路４のそれぞれが、血管床保持チャンバー２に第一の壁部３を介して隣接しており、第二の流路８が一対設けられ、一対の第二の流路８のそれぞれが、一対の第一の流路４のそれぞれに、第二の壁部７を介して隣接していてもよい。一対の第一の流路４は、血管床保持チャンバー２と隣接するそれぞれの領域において平行して延伸しており、一対の第二の流路８は、第一の流路４と隣接するそれぞれの領域において平行して延伸していることが好適である。これにより、複数の血管が等間隔かつ等直径で形成され、均一な流れを立体組織に与えることができる。

　マイクロ流体デバイス１において、第二の壁部７における第二のスリット２２のスリット幅は特に限定されず、例えば３０μｍ～５００μｍであってよく、４０μｍ～４００μｍ、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２００μｍ、又は５０μｍ～１５０μｍとなるように等間隔に形成されていてもよい。これにより、第一の流路４及び血管床保持チャンバー２への血管新生因子等の供給がしやすくなる。

　マイクロ流体デバイス１において、一実施形態では、図１又は図３に示されるように、第二の流路８に連通する第二の流体供給部１０をさらに備えてもよい。第二の流体供給部１０によれば、第二の流路８に血管新生因子等の成分のみならず細胞をも含む培地等の流体を供給できるようになり、これにより、血管新生因子等の成分が、第二の流路８を通じて、第一の流路４、さらに血管床保持チャンバー２へ供給される。第二の流体供給部１０の形状は特に限定されず、また、その径（最大径）も特に限定されず、目的に応じて適宜に設定できる。

　別の実施形態のマイクロ流体デバイス１において、隔壁５は開口部６の高さ方向における一端と他端の間に設けられている。この場合、血管床保持チャンバー２の天井が平ではなく、開口部６へ一部突出することとなり、そのため、血管床保持チャンバー２は深さ方向において段差があるが、血管床が形成し得る。

　別の実施形態のマイクロ流体デバイス１は、例えば図１６に示す断面を有するものであってもよい。この断面は、図１の平面図におけるＡ－Ａ’軸に相当する位置の軸での断面図である。以下、この実施形態のマイクロ流体デバイス１を「オープントップのマイクロ流体デバイス」と呼ぶ場合がある。以下、図１６を参照しながら、オープントップのマイクロ流体デバイスの構造を説明する。なお、以下にて説明していない構造は、例えば図１～４に示す、一実施形態のマイクロ流体デバイス１と同じ構造を有してもよい。

　オープントップのマイクロ流体デバイス１において、隔壁５によって、開口部６が開口部６の高さ方向において２つの空間（部分）、すなわち、第一の部分６１と第二の部分６２とに分けられる。第一の部分６１は、開口部６の高さ方向において、血管床保持チャンバー２に近い開口部６の末端（すなわち、血管床保持チャンバー２の天井の延長線上の開口部６の末端）から、隔壁５の血管床保持チャンバー２側の端面までの空間を指し、第二の部分６２は、隔壁５の血管床保持チャンバー２側の端面と反対側の端面から、血管床保持チャンバー２から遠い開口部６の末端までの空間を指す。第一の部分６１と第二の部分６２とが併せて開口部６を構成しており、隔壁５が設けられる場合は、第一の部分６１と第二の部分６２は連通していないが、隔壁５が除去されると、両者が連通する。

　オープントップのマイクロ流体デバイス１において、血管床保持チャンバー２の深さ方向において、隔壁５とそれ以外の天井部分との段差、すなわち、開口部６の第一の部分６１の高さ（深さ）ａは、血管床が形成しやすい観点から、例えば５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１００μｍ以下又は５０μｍ以下であることが好ましい。また、開口部６の第一の部分６１は、血管床保持チャンバー２の上部開口（開口部６側の開口）と同じ大きさであるか、それよりも小さい開口であってよい。開口部６の第一の部分６１の径（最大径）ｂは特に限定されないが、例えば、５００μｍ～５０００μｍ、又は１０００μｍ～３μｍであってもよい。隔壁５は、第一の部分６１を塞ぐために、第一の部分６１の径（最大径）よりも大きい径（最大径）を有する。

　開口部６の第二の部分６２は、立体組織を投入するための投入口となっており、また、立体組織を収容し、培養するための空間でもある。隔壁５を除去することによって、開口部６の第二の部分６２を介して投入された立体組織は、血管床保持チャンバー２に形成され、保持された血管床と直接接触することになる。開口部６の第二の部分６２の形状は特に限定されず、また、その径（最大径）も特に限定されず、所望の立体組織の大きさによって適宜に設定できる。開口部６の第二の部分６２の径（最大径）は、開口部６の第一の部分６１の径（最大径）よりも大きい。これより、隔壁５を容易に設置し、また、物理的に除去することができる。開口部６の第二の部分６２の高さ、すなわち、隔壁５の血管床保持チャンバー２側の端面と反対側の端面から、血管床保持チャンバー２から遠い開口部６の末端まで距離は、所望の立体組織を収容できる高さであれば、特に限定されない。

　オープントップのマイクロ流体デバイス１において、開口部６の第一の部分６１は、血管床を形成するための血管床保持チャンバー２と連通しているため、血管床は、血管床保持チャンバー２のみならず、開口部６の第一の部分６１の中にも形成される。開口部６の第二の部分６２は、培地などの液体を収容できる。隔壁５が除去された後、第一の部分６１と第二の部分６２とが連通するため、第二の部分６２に収容される液体中の成分と第一の部分６１及び血管床保持チャンバー２に収容される、血管内皮細胞を含む培地とが成分の交換が可能となる。なお、血管内皮細胞を含む培地がゲル培地である場合、血管内皮細胞又は血管内皮細胞が形成した血管床は、開口部６の第二の部分６２へ移動できない。

　オープントップのマイクロ流体デバイス１の隔壁５は、シート状又は膜状であってよく、隔壁５は、開口部６の第一の部分６１を塞ぐように置けば簡単に設置することができる。また、隔壁５は、化学的除去できるものであってもよく、物理的除去できるものであってもよい。化学的除去できるものは、上述のとおりである。物理的除去できるものである場合、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）等の材料からなるものであってよい。所定のサイズを有する隔壁５の作製は、当業者にとって通常の方法で行ってよい。物理的除去する方法は、例えばピンセット等の器具を用いて取り除くことが挙げられる。

〔マイクロ流体デバイスの製造方法〕
　本発明に係るマイクロ流体デバイスは構造が複雑であるため、一体成型が不可能である。本発明に係るマイクロ流体デバイスの製造方法は、第一の基板、隔壁及び第二の基板をそれぞれ用意し、順に設置することにより、本発明に係るマイクロ流体デバイスを製造することができる。以下、図５～１０を参照して、マイクロ流体デバイスの製造方法の一例を説明する。

＜第一の工程＞
　一実施形態において、マイクロ流体デバイス１の製造方法の第一の工程は、図５に示される第一の基板１００と、図７に示される第二の基板２００と、図６に示される除去可能な隔壁５とを用意する工程である。

（第一の基板）
　図５に示される第一の基板１００は、第一の溝部１０４と、第一の溝部１０４に隣接し、第一の壁部３を介して設けられた凹部１０２とを備える。第一の溝部１０４は、マイクロ流体デバイス１における第一の流路４を形成するための溝であり、凹部１０２はマイクロ流体デバイス１における血管床保持チャンバー２を形成するための凹部である。第一の基板１００は、さらに第二の溝部１０８を備えてもよい。第二の溝部１０８は、マイクロ流体デバイス１における第二の流路８を形成するための溝である。第一の溝部１０４及び第二の溝部１０８は、それぞれ第一の流路４及び第二の流路８を形成するための溝部であり、天井が塞がれていないことを除き、第一の流路４及び第二の流路８と同じ構造を有する。

　第一の基板１００の作製方法は、特に限定されない。以下、一例として、ソフトリソグラフィーによる作製方法について説明する。また、第一の基板１００の作製方法の具体例は、実施例１に示されている。なお、図８及び図９は模式図であり、構造を正確に表していない場合がある。図８及び図９に示されるそれぞれの構造物の構造に関しては、図１～図７を参照されたい。

　一実施形態において、ソフトリソグラフィー等の微細な立体構造を形成できる技術を用いて所望のパターンを有する硬化物を形成することによって第一の基板１００を作製する。例えば、まず支持部材１１１の上に、ソフトリソグラフィーに用いられる材料を載せ、予め設計したパターン１１２にしたがって、上記材料をパターン１１２にパターン化し、そして、第一の基板１００を形成するための材料をパターン１１２に密着させ、硬化させ、硬化物１１３を得る（図８の（ａ））。

　ここで、支持部材１１１としては、パターン１１２と分離可能なものであることが好適であり、例えば、パターン１１２を破壊せずに、物理的又は化学的方法で除去できる材料からなる支持部材であってよい。具体的には、例えばシリコンウェハ、ガラス基板等の材料が挙げられる。支持部材１１１がシリコンウェハ又はガラス基板である場合は、支持部材１１１の上にパターン１１２を形成したのち、支持部材１１１をトリクロロ－（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シランで処理すると、支持部材１１１を容易に取り除くことができる。

　ソフトリソグラフィーに用いられる材料としては、通常用いられるものであればよく、例えばエポキシ樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられる。

　パターン１１２は、第一の基板１００と反転するパターンであり、すなわち、第一の基板１００上における凹部である、凹部１０２、第一の溝部１０４、及び第二の溝部１０８は、パターン１１２において凸部となり、第一の基板１００上における凸部である、第一の壁部３及び第二の壁部７は、パターン１１２において凹部となる。

　第一の基板１００を形成するための材料としては、流体としてパターン１１２に密着でき、かつ、硬化させることができる材料であれば特に限定されず、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の熱硬化性樹脂のプレポリマーであってもよい。ＰＤＭＳプレポリマーとしては、ＰＤＭＳ主剤に硬化剤を混入させたものが挙げられる。ポリマー主剤：硬化剤の比率は特に限定されないが、例えば、５：１～１５：１であってもよい。

　プレポリマーをパターン１１２に密着させるため、スピンコートを用いてもよい。また、気泡が入らないように、真空チャンバー内で脱気してもよい。プレポリマーの硬化は、通常の硬化方法であれば特に限定されないが、例えば、７０～９０℃で１０～１８時間静置してもよい。

　次に、図８の（ｂ）に示されるように、硬化後、第一の基板１００をパターン１１２から剥がしたのち、ひっくり返し、適切な支持体１１４に設置してもよい。支持体１１４としては特に限定されず、たとえば、カバーガラス等が挙げられる。

（隔壁）
　隔壁５は上述とおりであり、その一例は図６に示されているが、これに限定されない。隔壁５の作製方法は、特に限定されず、溶解可能な材料によって適宜に条件設定できる。隔壁５は、水溶性材料からなる材料から形成される膜状隔壁である場合、一般的な成膜方法にしたがって所望の厚み及びサイズの薄膜とすることができる。例えばスピンコートして硬化させることにより製作できる。

　隔壁５がアルギン酸塩膜の場合、例えば、カルシウムイオンと架橋反応させることにより作製することができる。適切な濃度のアルギン酸塩水溶液を乾燥させることによって成膜させた後、カルシウム塩溶液に浸し、架橋反応させ、その後例えば２枚のガラス板で挟み圧力をかけることにより均一な厚みを有する薄膜に成形し、さらに所望のサイズに切断することによって作製できる。

（第二の基板）
　図７に示される第二の基板２００は、第二の基板本体２００に設けられた貫通孔２０６を備える。貫通孔２０６は、マイクロ流体デバイス１における開口部６を形成するための貫通孔である。第二の基板２００は、さらに、第一の流体供給貫通孔２０９、第二の流体供給貫通孔２１０、及び血管内皮細胞供給貫通孔２１１を備えてもよい。これらの貫通孔は、それぞれ、マイクロ流体デバイス１における第一の流体供給部９、第二の流体供給部１０、及び血管内皮細胞供給部１１を形成するための貫通孔である。これらの貫通孔は、それぞれ対応する供給部とは同じ構成を有する。

　第二の基板２００の作製方法は特に限定されず、所望の大きさのポリマー基板の所望の位置に貫通孔２０６等の貫通孔を設けてあればよい。また、第二の基板２００の作製方法の具体例は、実施例１に示されている。

　隔壁５が血管床保持チャンバー２と開口部６との間に設けられる場合、第二の基板２００において、隔壁５を設置するための空間を設けることが好適である。この空間は、例えば、図９の（ａ）に示されるように、型３０２によって予め設けることができる。

＜第二の工程＞
　マイクロ流体デバイス１の製造方法の第二の工程は、第二の基板２００の、第一の基板１００と接する面に、貫通孔２０６を塞ぐように隔壁５を設置することで、貫通孔２０６を開口部６として形成する工程である。隔壁５の設置方法は特に限定されず、例えば、第一の基板１００と第二の基板２００の間に挟まれるように設置してもよい。ここで、第二の基板２００の、第一の基板１００と接する面を、第二の基板２００の底面と呼び、また、第一の基板１００の、第二の基板２００と接する面を第一の基板の頂面と呼ぶ。

＜第三の工程＞
　マイクロ流体デバイス１の製造方法の第三の工程は、隔壁５を介して、第二の基板２００の、第一の基板１００と接する面（すなわち、第二の基板２００の底面）に、開口部６が凹部１０２の少なくとも一部に対応する位置に設置されるように、第一の基板１００を設置することで、凹部１０２の頂面の開口（天井）が、隔壁５及び第二の基板２００の底面によって塞がれ、それによって凹部１０２を血管床保持チャンバー２として形成する工程である。

　第三の工程によって、第一の基板１００の頂面の開口の大部分が、隔壁５及び第二の基板２００の底面によって塞がれており、それによって、血管床保持チャンバー２のほか、第一の流路４及び第二の流路８も形成されている。一方、第一の溝部１０４（すなわち、第一の流路４）及び第二の溝部１０８（すなわち、第二の流路８）の末端は、図１に示されているように、第二の基板２００の底面によって塞がれず、それぞれ第一の流体供給貫通孔２０９（すなわち、第一の流体供給部９）及び第二の流体供給貫通孔２１０（すなわち、第二の流体供給部１０）に連通している。また、凹部１０２（すなわち、血管床保持チャンバー２）の末端が第二の基板２００の底面によって塞がれず、血管内皮細胞供給部１１に連通している。

　第一の基板１００と第二の基板２００とが強固に接合してよく、そのために、接着剤を用いてもよく、又は接触面のプラズマ加工を行ってもよい。ＰＤＭＳ又はガラス等の（－Ｓｉ－Ｏ－）基を持つ材料の表面がプラズマ加工により、接触面同士で（－Ｓｉ－Ｏ－Ｓｉ－）からなるシロキサン結合が生じ、接合は強固なものとなる。

　本発明のマイクロ流体デバイスの製造方法にしたがって製造されたマイクロ流体デバイス１においては、隔壁５が血管床保持チャンバー２と開口部６との間に設けられる。作製されたマイクロ流体デバイス１は、細胞培養に供される前に、ＵＶ照射等によって滅菌を行ってもよい。

　上記マイクロ流体デバイスの製造方法は一例に過ぎず、他の方法によっても本願発明のマイクロ流体デバイスを製造することが可能である。例えば、上記製造方法の改変法としてＰＤＭＳプレポリマーをモールドに流し込み、図２に示す各流路（第一の流路４、第二の流路８）及び各供給部（第一の流体供給部９、第二の流体供給部１０、血管内皮細胞供給部１１）を形成する各壁部（第一の壁部３、第二の壁部７等）と、図９の（ｂ）に示す第二の基板２００の一例であるポリマー基板３０４とが一体となった基板を作製したのち、隔壁５を所望の位置に貼り付け、最後に各流路の底部となる基板を接合する製法が挙げられる。

　別の実施形態のマイクロ流体デバイス１（オープントップのマイクロ流体デバイス１）の製造方法は、上記一実施形態のマイクロ流体デバイス１の製造方法と異なってもよい。以下、図１７を参照して、オープントップのマイクロ流体デバイスの製造方法の一例を説明する。

　図１７に示すように、オープントップのマイクロ流体デバイスの製造方法は、下層基板４０５、前中層基板４０１、前上層基板４０２、及び隔壁５を用意し、これらを重ね、さらに各貫通孔を設けることによって製造することができる。隔壁５は、ＰＥＴ製膜（ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ．米国）等の膜を例えば生検パンチ等で所望の形状及びサイズに切り抜くことで作製できる。

　工程（ａ）において、支持部材１１１の上に、予め設計し、形成した第二のパターン１２２を載せ、さらに前中層基板４０１を形成するためのプレポリマー１２３を滴下等によって載せる（図１７の（ａ））。ここで、支持部材１１１は上述のとおりであり、中層基板４０３を形成するためのプレポリマー１２３は上述の第一の基板１００を形成するためプレポリマーと同じであってよい。第二のパターン１２２は、中層基板４０３を形成するためのパターンであり、前中層基板４０１と反転の構造を有する。

　工程（ｂ）において、スピンコートによって、プレポリマー１２３を第二のパターン１２２に密着させてから、ポリマーを硬化させることにより、前中層基板４０１を得る（図１７の（ｂ））。ここで、スピンコート及び硬化は上述のとおりである。前中層基板４０１は、第一の壁部３及び第二の壁部７を備え、また、血管床保持チャンバー２、第一の流路４及び第二の流路８のそれぞれを形成するための、チャンバー凹部４０８、第一の流路溝部４０６及び第二の流路溝部４０７を備える（図１７の（ｅ））。

　工程（ｃ）において、前上層基板４０２を用意し、前中層基板４０１のチャンバー凹部４０８の反対側の平面に、前中層基板４０１と接合させる（図１７の（ｃ））。前上層基板４０２が開口部６の第二の部分６２に対応する貫通孔を有する（図１７の（ｃ）、（ｆ））。前上層基板４０２の作製方法は実施例６に記載されている。前上層基板４０２の外周は、前中層基板４０１の外周と同じサイズを有することが好ましく、また、前上層基板４０２の材料は前中層基板４０１の材料と同じであってよい。接合は、例えば、前上層基板４０２と前中層基板４０１が接するそれぞれの面をプラズマ加工し、前上層基板４０２が前中層基板４０１と接合するように設置されてもよい。これにより、両者が強固に接合できる。

　工程（ｄ）において、接合されて一体化された前上層基板４０２及び前中層基板４０１を支持部材１１１及び第二のパターン１２２から外す（図１７の（ｄ））。支持部材１１１及び第二のパターン１２２から前上層基板４０２及び前中層基板４０１を取り除きやすくするため、支持部材１１１及び第二のパターン１２２を予めトリクロロ－（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ）等で処理してもよい。

　工程（ｅ）において、前中層基板４０１のチャンバー凹部４０８の天井の一部を生検パンチ等でくり抜き、所望の位置及び径（最大径）を有する開口部６の第一の部分６１を形成する（図１７の（ｅ））。また、接合されて一体化された前上層基板４０２及び前中層基板４０１を、例えば、生検パンチで穿孔し、第一の流体供給部９、第二の流体供給部１０、及び血管内皮細胞供給部１１のそれぞれに対応する貫通孔を作製し、中層基板４０３と上層基板４０４とが一体化した基板を得る。

　工程（ｆ）において、一体化した上層基板４０４及び中層基板４０３を、上層基板４０４、中層基板４０３及び下層基板４０５の順になるように、下層基板４０５と接合される（図１７の（ｆ））。下層基板４０５は、シリコンウェハ、ガラス基板等の材料からなるものであってよい。接合は、例えばプラズマ処理によって接合すればよい。最後に、隔壁５を工程（ｅ）で得られた中層基板４０３における開口部６の第一の部分６１の上端を接するように設置し、開口部６を塞ぎ、オープントップのマイクロ流体デバイスを得ることができる。

〔立体組織の培養方法〕
　本発明に係る立体組織の培養方法は、本発明に係るマイクロ流体デバイス１を用いて、第一の流路４に血管新生因子を含む流体を供給し、血管床保持チャンバー２に血管内皮細胞を含む培地を供給し、血管床保持チャンバー２に血管床を形成させる工程と、隔壁５を除去し、形成された血管床の上に立体組織を設置し、培養する工程とを含む。

　図１０及び図１１は立体組織の培養方法のプロセスの一例を示す。なお、図１０及び図１１中の（１ａ）～（５ａ）は、図５中の破線の矩形枠内部分の模式図であり、図１０及び図１１中の（１ｂ）～（５ｂ）は図１のマイクロ流体デバイス１のＡ－Ａ’断面の模式図である。図１０及び図１１は、分かりやすく説明するために、マイクロ流体デバイス１の構造を正確に表していない場合があるため、示されるそれぞれの構造物の構造に関しては、図１～図７を参照されたい。

　図１０の（１ａ）及び（１ｂ）は、使用される前のデバイスを示す。（２ａ）及び（２ｂ）は、血管床保持チャンバー２に血管内皮細胞を含む培地を導入し、一対の第一の流路４に流体を導入し、開口部６に流体を導入し、また、血管新生因子の代わりに、一対の第二の流路８に線維芽細胞を導入することを示す。ここで、開口部６に導入される流体は、一対の第一の流路４に導入される流体、すなわち、血管床を形成するための細胞が血管床を形成するために必要な血管新生因子等の成分を含む流体、と同じものであってもよい。（３ａ）及び（３ｂ）は、さらに、一対の第一の流路４に血管内皮細胞を導入し、血管床が形成されていることを示す。

　図１１の（４ａ）及び（４ｂ）は、血管床がさらに延び、第一の流路４と連通すること、及び、隔壁５を除去したのち、立体組織を血管床の上に載せることを示し、（５ａ）及び（５ｂ）は、立体組織の内部まで血管床からの血管が延びていることを示す。

　血管床保持チャンバー２に導入される血管内皮細胞は、血管床を形成する血管内皮細胞であり、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の動物由来の血管内皮細胞であってもよく、またヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化誘導して得られた血管内皮細胞であってよく、また、静脈内皮細胞であることが好適であり、例えば臍帯静脈内皮細胞が好適である。

　血管内皮細胞を含む培地は、特に血管内皮細胞を培養するための必要な炭素源、窒素源、ビタミン類、無機塩類、合成化学物質、血清由来成分等の成分を含んでいるものであり、当業者が任意に選択できるものである。血管内皮細胞の自己組織化及び管腔形成能を利用して血管床を形成しやすいように、ゲル状培地であることが好適である。ゲル状培地は、例えば液体培地にゲル化成分を添加して、適切な硬さのゲル状培地としてもよい。ゲル化成分としては、フィブリン、コラーゲン、寒天、アガロース等が挙げられる。ゲル化成分がフィブリンである場合、培地中におけるゲル化成分の濃度は２～１０ｍｇ／ｍＬであってよい。血管内皮細胞を含むゲル培地を血管床保持チャンバー２への導入は、溶解したゲル培地に所望の濃度となるように血管内皮細胞を懸濁したのち、血管内皮細胞供給部１１を通じ、該懸濁液をピペット等によって添加し、ゲル化させることによって行うことができる。

　血管新生因子とは、血管新生に関与する因子であり、本発明の培養方法使用される血管新生因子は特に限定されず、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）等が挙げられ、特にヒト血管内皮増殖因子、例えばヒト線維芽細胞によって産生されるヒト血管内皮増殖因子であることが好適である。

　血管新生因子の濃度は、血管新生因子の種類、又は血管床保持チャンバー２内の血管内皮細胞の濃度によって適宜に調整してよく、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬであってよく、５ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬであってよい。ここで血管新生因子の濃度とは、血管床保持チャンバー２と第一の流路４、さらに第二の流路８との間に濃度平衡に達した時に濃度を意味する。第一の流路４等に血管新生因子を導入する時の導入時濃度は、所望の血管新生因子の濃度、並びに、血管床保持チャンバー２、第一の流路４及び第二の流路８の容量に基づき、計算できる。

　血管新生因子そのものを供給してもよく、血管新生因子を産生する細胞をマイクロ流体デバイス１に導入して、ｉｎ　ｓｉｔｕで血管新生因子を産生させてよい。血管新生因子を産生する細胞としては特に限定されず、例えばヒト肺線維芽細胞、グリア芽腫等の腫瘍細胞等が挙げられる。

　血管新生因子を産生する細胞をマイクロ流体デバイス１に導入する方法として、マイクロ流体デバイス１の第一の流路４又は第二の流路８に導入してもよく、第一の流路４に血管内皮細胞を導入する場合もあるため、血管新生因子を産生する細胞は第二の流路８に導入するのが好適である。血管新生因子の濃度は、導入する血管新生因子を産生する細胞の数又は濃度で調節できる。血管新生因子を産生する細胞がヒト肺線維芽細胞である場合、第一の流路４又は第二の流路８におけるヒト肺線維芽細胞の濃度は、１×１０^３～１×１０^８細胞／ｍＬ、又は１×１０⁵～１×１０^７細胞／ｍＬであってよい。

　血管新生因子を含む流体は、緩衝液等の水溶液であってもよく、又は、細胞を培養するための培地であってもよい。流体は、血管新生因子以外に、他の血管新生を促進する成分を含んでもよい。培地としては、血管内皮細胞、又は他の血管新生因子を産生する細胞を培養できる液体培地であればよく、例えばＥＧＭ－２（Ｌｏｎｚａ社）等が挙げられる。

　本発明に係る培養方法において、血管床を形成する工程が、第一の流路４に血管内皮細胞を導入することをさらに含んでもよい。添加方法は第一の流体供給部９を介して、血管内皮細胞の懸濁液を添加すればよく、また、血管内皮細胞が第一の流路４の血管床保持チャンバー２側の側壁に接合させたほうが好ましい。接合方法は、例えば、血管内皮細胞の懸濁液を添加したのち、デバイスを９０°傾けた状態にして血管床保持チャンバー２側の側壁を下にして細胞の自然沈降によって接合させることが挙げられる。血管内皮細胞を添加しなくても、血管床保持チャンバー２で血管床が構築されるが、第一の流路４に血管内皮細胞が添加されることで、血管床保持チャンバー２内外の血管内皮細胞と繋がる傾向にあり、血管床保持チャンバー２内で形成された血管内皮細胞の管腔が、第一の流路４側への開口しやすくなる。それによって、第一の流路４へ液体を供給することで血管床の灌流ができるようになる。添加される血管内皮細胞は血管床保持チャンバー２内に添加される血管内皮細胞と同種のものであることが好ましい。

　第一の流路４に血管新生因子を含む流体を供給し、血管床保持チャンバー２に血管内皮細胞を含む培地を供給したのち、培地交換しながら、培養するのが好適である。培養条件は一般的な細胞培養条件であればよく、特に限定されない。培地や流体の量がごく微量のため、乾かないように環境湿度を調節したほうがよい。

　培養開始２～４日後に、第一の流路４に血管内皮細胞をさらに導入するのが好適である。第一の流路４に導入される血管内皮細胞は、第一の流路４から血管床保持チャンバー２に向かって内腔を有する血管網を形成できるため、第一の流路４の連通する血管床を構築できる。

　培養開始６～７日後、血管床保持チャンバー２内に血管床が形成される。本発明に係る培養方法によって形成される血管床は、直径３０～８０μｍ、場合によって５０μｍ程度の内腔を有する血管網が均一に広がる血管床である。

　本発明に係る培養方法において、血管床が形成されたのち、隔壁５を除去し、形成された血管床の上に立体組織を設置し、培養する工程が含まれる。

　立体組織（３次元組織）は、１種又は２種以上の細胞からなる立体構造を有する組織又は組織様細胞凝集体である。本発明の培養方法によって培養可能な立体組織は、特に限定されず、任意の細胞からなる立体組織であってよい。例えば、生体から分離した立体組織又は人工的に構築した立体組織であってもよい。生体から分離した立体組織は任意の動物から分離した任意の立体組織であってよく、また、正常な組織であってもよく、腫瘍組織などの異常な組織であってもよい。人工的に構築した立体組織としては、例えば腫瘍環境を模したスフェロイド、ＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞等の幹細胞から誘導分化したオルガノイド等が挙げられる。立体組織は、その内部に血管又は血管網を有してもよく、有さなくてもよい。

　立体組織の内部に血管又は血管網を有する場合、立体組織を血管床の上に設置してから凡そ２～７日間で、血管床中の血管と立体組織内の血管とが連通（融合）し、血管床から立体組織へ養分又は薬剤を供与できるようになる。一方、立体組織の内部に血管又は血管網を有さない場合、立体組織を血管床の上に設置してから凡そ２～７日間で、血管床から血管が立体組織へ血管が延び、立体組織内に血管網が形成され、血管床から立体組織へ養分又は薬剤を供与できるようになる。これにより、立体組織をより長期間培養することができる。

　本発明に係る培養方法にしたがって血管床上において培養した立体組織は、流路及びそれにつながった血管床を通して立体組織の内部への経血管的な養分又は薬剤の投与も可能であるため、デバイス上で立体組織を培養しながら、創薬研究、発生若しくは再生医療研究等に利用され得る。

　本発明に係る培養方法において、得られた立体組織を単離する工程をさらに含んでもよい。単離された立体組織は、立体組織を用いたｉｎ　ｖｉｖｏの実験や、生体移植等の用途に利用され得る。

　オープントップのマイクロ流体デバイスを用いた培養方法は、図１８及び１９に記載のプロセスにしたがって行ってもよい。なお、図１８及び１９中の（１ａ）～（５ａ）は、図５中の破線の矩形枠内部分の模式図であり、図１８中の（１ｂ）～（４ｂ）は図１６の断面図の模式図である。図１８及び１９は、分かりやすく説明するために、マイクロ流体デバイス１の構造を正確に表していない場合がある。

　図１８の（１ａ）及び（１ｂ）は、使用される前のデバイスを示す。（１ａ）の血管床保持チャンバー２の中の破線の円形の部分は、開口部６の第一の部分６１の径に対応する。（２ａ）及び（２ｂ）は、血管床保持チャンバー２に血管内皮細胞を含む培地を導入し、一対の第一の流路４に流体を導入し、血管新生因子の代わりに、一対の第二の流路８に線維芽細胞を導入することを示す。血管内皮細胞を含む培地がゲル培地である場合、短時間で固まるため、ゲル培地が固まったのち、隔壁５をピンセット等で物理的に除去し、開口部６の第二の部分６２にも流体を導入する。第二の部分６２に導入される流体は第一の流路４に導入される流体、すなわち、血管床を形成するための細胞が血管床を形成するために必要な血管新生因子等の成分を含む流体、と同じものであってもよい。図１８の（３ａ）及び（３ｂ）は、さらに、一対の第一の流路４に血管内皮細胞を導入し、血管床が形成されていることを示す。図１９の（４ａ）及び（４ｂ）は、血管床がさらに延びて第一の流路４と連通することを示す。（５ａ）及び（５ｂ）は、開口部６の第二の部分６２より立体組織を血管床の上に載せ、立体組織を培養することを示す。なお、細胞、培地、立体組織などは上述のとおりである。

　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１　マイクロ流体デバイスの作製＞
　図１に示すマイクロ流体デバイスの一例を作製した。まず、図５に示した第一の基板１００、図６に示される隔壁５、及び図７に示される第二の基板２００をそれぞれ作製した。

　隔壁５として、アルギン酸塩膜をＪ．Ｌｉら（J. Li, J. He, Y. Huang, D. Li and X. Chen, Carbohydr. Polym., 2015, 123, 208-216）に開示の方法に準じて、カルシウムイオンと架橋反応させることにより作製した。まず、滅菌水にアルギン酸ナトリウムを２％の濃度になるように溶解させ、アルギン酸塩溶液を作製した。直径３５ｍｍの培養皿にアルギン酸塩溶液を３ｍＬ入れた後、３５℃で一晩乾燥させ、アルギン酸塩膜を得た。そのアルギン酸塩膜を塩化カルシウム溶液に１時間浸した。塩化カルシウム溶液は、３０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む脱イオン水に、１００ｍＭになるよう塩化カルシウムを溶かすことにより準備した。その後、架橋反応させたアルギン酸塩膜を脱イオン水で洗浄した。アルギン酸塩膜を２枚のガラス板に挟み、クリップでさらに挟んだ後、３５℃で乾燥させた。得られたアルギン酸膜の厚さは約４０μｍであった。最後に、第二の基板に貼るため、４．５ｍｍ×５ｍｍの長方形を切り出し、隔壁５とした。

　第一の基板１００は、図８に示される手順でソフトリソグラフィーによって作製した。支持部材１１１として、厚さ１００μｍのシリコンウェハを用いた。支持部材１１１の上に、フォトリソグラフィによってＳＵ－８　３０５０（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、米国）をパターン１１２にパターン化した。支持部材１１１を後で取り除きやすくするため、トリクロロ－（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。さらに該パターン化したＳＵ－８　３０５０からなるパターン１１２及び支持部材１１１の上に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）プレポリマー（ＰＤＭＳ主剤：硬化剤＝１０：１（重量比））（東レ・ダウコーニング株式会社、日本）を５００ｒｐｍ、１５秒でスピンコートし、続いて真空チャンバー内で３０分間脱気した。その後、静置し、７０℃で２時間ＰＤＭＳプレポリマーを硬化させ、硬化物１１３を得た（図８の（ａ））。

　硬化物１１３を、ＳＵ－８　３０５０からなるパターン１１２及び支持部材１１１から剥がし、２４ｍｍ×２４ｍｍ×０．５ｍｍの第一の基板１００を得た。第一の基板１００をひっくり返して、支持体１１４としての２４ｍｍ×２４ｍｍのスライドガラス（松波硝子工業、日本）上に載せた（図８の（ｂ））。

　作製された支持体１１４によって支持される第一の基板１００は、図５に示されるように、凹部１０２、第一の壁部３、第一の溝部１０４、第二の壁部７、及び第二の溝部１０８を備えるものであった。第一の壁部３及び第二の壁部７はそれぞれ、長さが４．１ｍｍであり、第一のスリット２１又は第二のスリット２２を２０個等間隔に備えておいる。第一の溝部１０４及び第二の溝部１０８は、長さが６．１ｍｍであり、径が１ｍｍであった。凹部１０２、第一の溝部１０４及び第二の溝部１０８の深さは１００μｍであった。

　第二の基板２００は、図９に示される手順で作製した。隔壁５の型３０２とし、２枚の４．５ｍｍ×５～６ｍｍのセロファンテープ（総厚さ１００μｍ）を用いた。２枚のセロファンテープをプラスチックの容器３０１の中央に取り付けたのち、プレポリマー３０３としてのＰＤＭＳプレポリマーを、容器３０１に注いだ後、真空チャンバー内で１時間脱気し、８０℃で２時間硬化させた（図９の（ａ））。硬化物を容器３０１から剥がし、図６に示される、貫通孔２０６、二対の第一の流体供給貫通孔２０９、二対の第二の流体供給貫通孔２１０、及び一対の血管内皮細胞供給貫通孔２１１をそれぞれ生検パンチ（Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｄｅｒｍａｌ　Ｂｉｏｐｓｙ　Ｐｕｎｃｈ、貝印株式会社、日本）で穿孔し、第二の基板２００の一例であるポリマー基板３０４を得た（図９の（ｂ））。ポリマー基板３０４における貫通孔２０６、第一の流体供給貫通孔２０９、第二の流体供給貫通孔２１０、及び血管内皮細胞供給貫通孔２１１は、それぞれ３．５ｍｍ、６ｍｍ、２ｍｍ、及び２ｍｍの直径を有する。

　続いて、ポリマー基板３０４における隔壁５のための空隙にグルー３０５としてのＰＤＭＳプレポリマーを塗り、その上、上記の方法で作製された膜状隔壁３０６をグルー３０５の上に載せて、７０℃、３０分硬化することで、ポリマー基板３０４と隔壁５とを接着させた。

　さらに、第一の基板１００とポリマー基板３０４とが接するそれぞれの面を大気プラズマ（５０ｓｃｃｍ、２７０Ｐａ、４０Ｗ、Ｆｅｍｔｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｕｔｅ）で４０秒プラズマ処理しによってプラズマ加工し、両者を密に接合して、マイクロ流体デバイス１を作製した。

＜実施例２　血管床の構築及び立体組織の培養＞
（細胞培養）
　緑色蛍光タンパク質を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ）、Ａｎｇｉｏ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ、米国）、及び、赤色蛍光タンパク質を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＲＦＰ－ＨＵＶＥＣ、Ａｎｇｉｏ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ）を、内皮細胞増殖培地－２（ＥＧＭ－２、Ｌｏｎｚａ、スイス）で培養し、４～６継代の細胞を実験に使用した。使用したＥＧＭ－２には、ＥＧＭ－２のサプリメントの１つであるゲンタマイシンの代わりに、１％ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を含んだ。ヒト肺線維芽細胞（ｈＬＦ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｕｎｇ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｌｏｎｚａ）を線維芽細胞増殖培地－２（ＦＧＭ－２、Ｌｏｎｚａ）で培養し、継代４～５細胞を実験に使用した。共培養スフェロイドを調製するために、ｈＬＦとＨＵＶＥＣを２００μＬのＥＧＭ－２に４：１（２．０×１０^４細胞：５．０×１０^３細胞）の割合で混合した。スフェロイドは、マイクロ流体デバイスに導入する前に、Ｕ字底の９６ウェルプレート（住友ベークライト、日本）で１日間培養した。

（細胞の導入）
　実施例１で作製したマイクロ流体デバイス１を用いて、立体組織を培養した。まず、上記デバイスをＵＶで滅菌した。フィブリノーゲン粉末（Ｓｉｇｍａ）を２．８ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶かした。コラーゲンＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をｐＨが７となるよう中和し、３．０ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳに溶かした。さらに、１０７．２μＬの上記フィブリノーゲン溶液と、８．０μＬの上記コラーゲンＩ溶液と、３．６μＬのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）（５Ｕ／ｍＬ）とを混合し、ゲル溶液を作製した。

　上記培養したＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ及びｈＬＦをトリプシンで剥離し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で中和し、トリプシンの作用を止め、遠心分離用チューブに回収し、２２０×ｇで３分間遠心した。ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ及びｈＬＦをそれぞれ８×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ及び５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、ゲル溶液に懸濁した。得られた細胞懸濁液を９９μＬ分注し、５０Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を１μＬ入れた。得られた細胞懸濁液に含まれるフィブリノーゲン、コラーゲンＩ、アプロチニン及びトロンビンの濃度はそれぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．１５Ｕ／ｍＬ及び０．５Ｕ／ｍＬとなった。

　図１０に示されるように、３０μＬのＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を血管内皮細胞供給部１１を介して、血管床保持チャンバー２に導入した。２０μＬのｈＬＦ懸濁液を第二の流体供給部１０を介して、一対の第二の流路８にそれぞれ導入した。１５分間、ＣＯ_２インキュベータでインキュベートした。続いて、開口部６及び一対の第二の流路８にＥＧＭ－２培地を導入した。乾燥を防ぐため，濡れたキムワイプ（登録商標）を入れた１００ｍｍディッシュにマイクロ流体デバイス１を入れ、ＣＯ_２インキュベータで培養した。

　培養２日目、ＥＧＭ－２培地に５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁したＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を用意し、第一の流体供給部９を介して、片方の第一の流路４に２０μＬ導入した。９０°傾けた状態で３０分インキュベートし、それによってゲル面にＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを接着させた。もう片方の第一の流路４にも、同様にＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を２０μＬ導入し、ＨＵＶＥＣをゲル面に接着させた。続いて、２日間ごと培地交換し、培養した。培養４日目から血管床保持チャンバー２に形成されつつある血管網（血管床）とゲル面に接着させた血管内皮細胞が接合する様子が観察された。

（スフェロイドの導入）
　培養７日目に、開口部６に５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を２０μＬ入れ、３分間室温でインキュベートし、隔壁５のアルギン酸塩膜を溶かした。ＤＰＢＳで３回洗浄して過剰のＥＤＴＡを除去したのち、すべての供給部（第一の流体供給部９、第二の流体供給部１０、血管内皮細胞供給部１１）から培地を吸い取り、２．５×１０^４個のＲＦＰ－ＨＵＶＥＣと１×１０^５個のｈＬＦで構築したスフェロイドを血管床保持チャンバー２に導入した。ＣＯ_２インキュベータで３７℃、３０分間インキュベートし、スフェロイドをゲルに接着させた。新鮮なＥＧＭ－２培地をすべての供給部から供給し、血管床保持チャンバー２、第一の流路４、及び第二の流路８を満たした。２日ごとに培地交換し、構築した血管床の上においてスフェロイドを培養した。

＜実施例３　血管床の灌流性の可視化＞
　実施例２で形成された血管床の灌流性を調べるために、血管床が完全に形成された培養７日目、隔壁５を取り除く前に、デバイスのすべて供給部からＥＧＭ－２培地を除去した後、蛍光色素である、１０μＭのローダミン－デキストラン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－ｄｅｘｔｒａｎ、７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）のＤＰＢＳ溶液を一対の第一の流路４の片方のみに導入した。そして蛍光色素溶液は、一対の第一の流路４の間液面差によって、血管床の血管内腔に灌流された。蛍光色素溶液が血管内腔を流れる様子を観察した。イメージング電荷結合素子カメラ（ＤＰ７４）を備えた倒立顕微鏡（ＣＫＸ５３、Ｏｌｙｍｐｕｓ）及び４倍対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、蛍光画像を撮影した。

　結果を図１２に示した。図１２の（a）は、血管内皮細胞自体の蛍光（ＧＦＰ）を観察した蛍光画像であり、（ｂ）は血管内腔における灌流された蛍光色素（ローダミン－デキストラン）を観察した蛍光画像である。図１２から、内腔を有する血管網が形成されており、また該血管網の血管壁から溶液が漏出していないことが確認された。

＜実施例４　立体組織の分析＞
　スフェロイドの導入４日後、イメージング電荷結合素子カメラ（ＤＰ７４）を備えた倒立顕微鏡（ＣＫＸ５３、Ｏｌｙｍｐｕｓ）及び４倍対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、タイムラプス明視野及び蛍光画像を撮影した。断面画像は、２０倍及び４０倍レンズと、波長４８８及び５６１のスペクトルレーザーを備えた共焦点顕微鏡（ＦＶ３０００、オリンパス）を介して取得した。得られた画像をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州メリーランド州）で分析した。

　結果を図１３に示した。図１３から、スフェロイドの内部まで血管網が延びており、また、最初に作製した血管床とスフェロイド内部の血管網とが連通していることが確認された。

＜実施例５　血管床の構築における隔壁の作用の検討＞
　実施例１で作製したデバイス（隔壁有りデバイス）、及び、アルギン酸塩膜の隔壁がない以外隔壁有りデバイスと同じである隔壁無しデバイスを用いて、隔壁の有無による影響を調べた。

　血管床構築実験の前に、隔壁無しデバイスの血管床保持チャンバー２をチップで塞いだ。具体的に、図１４に示すように、１ｍＬのピペットチップに適量のＰＤＭＳを入れて固め、さらにチップの先端を切ったものを、隔壁無しデバイスの開口部６に入れ、血管床保持チャンバー２を塞いだ。その後、隔壁有りデバイスと隔壁無しデバイスを用いて、実施例２と同様な手順で血管床の構築を試みた。実施例２と同様にＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液及びｈＬＦ懸濁液を準備し、ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液５０μＬを血管床保持チャンバー２に導入し、ｈＬＦ懸濁液２０μＬを一対の第二の流路８にそれぞれ導入した後、隔壁無しデバイスからチップを外した。その後、１５分間、ＣＯ_２インキュベータで培養した。さらに、一対の第二の流路にＥＧＭ－２培地を導入した。培養２日目、実施例２と同様の手順で、一対の第一の流路４の側壁にそれぞれＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを接着させ、さらに２日間ごと培地交換し、培養した。培養４日目から血管床保持チャンバー２に形成された血管網（血管床）を観察した。

　隔壁有りデバイスの結果を図１５の（ａ）に、隔壁無しデバイスの結果を図１５の（ｂ）に示す。隔壁が存在する場合と比較し、隔壁が存在しない場合では血管床保持チャンバー２で十分な血管網の構築を観察することができなかった。隔壁がないと、細胞懸濁液の多くが天井のない血管床保持チャンバー２の中央部に流入した。その結果、血管床保持チャンバー２の中央部の細胞数が多くなり、培地の供給が不足してしまい、血管網が上手く構築できなかったと考えられる。

＜実施例６　オープントップのマイクロ流体デバイスの一例の作製＞
　図１６に示す断面を有するオープントップのマイクロ流体デバイスの一例を作製した。まず、図１７に示した前中層基板４０１及び前上層基板４０２、並びに隔壁５をそれぞれ作製した。

　隔壁５として、直径０．４μｍの小孔を有するＰＥＴ製膜（ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ、米国）を生検パンチで直径６ｍｍの円形状になるよう切り抜くことで作製した。なお、隔壁５を取り除く際、ゲル培地が隔壁５に接着するのを防止するために、予めＭＰＣポリマーで隔壁５をコーティングした。具体的には、実験前日に、ＭＰＣポリマー（日油株式会社、日本）を０．５％の濃度になるようエタノールで溶解した。その溶液に隔壁５を５分間浸し、蒸留水で洗浄した。

　前中層基板４０１は、図１７の（ａ）、（ｂ）に示される手順で作製した。支持部材１１１として、シリコンウェハを用いた。支持部材１１１の上に、フォトリソグラフィによってＳＵ－８　２１００（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ、米国）を厚さ２５０μｍになるよう、第二のパターン１２２にパターン化した。支持部材１１１を後で取り除きやすくするため、トリクロロ－（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シラン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。さらに該パターン化したＳＵ－８　３０５０からなる第二のパターン１２２及び支持部材１１１の上に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）プレポリマー（プレポリマー１２３）（ＰＤＭＳ主剤：硬化剤＝１０：１（重量比））（東レ・ダウコーニング株式会社、日本）を流し、真空チャンバー内で３０分間脱気した。５００ｒｐｍ、５０秒でスピンコートし、７０℃で２時間ＰＤＭＳプレポリマーを硬化させ、前中層基板４０１を得た（図１７の（ｂ））。

　作製された前中層基板４０１は、図１７に示されるように、第一の壁部３及び第二の壁部７を備え、また、血管床保持チャンバー２、第一の流路４及び第二の流路８のそれぞれを形成するための、チャンバー凹部４０８、第一の流路溝部４０６及び第二の流路溝部４０７を備えるものであった。第一の壁部３及び第二の壁部７はそれぞれ、長さが４．１ｍｍであり、第一のスリット２１又は第二のスリット２２を２０個等間隔に備えておいる。第一の流路溝部４０６及び第二の流路溝部４０７は、長さが６．１ｍｍであり、径が１ｍｍであったチャンバー凹部４０８、第一の流路溝部４０６及び第二の流路溝部４０７の深さは１００μｍであった。

　前上層基板４０２は、以下の手順で作製した。まず、ＰＤＭＳプレポリマーを、プラスチックの容器（３ｃｍ×３ｃｍ）に注いだ後、真空チャンバー内で１時間脱気し、７０℃で２時間硬化させた。厚み３～５ｍｍの硬化物を容器から剥がし、生検パンチで穿孔し、開口部６の第二の部分６２に対応する貫通孔を作製し、前上層基板４０２を得た。第二の部分６２は、８ｍｍの直径を有した。

　続いて、前中層基板４０１と前上層基板４０２とを接合した。前中層基板４０１と前上層基板４０２とが接するそれぞれの面を大気プラズマ（５０ｓｃｃｍ、２７０Ｐａ、４０Ｗ、Ｆｅｍｔｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｕｔｅ）で４０秒プラズマ処理しによってプラズマ加工し、両者を密に接合して一体化した。

　さらに、接合されて一体化された前上層基板４０２及び前中層基板４０１を支持部材１１１及び第二のパターン１２２からは外し、開口部６の第一の部分６１、二対の第一の流体供給部９、二対の第二の流体供給部１０、及び一対の血管内皮細胞供給部１１のそれぞれに対応する貫通孔を生検パンチで穿孔することによって作製した（図１）。その結果、開口部６の第一の部分６１、第一の流体供給部９、第二の流体供給部１０、及び血管内皮細胞供給部１１のそれぞれの直径が１ｍｍ、６ｍｍ、２ｍｍ、及び２ｍｍの直径を有した。さらに、接合されて一体化された上層基板４０４及び中層基板４０３と下層基板４０５（ガラス基板）とが接するそれぞれの面を大気プラズマ（５０ｓｃｃｍ、２７０Ｐａ、４０Ｗ、Ｆｅｍｔｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｕｔｅ）で４０秒プラズマ処理しによってプラズマ加工し、両者を密に接合した。さらに、上記作製した隔壁５を中層基板４０３における開口部６の第一の部分６１の上端を接するように設置し、開口部６を塞ぎ、オープントップのマイクロ流体デバイス１を作製した。

＜実施例７　オープントップのマイクロ流体デバイスを用いた培養方法＞
　実施例２と同様に、緑色蛍光タンパク質を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ）、Ａｎｇｉｏ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ、米国）を、内皮細胞増殖培地－２（ＥＧＭ－２、Ｌｏｎｚａ、スイス）で培養し、４～６継代の細胞を実験に使用した。ヒト肺線維芽細胞（ｈＬＦ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｕｎｇ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｌｏｎｚａ）を線維芽細胞増殖培地－２（ＦＧＭ－２、Ｌｏｎｚａ）で培養し、継代４～５細胞を実験に使用した。

　実施例６で作製したマイクロ流体デバイス１を用いて、血管網（血管床）を形成させた。図１８及び１９に示されるように、３０μＬのＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液を血管内皮細胞供給部１１を介して、血管床保持チャンバー２に導入した。２０μＬのｈＬＦ懸濁液を第二の流体供給部１０を介して、一対の第二の流路８にそれぞれ導入した。１５分間、ＣＯ_２インキュベータでインキュベートした。続いて、隔壁５をピンセットにより取り除いた後、開口部６の第二の部分６２及び一対の第二の流路８にＥＧＭ－２培地を導入した。乾燥を防ぐため、濡れたキムワイプ（登録商標）を入れた１００ｍｍディッシュにマイクロ流体デバイス１を入れ、ＣＯ_２インキュベータで培養した。なお、ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ懸濁液、ｈＬＦ懸濁液及びＥＧＭ－２培地は、実施例２で使用したものと同じであった。

　培養７日目にすべての供給部（第一の流体供給部９、第二の流体供給部１０、血管内皮細胞供給部１１）から培地を吸い取り、開口部６の第二の部分６２から、腎臓オルガノイドを血管床保持チャンバー２の上部に導入した。腎臓オルガノイドはMurdoch Children's Research Institute (Royal Children's Hospital, Flemington Road, Parkville Victoria 3052 Australia；ABN 21 006 566 972；以下、「ＭＣＲＩ」とする。)より入手したｉＰＳ細胞を用い、M. Takasatoら（M. Takasato, P. X. Er, H. S. Chiu, B. Maier, G. J. Baillie, C. Ferguson, R. G. Parton, E. J. Wolvetang, M. S. Roost, S. M. C. De Sousa Lopes and M. H. Little, Nature, 2015, 526, 564-568）の開示した方法で作製し、分化誘導開始後１３日目のものを使用した。なお、ＭＣＲＩより入手したｉＰＳ細胞株は、ｉＰＳＣ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｌｉｎｅｓ　ＣＲＬ　１５０２．３であり、当該ＣＲＬ　１５０２．３は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手された材料（ＡＴＣＣ　Ｍａｔｅｒｉａｌ）に由来する。具体的には、当該ｉＰＳ細胞株は、ＣＲＬ１５０２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５０２^ＴＭ）、ＣＲＬ２４２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４２９^ＴＭ）およびＰＣＳ－２０１－０１０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－２０１－０１０^ＴＭ）に由来する。ＣＯ_２インキュベータで３７℃、３０分間インキュベートし、腎臓オルガノイドをゲルに接着させた。腎臓オルガノイド培養に用いられるＡＰＥＬ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）とＥＧＭ－２を１：１で混合した培地を二対の第一の流体供給貫通孔２０９から供給し、第一の流路４、及び第二の流路８を満たした。２日ごとに培地交換し、構築した血管床の上において腎臓オルガノイドを培養した。

　上記形成された血管床が管腔を有するかを調べるために、血管床が完全に形成された培養７日目に、血管床保持チャンバー２における、開口部６の第一の部分６１に対応する内側及び外側、すなわち、図１８の（１ａ）の血管床保持チャンバー２の中の破線の円形の部分の内側と外側を観察した。イメージング電荷結合素子カメラ（ＤＰ８０）を備えた共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ３０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）及び１０倍若しくは４０倍対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、蛍光画像を撮影した。

　結果を図２０に示した。図２０の（ａ）は１０倍の対物レンズにより撮影した蛍光画像であり、白色破線は開口部６の第一の部分６１に対応する位置を示す。（ｂ）、（ｃ）は共に４０倍の対物レンズにより撮影した蛍光画像であり、（ｂ）は開口部６の第一の部分６１に対応する位置の内側、（ｃ）はその外側を観察したものである。第一の部分６１に対応する位置の外側と内側の両方が管腔構造を有していることが確認され、血管床保持チャンバー２全体に管腔を有する血管床が構築されたことが示唆された。

　腎臓オルガノイド導入後の結果を図２１に示した。図２１の（ａ）は４倍の対物レンズにより血管床保持チャンバー２内の血管床を撮影した蛍光画像である。（ｂ）は４倍の対物レンズにより開口部６の第二の部分６２に存在する腎臓オルガノイドを撮影した明視野画像である。腎臓オルガノイド導入後、血管床及び腎臓オルガノイドの形状が維持されていることが確認され、オープントップのマイクロ流体デバイスを用いた共培養が可能であることが確認された。

１…デバイス本体、２…血管床保持チャンバー、３…第一の壁部、４…第一の流路、５…隔壁、６…開口部、７…第二の壁部、８…第二の流路、９…第一の流体供給部、１０…第二の流体供給部、１１…血管内皮細胞供給部、２１…第一のスリット、２２…第二のスリット、６１…第一の部分、６２…第二の部分、１００…第一の基板、１０２…凹部、１０４…第一の溝部、１０８…第二の溝部、１１１…支持部材、１１２…パターン、１１３…硬化物、１１４…支持体、１２２…第二のパターン、１２３…プレポリマー、２００…第二の基板、２０６…貫通孔、２０９…第一の流体供給貫通孔、２１０…第二の流体供給貫通孔、２１１…血管内皮細胞供給貫通孔、３０１…容器、３０２…型、３０３…プレポリマー、３０４…ポリマー基板、３０５…グルー、３０６…膜状隔壁、４０１…前中層基板、４０２…前上層基板、４０３…中層基板、４０４…上層基板、４０５…下層基板、４０６…第一の流路溝部、４０７…第二の流路溝部、４０８…チャンバー凹部。

Claims

　マイクロ流体デバイスであって、
　デバイス本体と、
　前記デバイス本体に設けられた第一の流路と、
　前記デバイス本体における前記第一の流路に隣接し、第一の壁部を介して設けられた血管床保持チャンバーと、
　前記デバイス本体に設けられ、前記血管床保持チャンバーと連通する開口部と、
　前記開口部を塞ぐように設けられた隔壁とを備え、
　前記第一の壁部には、複数の第一のスリットが形成されており、
　前記隔壁は、除去可能である、マイクロ流体デバイス。
　前記第一の流路が一対設けられ、
　一対の前記第一の流路のそれぞれが、前記血管床保持チャンバーに前記第一の壁部を介して隣接している、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記隔壁が、前記血管床保持チャンバーと前記開口部との間に設けられる、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記隔壁が化学的方法又は物理的方法によって除去可能な隔壁である、請求項１～３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記隔壁が水溶性材料から形成される膜状隔壁である、請求項１～４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記第一の壁部における第一のスリットは、スリット幅が５０μｍ～２００μｍとなるように等間隔に形成されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記第一の流路に連通する第一の流体供給部をさらに備える、請求項１～６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記デバイス本体に設けられた第二の流路をさらに備え、
　前記第二の流路は、前記第一の流路に第二の壁部を介して隣接し、
　前記第二の壁部には、複数の第二のスリットが形成されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記第一の流路が一対設けられ、一対の前記第一の流路のそれぞれが、前記血管床保持チャンバーに前記第一の壁部を介して隣接しており、
　前記第二の流路が一対設けられ、一対の前記第二の流路のそれぞれが、一対の前記第一の流路のそれぞれに、前記第二の壁部を介して隣接している、請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記第二の壁部における第二のスリットは、スリット幅が５０μｍ～２００μｍとなるように等間隔に形成されている、請求項８又は９に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記第二の流路に連通する第二の流体供給部をさらに備える、請求項８～１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　前記隔壁が、前記開口部の高さ方向における一端と他端の間に設けられる、請求項１、２、４～１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
　請求項１～１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスの製造方法であって、
　第一の溝部と、前記第一の溝部に隣接し、第一の壁部を介して設けられた凹部とを備える第一の基板と、貫通孔を備える第二の基板と、除去可能な隔壁とを用意する工程と、
　前記第二の基板の、前記第一の基板と接する面に、前記貫通孔を塞ぐように前記隔壁を設置することで、前記貫通孔を前記開口部として形成する工程と、
　前記隔壁を介して、前記第二の基板の、前記第一の基板と接する面に、前記開口部が前記凹部の少なくとも一部に対応する位置に設置されるように、前記第一の基板を設置することで、前記凹部を前記血管床保持チャンバーとして形成する工程と
を含む、製造方法。
　前記第一の基板を設置する工程において、前記第一の基板と前記第二の基板とが接するそれぞれの面がプラズマ加工されており、前記第一の基板が前記第二の基板と接合するように設置される、請求項１３に記載の製造方法。
　請求項１～１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用いて、立体組織を培養するための方法であって、
　前記第一の流路に血管新生因子を含む流体を供給し、前記血管床保持チャンバーに血管内皮細胞を含む培地を供給し、前記血管床保持チャンバーに血管床を形成させる工程と、
　前記隔壁を除去し、前記形成された血管床の上に立体組織を設置し、培養する工程と
を含む、培養方法。
　前記マイクロ流体デバイスが請求項８～１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスであり、前記第一の流路への血管新生因子の供給は、前記第二の流路に線維芽細胞を含む培地を供給することによって行う、請求項１５に記載の培養方法。
　前記血管床を形成する工程が、前記第一の流路に血管内皮細胞を導入することをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の培養方法。
　培養して得られた立体組織を単離する工程をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の培養方法。