WO2018079866A1 - 세포를 공동배양하기 위한 미세유체칩 - Google Patents
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
- C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
Definitions
- the present invention relates to a microfluidics chip that can co-culture various types of cells.
- the present invention relates to a microfluidic chip capable of co-culture of cells and cell spheres or tissues in vitro .
- the conventional in vitro three-dimensional cell culture technology or cell culture platform 1) can not be removed once the cells are injected, 2) the large cell sphere (cell sphere) can not be injected into the microfluidic chip, 3 Commercially available culture equipment such as Transwell®, and 4) limited fluid inflow pathways.
- a cell culture environment similar to that in vivo means a dynamic environment in which cells, cell spheres or tissues can interact, and the surrounding environment changes over time.
- in vivo tissues are in close interaction with various types of cells, and these cells provide a dynamic environment in which tissues exist at some time and disappear at other times. Therefore, co-culture of cells, tissues or organs in vivo with cells is also very important in studying their function.
- a cell culture platform that can provide a diverse and dynamic environment while culturing cells and co-culture with other cell populations, tissues or organs.
- the restriction and prohibition of animal testing which is spreading around Europe, has prompted the development of such in vitro cell culture systems.
- Korean Patent Registration No. 10-14011990 describes an in vitro angiogenesis apparatus
- Korean Patent Registration No. 10-1287690 describes a cell damage modeling apparatus using a microfluidic device and cell damage using the same. Describe the modeling method.
- these microfluidic chips according to the related art only allow coculture of cells in a single cell unit in one chip, and use the same to have a tissue structure close to in vivo and have a millimeter (mm). It was not possible to co-culture cell colonies, tissues, or organs with unit sizes with cells.
- microfluidic chips capable of co-culturing various types of cells as well as co-culturing cells and cell cells, cells, tissues, or organs.
- the microfluidic chip having the same structure as the present invention completely overcomes the limitations and problems of the prior art, thereby completing the present invention.
- the present invention is the development of new cosmetics evaluation technology through skin vascular system simulation microchip evaluation system of the Ministry of Health and Welfare, Ministry of Health and Welfare, Korea (project number: HN14C0090) and the original technology development project of the Ministry of Science, ICT and Future Planning. Completed with support from Platform Development (Task No .: 2016917321).
- the present invention has been made to overcome the limitations and problems of the prior art, and an object of the present invention is to provide a microfluidic chip that can co-culture various types of cells in vitro .
- Another object of the present invention is to provide a microfluidic chip that can provide a variety of cell culture environment while culturing cells in vitro .
- Another object of the present invention is to provide a microfluidic chip capable of co-culturing cells and cell colonies, cell cells (cell populations), tissues or organs in vitro .
- Another object of the present invention to provide a method for analyzing the biologically active protein in vitro using the microfluidic chip of the present invention.
- Another object of the present invention is to provide bioassay materials in and out of tissues and to identify changes during culturing cell cells or tissues, thereby screening or evaluating the activity of bioactive or new drug candidates in vitro . To provide a way.
- the present invention provides a microfluidic chip having an open microfluidic channel.
- a microfluidic chip composed of an upper substrate 100 and a lower substrate 200, wherein the lower substrate is divided by an adjacent channel and a micropost 101, and the mutual fluid moves. And one or more channels 110, 120, 1210, 220, and 350 connected to each other, and the upper substrate 100 includes one or more sinks 400, wherein one or more microspores 300 are formed.
- the microfluidic chip 500 having an open microchannel may be provided on the bottom surface of the sink 400, and the upper substrate and the lower substrate are connected to each other to allow fluid to move through the micropores. to provide.
- the height and width of the microfluidic channel are not particularly limited and may be fluidly determined according to the type of material injected into the channel or the purpose and condition of the experiment.
- the height of the microfluidic channel is 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 30 ⁇ m to 80 ⁇ m, and even more preferably 40 ⁇ m to 60 ⁇ m.
- the sink may be manufactured in various sizes and shapes, and the bottom surface of the sink may be provided with micro holes or completely open, and the micro holes may have various sizes according to the purpose. Can be.
- the sink may be manufactured in the form of a straight channel.
- a commercially available transwell 410 may be inserted and used in the sink of the microfluidic chip.
- the microfluidic chip according to the present invention can co-culture cells and cells, or cells and small tissues or cell spheres through a sink formed to allow the microfluidic channel and the fluid to move with each other.
- various media can be supplied to cells or tissues being cultured in the microchannels through the micropores of the sinks, thereby providing a dynamic environment during cell culture.
- FIG. 1 a, b and C show the structure of an open microfluidic chip according to the present invention.
- FIG. 2 shows the completion of a dense vascular network in the presence of micropores in a 5 mm wide channel (left), and shows that cells survive but are not connected in a microfluidic channel without micropores (right). ).
- Figure 3 shows the manufacturing process of the open microfluidic chip of the present invention.
- Figure 4 shows the results of processing the material outside the vessel through the opening of the microfluidic channel in the open microfluidic chip of the present invention.
- Figure 5 shows an example of implementing the microfluidic chip channel structure of the present invention and the microfluidic channel structure of the prior art on one microfluidic chip.
- Figure 6 schematically shows a method for culturing perfusion blood vessels and cell spheres in the open microfluidic chip of the present invention.
- Figure 7 shows the results of co-culture of blood vessels and cancer cell spheres (left), and the appearance of cancer cell cells wrapped outside the blood vessels (right).
- Figure 8 shows the application of a commercial transwell to the microfluidic chip of the present invention.
- FIG. 9 is a view of a mold tube generating chip according to the prior art.
- Figure 10 shows an example of the microfluidic chip of the present invention.
- 110 a first medium channel
- 120 second discharge channel
- 200 lower substrate; 210: first culture channel; 220: second culture channel
- 300 micropores; 310: intravascular; 320: extravascular; 350: third culture channel
- microfluidic chip of the present invention may be manufactured in various sizes and shapes.
- the microfluidic chip of the present invention can be manufactured by various methods known in the art. For example, a two-layer structure of an upper substrate and a lower substrate is manufactured through a process of fabricating a microporous membrane based on plasma bonding.
- a two-layer structure of an upper substrate and a lower substrate is manufactured through a process of fabricating a microporous membrane based on plasma bonding.
- 1 the pre-mold patterned in the reverse phase of the channel (bonded to the glass), 2 filled the empty space of the mold and glass with Teflon (manufactured by DuPont) and dried to coat the surface , 3 Then fill the empty space with PDMS (Polydimethylsiloxane) again, remove bubbles and harden, 4 remove the pre-mold from the glass, 5 prepare the post-mold with sinks formed.
- PDMS Polydimethylsiloxane
- the microfluidic chip of the present invention can be produced.
- the sink 400 provided on the bottom surface of the upper substrate 100 may be generally 5 to 10 mm in diameter, and may be manufactured in various shapes and sizes as necessary.
- a plurality of micro holes 300 may be provided on the bottom surface of the upper substrate 100 of the microfluidic chip 500 of the present invention, through the upper substrate and the lower The substrates are connected to each other to move the fluid to provide an open environment in the microchannel provided in the lower substrate 200.
- the size of the micropores 300 may vary depending on the purpose, and in general, may be manufactured to have a diameter of 100 ⁇ 500 ⁇ m. Considering that the size of the cell sphere is about 300 ⁇ m, when the micropores 300 are manufactured to the size of 500 ⁇ m, the direct contact between the cell types and the cell spheres in the microfluidic channel of the lower substrate 200 is performed. And interactions can be observed. In general, considering that the height of the microfluidic channel is manufactured to about 100 ⁇ m, it can be said to be innovative in that it can handle cell globules that have not been previously cultured in the microfluidic channel.
- the lower substrate 200 of the microfluidic chip 500 of the present invention may have two or more microfluidic channels, for example, a first culture channel 210 and a second culture channel (ie, to culture various types of cells). 220), the first medium channel 110 and the second medium channel 120, and the third culture channel 350, the number of the microfluidic channel can be varied as necessary.
- the microfluidic channels are arranged in parallel with a plurality of microposts arranged in a row and separated from adjacent channels. Since the microfluidic chip is made of a hydrophobic material, cells in the microfluidic channel are patterned in the channel without being dispersed between the micropillars 101. Accordingly, the microfluidic channels are connected to each other so that the fluids can move through the gaps between the micropillars, so that the cells co-cultured in the microfluidic channels are physically separated, but may interact in a chemical diffusion environment. Can be.
- a commercially available transwell (Transwell®, Corning Corporation) 410 may be used for the microfluidic chip 500 of the present invention.
- an outer diameter of 8 mm and an inner diameter of 6.5 mm may be inserted into and used in the sink 400 of the microfluidic chip of the present invention. Since the transwell is a commercially available co-cell culture device, using it in the microfluidic chip of the present invention may provide convenience for the user.
- the sink 400 of the microfluidic chip 500 of the present invention, into which the transwell 410 is inserted may adjust its size in a post-mold step. Can be.
- the microfluidic chip 500 of the present invention can perform loop culturing by dipping in and out of the microfluidic device as well as conventional well-plates using various types of loops. You can use loops prepared in advance for your organization and organization.
- a hydrogel widely used in three-dimensional cell culture all types of cells that can be cultured on a hydrogel can be used.
- microfluidic chip 500 of the present invention can be applied to various microfluidic devices such as an organ-on-a chip or a lab-on-a-chip.
- the present invention is a method for co-culture of two or more cells, cell spheres or tissues in vitro , using the microfluidic chip 500 of the present invention, the microfluidic chip lower substrate Cultivating one or more cells or perfusion vessels in the microfluidic channel of (200), culturing cells or cell spheres on the microfluidic chip upper substrate 100, through the micropores 101 of the upper substrate
- a method of co-culturing two or more cells, cells, or tissues in vitro such that the cells or cell spheres of the upper substrate can interact with cells or perfusion vessels in the microfluidic channel of the lower substrate.
- perfusion vessels may be cultured in the microfluidic channel
- cancer cell spheres may be cultured on the upper substrate.
- the types and characteristics of extracellular matrix, angiogenic cells, cell culture medium, and co-cultured cells that can be used in generating blood vessels are as follows.
- the extracellular matrix used for cell culture is, for example, collagen gel, fibrin gel, matrigel, self-assembled peptide gel ), At least one of polyethylene glycol gel and alginate gel, and fibrin gel was used in this embodiment.
- the extracellular matrix is a drug compound, a soluble factor, and an insoluble factor for the purpose of quantitatively measuring the effects and efficacy of angiogenesis and function, or for screening new drugs that promote or inhibit angiogenesis.
- At least one of a factor, a biomolecule, a protein, a nanomaterial, and an siRNA may be mixed and used.
- the angiogenic cells are for example endothelial cells, endothelial cells, epithelial cells, cancer cells, stem cells, stem cells, stem cell derived cells. at least one of a derived cell and an endothelial progenitor cell. It may also be a genetically-mutated cell and / or a transfected cell of the cells.
- human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used.
- angiogenic cell refers to a cell that forms blood vessels by interacting with angiogenic factors, angiogenesis-inducing substances contained in cell culture fluid, co-cultured cells, and the like.
- the angiogenic cells may form blood vessels through vasculogenesis or angiogenesis.
- angiogenic cells include human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), human microvascular endothelial cells, human brain microvascular endothelial cells, human lymphatic vessels.
- Vascular endothelial cells isolated from various body parts such as endothelial cells (human lymphatic endothelial cells) can be used, and cancer cells can be used to study the mechanism of cancer growth and metastasis.
- the cultured cells may be vascular endothelial cells derived from various species, such as porcine endothelial cells, mouse endothelial cells, bovine endothelial cells, etc. It can be selected according to the purpose of the experiment. As such, the type of angiogenic cells may be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of the experiment.
- the cell culture solution may be any cell culture solution known in the art, and in one embodiment of the present invention, EGM-2 medium (LONZA) was used.
- EGM-2 medium LONZA
- the extracellular matrix is a drug compound, a soluble factor, and an insoluble factor for the purpose of quantitatively measuring the effects and efficacy of angiogenesis and function, or for screening new drugs that promote or inhibit angiogenesis.
- At least one of a factor, a biomolecule, a protein, a nanomaterial, and an siRNA may be mixed and used.
- the co-cultured cells may be cells that secrete biochemicals required for angiogenesis, such as angiogenesis-inducing substances through interaction with the angiogenic cells, for example, astrocytes , Glial cells, mesothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells, cancer cells, cancer cells, pericyte, neuroglial cells, stem cells (stem cell), stem cell derived cells (stem-cell derived cells) and cells that interact with the vascular endothelium may be at least one.
- biochemicals required for angiogenesis such as angiogenesis-inducing substances through interaction with the angiogenic cells
- astrocytes e.g., astrocytes , Glial cells, mesothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells, cancer cells, cancer cells, pericyte, neuroglial cells, stem cells (stem cell), stem cell derived cells (stem-cell derived cells) and cells that interact with the vascular endothelium may be at least one
- the co-culture cells are preferably astrocytes, glial cells, percutaneous cells or fibroblasts, and when the blood vessels to be produced are blood vessels other than cerebrovascular vessels, the fibroblasts or smooth muscle cells are preferred.
- cancer cells may be used as co-culture cells to study the relationship between cancer and angiogenesis.
- the type and combination of cells to be cultured, and the culture method may be selected according to the purpose of the experiment.
- human lung fibroblasts Human Lung Fibroblast
- the addition of the angiogenic factor, cell culture fluid and co-culture cells is to provide an environment suitable for growth, proliferation and morphogenesis of the angiogenic cells, the type and composition of which is appropriate for those skilled in the art. Can be selected.
- the present invention provides a method for screening a bioactive substance or a new drug candidate in vitro by providing an analyte in and outside the tissue and confirming the change while culturing the cell or tissue. The activity of can be evaluated.
- parallel includes not only intersecting channels between each other on a plane, but also maintaining a similar distance as well as maintaining a uniform distance.
- Human Umbilical Vein Endothelial Cells are cultured in endothelial cell growth medium (EGM-2, Lonza).
- Primary human lung fibroblasts (Lonza) are cultured in fibroblast growth medium (FGM-2; Lonza).
- the medium used to culture cancer cells (U87MG, ATCC HTB-14, and MDA-MA-231, ATCC HTB-14) is DMEM (Hyclone) containing (10% FBS, penicillin and streptomycin (100 U / ml).
- Human Epidermal Keratinocytes (neonatal, HEKn, Cascade Biologics) are cultured in Epilife medium (cascade biologics) supplemented with human keratinocyte growth supplement (HKGS).
- Promocell are incubated in EGM-2 (Lonza) All cells are incubated in a humidified incubator at 37 ° C., 5% CO 2 .
- Cancer cells (U87MG) were cultured and collected, adjusted to the culture medium at 0.15 mil / ml, and cultured for 3 days by dropping 20 ⁇ l each by cultivation. Artificial skin tissue is cultured after collecting and collecting keratinocytes and injecting 200,000 cells into the transwell. After two days, air exposure and exchange with a differentiation medium containing 1.5 mM calcium were carried out every two days with new medium and incubated for two weeks.
- the master mold was prepared by casting a photoresist on a silicon wafer.
- a 150 um thick mold was prepared using standard photolithography protocol (Non Patent Document 18: Xia, Y. et al. 1998) for SU-100 (Microchem, US) photoresist.
- PDMS Density Polymethacrylate
- PDMS and washed coverslips were combined by plasma treatment (Femto Science, KR). For hydrophobic formation, the combined apparatus was maintained for at least 48 hours in an 80 ° C. dry oven.
- LFs (7 ⁇ 10 6 cells / ml) are mixed with a fibrinogen solution (2.5 mg / ml fibrinogen, 0.15 U / ml aprotinin and 0.5 U / ml thrombin) with the hydrogel, and the first culture channel 210 and the second Each culture channel 220 was injected.
- Fibrinogen solution 2.5 mg / ml fibrinogen, 0.15 U / ml aprotinin and 0.5 U / ml thrombin
- HUVECs (6 x 10 6 cells / ml in most experiments and 3 or 9 x 10 6 cells / ml in some experiments).
- EGM-2 medium was placed in the medium channel.
- the device was incubated for 7-8 days to form lumenized microvascular with fully lumen with open ends for each media channel.
- U87MG and MDA-MA-231 cells were recovered from tissue culture dishes.
- U87MG cells treated with fibrinogen solution were injected into the first culture channel and the second culture channel was filled with fibrinogen solution.
- MDA-MB-231 cells (1 ⁇ 10 6 cells / ml) are injected with the medium into the first culture channel and tilted for 40 minutes to attach to the fibrin wall between the third culture channel (angiogenesis channel). I was.
- EBM-2 Longza, medium without additional growth factor supplementation
- EGM-2 medium were charged to the media channel.
- DIC microvascular Differential Interference Contrast Microscope
- a Nikon AE31 microscope was used.
- the stained samples were imaged using confocal microscopy (Olympus FV1000).
- Confocal images were analyzed using IMARIS software (Bitplane, Switzland).
- fluorescence imaging FITC-dextran injected samples were imaged using an IX81 reversed phase microscope (Olympus).
- the microfluidic chip of the present invention was produced by injection molding. Referring to FIG. 3, a pre-mold having a pattern of reverse phases of? Channels bonded to glass. 2 The empty space between the mold and the glass was filled with Teflon (manufactured by DuPont) and dried to coat the surface. 3 Then fill the empty space with PDMS (Polydimethylsiloxane) again to remove bubbles and harden. 4 The pre-mold was removed from the glass. Since the bonded area is narrow compared to the total area, it could be easily removed. (5) Prepare the reservoir perforated post-mold and bond with the pre-mold.
- the post-part of the pre-molded part became a micropore and the part of the pre-mold became a micropillar to obtain a channel to be initially drawn.
- the required reservoir hole was drilled. 7 Bonded with glass again and stored in a dry oven to produce a hydrophobic surface was used in the experiment.
- 1 is an example of the microfluidic chip of the present invention prepared as described above. As shown in Figure 1, the microfluidic chip of the present invention is a two-layer structure of the upper substrate 100 and the lower substrate 200 is bonded.
- the lower substrate 200 of the microfluidic chip of the present invention includes a first culture channel 210 in which cell type 1 is cultured, a second culture channel 220 in which cell type 2 is cultured, and one side of the first culture channel. And a first medium channel 110 and a second medium channel 120 connected in parallel with each other by one side of the second culture channel and connected in parallel with each other to move the fluid, and one side of the first medium channel, and One side of the second medium channel and the third culture channel 350 is separated by a micropillar and connected in parallel to each other to move the fluid.
- the micro-fluidic channel provided on the lower substrate that is, the sink 400 provided with at least one of the first culture channel, the second culture channel, the third culture channel, the first medium channel and the second medium channel is provided on the upper substrate and the It has a microfluidic channel structure opened by one or more micropores 300 provided in the sink bottom surface.
- FIG. 5 is another example of the microfluidic chip manufactured according to the present invention, and includes both the microfluidic channel structure according to the prior art and the microfluidic channel structure of the present invention in one microfluidic chip.
- the left side shows a microfluidic channel structure for angiogenesis according to the prior art (Korean Patent No. 10-1401199), and the center of FIG. 5 includes a sink 400 on an upper substrate as the microfluidic channel structure of the present invention.
- the sink bottom surface is a method of finening one.
- fibroblasts are formed in the first culture channel 210 and the second culture channel 220 of the microfluidic chip 500 of the present invention prepared according to the preparation example for vascularization.
- the vascular endothelial cells were injected into three culture channels 350 and mixed in a hydrogel.
- EGM-2 Endothelial cell growth medium-2
- it has a storage hole 300 in the incubator. Fluid communication with the first medium channel and the second medium channel and the third culture channel of the lower substrate through the micropores 300 (fluidic communication) is connected, the movement of cells is impossible but mass exchange is possible. It was made.
- the upper substrate 100 includes the sink 400 in the microfluidic channel structure of the present invention, but the sink has a fully open structure without the microhole 300.
- the middle or right structure of Figure 5 for example, to form a perfusion blood vessel network in the third culture channel of the lower substrate 200 and the small tissue or cells using the sink 400 of the upper substrate 100 Spheres can be cocultured.
- the microfluidic chip of the present invention can perform various experiments at the same time by manufacturing microfluidic channels and sinks having various structures in one chip.
- the injection molding method as in the present example is suitable for mass production of microfluidic chips.
- perfusion blood vessels in the microfluidic channel according to the method disclosed in the prior art (Korean Patent No. 10-1401199, pp. 7 to 13). Were generated and co-cultured with cancer cells.
- the generation of blood vessels performed a process of vasculogenesis or angiogenesis.
- Angiogenesis is a process in which growth material secreted from fibrous cells affects blood vessel cells as a whole and is connected to each other.
- Angiogenesis is a method based on the neovascularization process, giving a gradient of growth material to produce blood vessel cells. Growth material concentration was extended in the high direction to form a vascular network.
- a cell drop was placed on the micropores 300 in the microfluidic chip of the present invention by hanging drop, thereby completing a platform for coculturing perfusion vessels and cell cells.
- fibroblast NHLF Normal
- fibroblast NHLF Normal in any one of the first culture channel 210 or the second culture channel 220 of the microfluidic chip 500 of the present invention prepared according to the preparation example
- the hydrogel mixed with human lung fibroblast was filled, and only the hydrogel was filled in the third culture channel 350.
- the vascular endothelial cells were flowed into the medium inlet 150 and the microfluidic chip was tilted at 90 ° for about 30 minutes to allow the vascular endothelial cells to settle on the hydrogel wall.
- a cell culture platform was placed on the micropores 300 in the microfluidic chip by hanging drop to complete a platform for co-culture of perfusion vessels and cells.
- Example 2 Medium supply during cell culture through the sink of the upper substrate
- the microfluidic chip 500 manufactured in the preparation example and the microfluidic chip 600 for blood vessel formation according to the prior art were used.
- the cell culture solution EGM-2 Endothelial cell growth medium-2
- FIG. 2 shows the result of forming the vascular network using the microfluidic chip according to the present invention
- the right shows the result of forming the vascular network according to the prior art.
- Figure 2 due to the limitation of the medium supply in the conventional microfluidic chip 600, it was not possible to find the generation of perfusion blood vessel network having a length of 1 mm or more.
- the microfluidic chip 500 of the present invention a perfusion blood vessel network having a length of 5 mm was generated. This shows that the microfluidic chip having a single layer culture environment as in the prior art has a slow diffusion of the medium as the width of the culture channel increases, so that cells do not grow well in the middle of the microfluidic channel.
- the microfluidic chip of the open structure of the present invention was able to smoothly supply the medium to the middle portion of the wide channel through the micropores provided in the sink of the upper substrate.
- a perfusion blood vessel network was formed and the material was treated outside the vessel through an open sink.
- a perfusion vascular network was generated according to the method described in the prior art as in the above embodiment.
- a red reagent Rhodamin-dextran, Sigma Aldrich
- FITC green reagent
- the green reagent supplied through the open microfluidic channel was delivered only to the outside of the blood vessel, and as shown in the right side of FIG. 4, the inside and the outside of the blood vessel were stained red and green, respectively.
- the lower graph in FIG. 5 (the graph is small. Please ask the larger graph) is a measurement of the brightness of the two reagents between the vessel walls formed in the microfluidic chip of the present invention (Confocal microscope, Olympus FV1000), This phenomenon was maintained for more than 30 minutes.
- the microfluidic chip of the present invention was fabricated according to the method described in Preparation Example, but the sink of the upper substrate had micropores having a size of 200 ⁇ m.
- the perfusion vasculature was formed on the microfluidic chip in the same manner as described in the Examples and the prior art.
- the cancer cell cells (U87MG, ACTCC) were then cultured as described above and placed in the micropores of the microfluidic chip upper substrate by hanging drop. At this time, the cancer cell was confirmed to have a 400 ⁇ m. After 7 days of co-culture, the results were confirmed and shown in FIG. 7.
- the left picture is a co-culture of cancer cells having a size of 400 ⁇ m on the upper substrate with a 200 ⁇ m micropore array.
- Vascular cells form a network on the lower substrate of the microfluidic channel, and cancer cell spheres are connected to each other in fluid communication with the vascular network of the lower substrate through micropores in the sink of the upper substrate of the microfluidic chip.
- 7 is a fluorescence photograph showing that cancer cells penetrated from the lower substrate are present outside the blood vessel.
- the microfluidic chip 500 was manufactured, and a commercially available transwell (Corning Corporation, product standard) 410 was inserted into the sink of the upper substrate and used in this example.
- Commercially available transwells are devices used for co-culture and are mainly used in multi well plates.
- perfusion blood vessel networks were generated in the microfluidic channels of the lower substrate of the microfluidic chip of the present invention according to the above-described embodiments and the methods described in the prior art.
- the epidermal tissue cultured in a transwell layer and cultured in a transwell through the artificial skin tissues or human epidermal Keratinocytes, neonatal, HEKn, Cascade Biologics were inserted into the sink of the microfluidic chip, The perfusion blood vessel network was allowed to move with each other.
- 5 mi / ml of LF suspension was mixed 3: 1 with fibrin gel (10 mg / ml) and loaded into a first culture channel and a second culture channel.
- Fibrin gel (10 mg / ml) was mixed 3: 1 with 5 mi / ml HUVEC suspension and loaded into a third culture channel.
- EGM-2 medium was put in the medium channel of the lower substrate, and the medium was also put in the sink or (date) channel of the upper substrate.
- the medium on the upper substrate was aspirated the next day.
- Keratinocytes KC, Gibco
- the medium was incubated with Epilife (Gibco).
- Epilife (Gibco) of the upper substrate was removed, cultured with replacing only the EGM on the lower substrate for 6 weeks, and analyzed by confocal microscopy.
- Figure 8 shows the results, the lower photo shows the epidermal layer cultured and vascularized in the transwell.
- the vascular network is formed by vasculogenesis on the lower substrate, and the pericyte (PC) is cultured in 2D immediately above the perivascular cells to sink the micropores (200 ⁇ m in diameter).
- PC pericyte
- 5 ml / L of LF (Lung fibroblast, Lonza, P6) suspension was mixed 3: 1 with fibrin gel (Lonza) (10 mg / ml) and loaded into the first culture channel and the second culture channel of the lower substrate.
- HUVEC (Lonza, P4) suspension was mixed 3: 5 with 5 mi / mml fibrin gel (10 mg / ml) and loaded into a third culture channel.
- EGM-2 medium (Lonza) was put in the medium channel of the lower substrate, and the medium was also provided to the sink or (date) channel of the upper substrate. The next day the media in the sink or (date) channel ends (3 mm size reservoir) of the upper plate was aspirated. 30 ⁇ l of 0.1 mi / ml PC suspension was added to a 3 mm sized reservoir on one side of the channel, allowing cells to enter the channel. After 30 minutes the PC was attached to the PDMS hole membrane bottom and the channel was filled with EGM-2 medium.
- Vascularized skin has not been known to date. However, many diseases and tissue reactions involve interactions with blood vessels, as well as skin. In the field of cosmetics where animal testing is prohibited and in the development of new drugs where animal testing is excessively used, the culture method of vascularized artificial skin is essential. By using the vascularized artificial skin made by the technology of the present invention, we can expect the experimental results not seen in the artificial skin, which had only the epidermal layer and the dermal layer, and can expect the effects of skin and blood vessels to interact with each other. .
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Abstract
본 발명에 따른 미세유체칩은 미세유체채널과 상호 유체가 이동할 수 있도록 형성된 싱크를 통해, 세포와 세포, 또는 세포와 소조직 또는 세포구를 공동배양 할 수 있다. 또한, 싱크의 미세구멍을 통해 미세채널에서 배양 중인 세포 또는 조직에 다양한 배지를 공급할 수 있으므로, 세포 배양 중에 다이나믹 한 환경을 제공할 수 있다. 또한, 특정 시간차이를 두고 필요한 세포를 적용할 수 있고, 필요 시 세포를 제거할 수 있다.
Description
본 발명은 다양한 종류의 세포를 공동배양 할 수 있는 미세유체칩 (microfluidics chip)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포와 세포구 또는 조직을 in vitro에서 공동으로 배양할 수 있는 미세유체칩에 관한 것이다.
종래 플레이트 또는 디쉬 (dish)를 이용한 in vitro 세포배양방법은, 세포가 성장하는 동안 생체 내 환경과 유사한 환경을 제공할 수 없는 한계가 있다. 생체 내 환경과 보다 더 유사한 세포배양 환경을 제공하기 위한 다양한 연구가 수행되었으며, 그 결과로서 미세유체칩을 이용하는 3차원 세포배양기술이 보고되었다. 미세유체기술에 기반하고 미세유체칩 또는 기관-칩 (Organ-on-a chip)을 이용하는 3차원 세포배양기술은, in vitro 세포배양 환경을 어느 정도 생체 내와 유사하게 조절할 수 있도록 하였고, 이를 통해 세포의 배양뿐만 아니라 생체 조직과 기관을 생체 외에서 모방할 수 있는 가능성을 제공하였다. 그러나, 종래 in vitro 3차원 세포배양기술 또는 세포배양 플랫폼은, 1) 세포를 한번 주입하면 제거할 수 없고, 2) 크기가 큰 세포구 (cell sphere)를 미세유체칩 내로 주입할 수 없으며, 3) 트랜스웰 (Transwellⓡ) 과 같은 상용화된 배양 기구를 이용할 수 없고, 4) 유체유입 경로가 제한적이라는 문제를 가지고 있다.
한편, 생체 내와 유사한 세포배양 환경이란, 세포와 세포구 또는 조직이 상호작용할 수 있고, 주변 환경이 시간의 경과에 따라 변화하는 동적 환경을 의미한다. 즉, 생체 내 조직은 여러 종류의 세포와 긴밀한 상호작용을 하고 있으며, 조직 주변에서 이들 세포는 어느 시점에서는 존재하다가도 다른 시점에서는 없어져 존재하지 않는 등 역동적인 환경을 조직에 제공한다. 따라서, 생체 내 세포군집, 조직 또는 기관을 세포와 공동배양 하는 것은, 이들의 기능을 연구하는데 있어서도 매우 중요하다. 이에, 세포를 배양하는 동안 다양하고 역동적인 환경을 제공할 수 있고, 다른 세포군집, 조직 또는 기관과 공동배양 할 수 있는 세포배양 플랫폼에 대한 필요성은 점차 높아가고 있는 실정이다. 특히, 유럽을 중심으로 확산되고 있는 동물실험 제한 및 금지는 이와 같은 in vitro 세포배양 시스템에 대한 개발을 재촉하고 있다.
in vitro 세포배양 시스템과 관려하여, 한국특허등록 제 10-14011990호는 생체외 혈관생성장치를 기술하고, 한국특허등록 제 10-1287690호는 미세유체 소자를 이용한 세포손상 모델링 장치 및 이를 이용한 세포손상 모델링 방법을 기술한다. 그러나, 이들 종래기술에 따른 미세유체칩은, 하나의 칩에서 단일세포 단위의 세포를 공동배양 하는 것을 가능하게 할 뿐, 이를 이용하여 생체 내 (in
vivo)와 가까운 조직구조를 가지며 밀리미터 (mm) 단위의 크기를 갖는 세포콜로니 (cell colony), 조직 (tissue), 또는 기관 (organ)을 세포와 공동으로 배양하는 것은 불가능하였다.
이에, 본 발명자들은 다양한 종류의 세포를 공동배양하는 것은 물론 세포와 세포구, 세포와 조직 또는 기관을 공동으로 배양할 수 있는 미세유체칩을 개발하고자 부단히 노력하였다. 그 결과, 본 발명과 같은 구조를 지닌 미세유체칩이 상기 종래기술의 한계 및 문제점을 완전히 극복한 것을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 대한민국 보건복지부 글로벌코스메틱연구개발사업단의 피부 혈관계 모사 마이크로칩 평가 시스템을 통한 신규화장품 평가기술개발 (과제고유번호: HN14C0090) 및 미래창조과학부 원천기술개발사업 다각적 자극/분석이 가능한 혈액뇌장벽 플랫폼 개발 (과제고유번호: 2016917321)의 지원으로 완성되었다.
이와 같이, 본 발명은 상기 종래기술의 한계 및 문제점을 극복하기 위해 안출된 것으로서, 다양한 종류의 세포를 in vitro에서 공동배양 할 수 있는 미세유체칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 in vitro에서 세포를 배양하는 동안 다양한 세포배양 환경을 제공할 수 있는 미세유체칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포와 세포 콜로니, 세포구 (세포군집), 조직 또는 기관을 in vitro에서 공동으로 배양할 수 있는 미세유체칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 미세유체칩을 이용하여 in vitro에서 생리활성분질을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포구 또는 조직을 배양하는 동안 분석대상 물질을 조직 내부 및 외부에서 제공하고 그 변화를 확인하므로써, in vitro에서 생리활성물질 또는 신약후보물질을 스크리닝하거나 이들의 활성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 개방된 미세유체채널을 지닌 미세유체칩을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상부기판 (100) 및 하부기판 (200)으로 구성된 미세유체칩으로서, 상기 하부기판은 인접하는 채널과 미세기둥 (micropost) (101)에 의해 구분되고 상호 유체가 이동할 수 있도록 연결된 하나 이상의 채널 (110, 120, 1210, 220, 350)을 포함하며, 상기 상부기판 (100)은 하나 이상의 싱크 (400)를 포함하여, 하나 이상의 미세구멍 (microspore) (300)이 상기 싱크 (sink) (400)의 바닥면에 구비될 수 있으며, 상기 미세구멍을 통해 상기 상부기판과 상기 하부기판이 상호 유체가 이동할 수 있도록 연결된, 개방된 미세채널을 갖는 미세유체칩 (500)을 제공한다.
본 발명의 미세유체칩에서, 미세유체채널의 높이와 폭은 특별히 제한되지 않고, 채널에 주입되는 물질의 종류나 실험의 목적 및 조건에 따라 유동적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 미세유체채널의 높이는 10 ㎛ 내지 100 ㎛이고, 바람직하게는 30 ㎛ 내지 80 ㎛이며, 보다 더 바람직하게는 40 ㎛ 내지 60 ㎛이다.
본 발명의 미세유체칩에서, 상기 싱크는 다양한 크기 및 형태로 제작될 수 있으며, 상기 싱크의 바닥면은 미세구멍이 구비되거나 완전 개방 될 수 있으며, 상기 미세구멍은 목적에 따라 다양한 크기를 갖도록 할 수 있다. 싱크는 일자형의 채널형태로 제작될 수도 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 시판 중인 트랜스웰 (410)이 상기 미세유체칩의 싱크에 삽입되어 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 미세유체칩은 미세유체채널과 상호 유체가 이동할 수 있도록 형성된 싱크를 통해, 세포와 세포, 또는 세포와 소조직 또는 세포구를 공동배양 할 수 있다. 또한, 싱크의 미세구멍을 통해 미세채널에서 배양 중인 세포 또는 조직에 다양한 배지를 공급할 수 있으므로, 세포 배양 중에 다이나믹 한 환경을 제공할 수 있다. 또한, 특정 시간차이를 두고 필요한 세포를 적용할 수 있고, 필요 시 세포를 제거할 수 있다.
도 1의 a, b 및 C는 본 발명에 따른 개방된 미세유체칩의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 5 mm 넓이를 가진 채널에서 미세구멍이 있을 때 촘촘한 혈관망이 완성된 것을 보여주고 (왼쪽), 미세구멍이 없는 미세유체채널에서는 세포가 생존하나 혈관망이 연결되지 않은 것을 보여준다 (오른쪽).
도 3은 본 발명의 개방된 미세유체칩의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 개방된 미세유체칩에서 미세유체채널의 개방을 통해 혈관 외부에서 물질을 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 미세유체칩채널 구조와 종래기술의 미세유체채널 구조를 하나의 미세유체칩 상에 구현한 일 예를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 개방된 미세유체칩에서 관류성 혈관과 세포구를 배양하는 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 혈관과 암세포구를 공동배양한 결과를 나타낸 것 (왼쪽)과, 암세포구가 혈관의 외부를 감싼 모습 (오른쪽)를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 미세유체칩에 시판중인 트랜스웰을 적용한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 종래기술에 따른 형관생성칩에 대한 도면이다.
도 10은 본 발명의 미세유체칩의 일 예를 나타낸 것이다.
부호의 설명
100: 상부기판; 101: 미세기둥
110: 제 1배지채널; 120: 제 2 배지채널
150, 160: 배지유입부; 170, 180: 배지배출부
200: 하부기판; 210: 제1 배양채널; 220: 제 2배양 배양채널
300: 미세구멍; 310: 혈관내부; 320: 혈관외부; 350: 제 3배양채널
400: 싱크; 410: 트렌스웰
500: 미세유체칩
600: 형관생성칩
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다. 또한, 본 발명의 미세유체칩이 다양한 크기 및 형태로 제작될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에게 자명할 것이다.
본 발명의 미세유체칩은 종래에 알려진 다양한 방법으로 제작될 수 있다. 예를 들어, 플라즈마 접합기반 미세구멍 맴브레인 제작과정을 통해 상부기판과 하부기판의 2층 구조로 제작된다. 도 3을 참조하면, ① 채널의 역상이 패턴 된 프리-몰드 (pre-mold)를 유리에 본딩하고, ② 몰드와 유리의 빈 공간을 테플론 (듀퐁사 제조)으로 채운 후 건조하여 표면을 코팅하며, ③ 다음 다시 빈 공간을 PDMS (Polydimethylsiloxane)로 채운 후 기포를 제거하고 굳히고, ④ 유리에서 프리-몰드 (pre-mold)를 제거 한 후, ⑤ 싱크가 형성된 포스트-몰드 (post-mold)를 준비하고 프리-몰드와 본딩 한 다음, ⑥ 프리-몰드를 조심스럽게 제거하여, 프리-몰드의 포스트였던 부분이 미세구멍이 되고 구멍이었던 부분이 미세기둥이 되도록 하고, ⑦ 다시 유리와 본딩하고 드라이오븐에 보관하여, 본 발명의 미세유체칩을 제작할 수 있다. 도 1을 참조하면 상부기판 (100)의 바닥면에 구비된 싱크 (400)는 일반적으로 지름 5 ~ 10 mm 일 수 있으며, 필요에 따라 다양한 형태와 크기로 제작될 수 있음은 물론이다. 또한, 도 1의 b 및 c를 참조하면, 복수개의 미세구멍 (300)이 본 발명의 미세유체칩 (500)의 상부기판 (100)의 바닥면에 구비될 수 있고, 이를 통해 상부기판과 하부기판이 상호 유체가 이동하도록 연결되어 하부기판 (200)에 구비된 미세채널에 개방된 환경을 제공한다. 상기 미세구멍 (300)의 크기는 목적에 따라 다양하게 할 수 있으며, 일반적으로, 100 ~ 500 μm의 지름을 갖도록 제작할 수 있다. 세포구체 (cell sphere)의 크기가 약 300 μm 인 것을 고려하면, 미세구멍 (300)이 500 μm의 크기로 제작되는 경우, 하부기판 (200)의 미세유체채널 중의 세포타입과 세포구체의 직접적인 접촉 및 상호작용을 관찰 할 수 있다. 이는 일반적으로 미세유체채널의 높이가 100 μm 내외로 제작되는 것을 고려할 때, 기존에 미세유체채널에서 배양하지 못했던 세포구체를 다룰 수 있다는 점에서 혁신적이라고 할 수 있다.
본 발명의 미세유체칩 (500)의 하부기판 (200)은 여러 가지 유형의 세포를 배양할 수 있도록 2개 이상의 미세유체채널, 예를 들어, 제 1 배양채널 (210) 및 제 2 배양채널 (220), 제 1 배지채널 (110) 및 제 2 배지채널 (120), 및 제 3 배양채널 (350)을 포함하며, 상기 미세유체채널의 개수는 필요에 따라 다양하게 할 수 있다. 상기 미세유체채널은 일렬로 정렬 된 복수개의 미세기둥 (101) (micropost)으로 병렬로 배치되고 인접하는 채널과 분리된다. 미세유체칩이 소수성 (hydrophobic) 소재로 제작되므로, 미세유체채널 중의 세포는 미세기둥 (101) 사이로 흩어지지 않고 채널 내에서 패터닝 된다. 이에 따라 각 미세유체채널은 미세기둥 사이의 간극을 통해 상호 유체가 이동할 수 있도록 연결되므로, 상기 미세유체채널 내에서 공동배양되는 세포들은 물리적으로는 분리되나, 화학확산 (chemical diffusion) 환경에서 상호작용할 수 있다.
도 8을 참조하면 시판 중인 트랜스웰 (Transwellⓡ, 코닝사) (410)을 본 발명의 미세유체칩 (500)에 이용할 수 있다. 예를 들어, 외경이 8 mm, 내경 6.5 mm인 것을 본 발명의 미세유체칩의 싱크 (400)에 삽입하여 이용할 수 있다. 트랜스웰은 상용화된 공동세포배양 장치이므로 이를 본 발명의 미세유체칩에 사용하는 것은 사용자에게 편의성을 제공할 수 있다. 도 3을 참조하면, 상기 트랜스웰 (410)이 삽입되는 본 발명의 미세유체칩 (500)의 싱크 (400)는, 제 5번째 단계인 포스트-몰드 (post-mold) 단계에서 그 크기를 조절할 수 있다.
본 발명의 미세유체칩 (500)은 다양한 형태의 루프를 이용하여 기존의 웰-플레이트 (well-plate) 뿐만 아니라 미세유체소자에 넣었다 꺼내는 (dipping in and out) 루프 배양을 수행할 수 있으며, 관심 조직 및 기관에 맞추어 사전에 준비된 루프를 이용할 할 수 있다. 본 발명에서 세포가 배양되는 기판의 표면은 3차원 세포배양에서 널리 사용되는 하이드로젤이 루프 내에 표면장력을 이용해 고형화 될 수 있으므로, 하이드로젤 상에서 배양될 수 있는 모든 형태의 세포가 사용될 수 있다.
본 발명의 미세유체칩 (500)은 기관-칩 (Organ-on-a chip) 또는 랩온어칩 (Lab-on-a-chip)과 같은 다양한 미세유체소자에의 응용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 예에서, 본 발명은 in vitro 에서 2종 이상의 세포, 세포구 또는 조직을 공동배양하는 방법으로서, 상기 본 발명의 미세유체칩 (500)을 사용하고, 상기 미세유체칩 하부기판 (200)의 미세유체채널 내에 1종이상의 세포 또는 관류성 혈관을 배양하며, 상기 미세유체칩 상부기판 (100)에 세포 또는 세포구를 배양하여, 상기 상부기판의 미세구멍 (101)을 통해 상기 상부기판의 세포 또는 세포구가 상기 하부기판의 미세유체채널 내의 세포 또는 관류성 혈관과 상호작용할 수 있도록 한, in vitro 에서 2종 이상의 세포, 세포구 또는 조직을 공동배양하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 미세유체채널 내에 관류성 혈관이 배양되고, 상기 상부기판에 암세포구가 배양될 수 있다.
본 발명에서 혈관을 생성함에 있어서 사용 가능한 세포외기질, 혈관형성세포, 세포배양액, 공동배양세포의 종류 및 특성은 다음과 같다.
본 발명의 일 예에서, 세포배양에 사용되는 세포외기질은, 예를 들어 콜라겐 젤 (collagen gel), 피브린젤 (fibrin gel), 마트리젤 (Matrigel), 자가조립 펩타이드 젤 (self-assembled peptide gel), 폴리에틸렌글리콜젤 (polyethylene glycol gel) 및 알지네이트 젤 (alginate gel) 중 적어도 하나일 수 있으며, 본 실시예에서는 피브린젤을 사용하였다. 상기 세포외기질은 혈관형성 및 기능의 효과와 효능을 정량 측정하거나 혈관신생을 촉진 또는 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적을 위해, 약물 (drug compound), 가용성인자 (soluble factor), 불용성인자 (insoluble factor), 생체분자 (biomolecule), 단백질 (protein), 나노소재 (nanomaterial) 및 siRNA 중 적어도 하나를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 예에서, 상기 혈관형성세포는 예를 들어 내피세포 ( endothelial cell), 외피세포 (epithelial cell), 암세포 (cancer cell), 줄기세포(stem cell), 줄기세포 유래세포(stem cell-derived cell) 및 혈관전구세포(endothelial progenitor cell) 중 적어도 하나일 수 있다. 또한 상기 세포들의 유전변이 된 세포 (mutated cell) 및/또는 형질감염 된 세포 (transfected cell) 일 수 있다. 본 발명이 실시예에서는 인간 제대정맥 혈관내피세포 (HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Lonza)를 사용하였다.
본 발명에서 “혈관형성세포”란 혈관형성인자, 세포배양액에 포함된 혈관형성유도물질, 공동배양세포 등과 상호작용에 의해 혈관을 형성하는 세포를 의미한다. 상기 혈관형성세포는 혈관형성 (vasculogenesis) 혹은 혈관신생 (angiogenesis)을 통해 혈관을 형성할 수 있다. 예를 들어 혈관형성세포로서 인간 제대정맥내피세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC), 인간 미세혈관 내피세포(human microvascular endothelial cell), 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (human brain microvascular endothelial cell), 인간 림프관 내피세포 (human lymphatic endothelial cell) 등 다양한 신체 부위에서 분리된 혈관내피세포가 사용될 수 있으며, 암의 성장과 전이 기전 등을 연구하기 위해 암세포가 사용될 수도 있다. 또한 배양 세포는 인간 외의 종 예를 들어, 돼지 내피세포 (porcine endothelial cell), 생쥐 내피세포 (murine endothelial cell), 소 내피세포 (bovine endothelial cell) 등의 다양한 종에서 유래된 혈관내피세포일 수 있으며 실험의 목적에 맞게 선택이 가능하다. 이처럼 혈관형성세포의 종류는 실험의 목적에 맞게 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에서, 상기 세포 배양액은 당업계에 공지된 어떤 세포배양액이라도 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 예에서는 EGM-2 배지 (LONZA)를 사용하였다. 상기 세포외기질은 혈관형성 및 기능의 효과와 효능을 정량 측정하거나 혈관신생을 촉진 혹은 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적을 위해, 약물 (drug compound), 가용성인자 (soluble factor), 불용성인자 (insoluble factor), 생체분자 (biomolecule), 단백질 (protein), 나노소재 (nanomaterial) 및 siRNA 중 적어도 하나를 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 예에서, 상기 공동배양세포는 혈관형성세포와의 상호작용을 통해 혈관형성유도물질 등 혈관형성에 필요한 생화학물질을 분비하는 세포일 수 있으며, 예를 들어 성상세포 (astrocyte), 아교세포 (glial cell), 중피세포 (mesothelial cell), 섬유아세포 (fibroblast), 평활근세포 (smooth muscle cell), 암세포 (cancer cell), 주피세포 (pericyte), 신경교세포 (neuroglial cell), 줄기세포 (stem cell), 줄기세포 유래세포 (stem-cell derived cell) 및 혈관 내피와 상호작용하는 세포 중 적어도 하나일 수 있다.
또한 상기 세포들의 유전변이된 세포 (mutated cell) 및/또는 형질감염된 세포 (transfected cell)일 수 있다. 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관인 경우 공동배양세포는 성상세포, 아교세포, 주피세포 또는 섬유아세포인 것이 바람직하고, 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관 이외의 혈관인 경우에는 섬유아세포 또는 평활근세포인 것이 바람직하다. 또한 암과 혈관신생과의 관련성 등을 연구하기 위하여 암세포를 공동배양세포로 사용할 수도 있다. 또한 배양되는 세포의 종류와 조합, 그리고 배양 방식은 실험의 목적에 맞게 선택될 수 있으며, 본 발명의 일예에서는 인간 폐섬유아세포 (Human Lung Fibroblast)를 HUVEC과 공동배양하였다. 상기 혈관형성인자, 세포배양액 및 공동배양세포의 추가는 혈관형성세포의 성장, 증식 및 형태형성에 적절한 환경을 제공하기 위한 것으로서 그 종류 및 조성은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 일 예에서, a) 상기 제 2 배양채널에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계; b) 상기 제1 배양채널에 1) 세포외기질 또는 2) 세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 3) 상기 제 1 배지채널 또는 제 2 배지채널에 혈관형성인자 (angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하여 혈관을 생성한다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 본 발명은 세포구 또는 조직을 배양하는 동안 분석대상 물질을 조직 내부 및 외부에서 제공하고 그 변화를 확인함으로써, in vitro에서 생리활성물질 또는 신약후보물질을 스크리닝 하거나 이들의 활성을 평가할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “병렬”은 평면상에서 채널 간에 서로 교차하지 않고 균일한 거리를 유지하는 것 뿐만아니라 유사한 거리를 유지하는 것을 포함한다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예 및 도면을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명은 본 명세서에 개시된 실시예와 도면에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
실험 재료
세포 배양 및 시약
인간 제대정맥 혈관내피세포 (HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Lonza)를 내피세포 성장배지 (EGM-2, Lonza)에서 배양한다. 인간 폐 섬유아세포 (Primary human lung fibroblasts, Lonza))를 섬유아세포 성장배지 (FGM-2; Lonza)에서 배양한다. 암세포 (U87MG, ATCC HTB-14, 및 MDA-MA-231, ATCC HTB-14) 배양에 사용한 배지는 (10% FBS, penicillin and streptomycin (100 U/ml)이 포함 된 DMEM (Hyclone) 이다. 인체각질형성세포 (Human Epidermal Keratinocytes, neonatal, HEKn, Cascade Biologics)를 HKGS (human keratinocyte growth supplement)를 첨가한 Epilife medium (cascade biologics)에서 배양한다. 혈관주위세포 (Human Pericyte from Plecenta, hPC-PL-c, Promocell) 는 EGM-2 (Lonza)에서 배양한다. 모든 세포는 37 ℃, 5% CO2 조건의 가습화 된 인큐베이터에서 배양한다.
암세포 (U87MG) 를 배양하고 채취한 후 0.15 mil/ml 로 배양배지에 농도를 맞춘 후 현적배양법으로 20 ㎕씩 drop을 만들어 3일간 배양하였다. 인공피부조직은 각질형성세포를 배양하고 채취한 후 트랜스웰에 20만개의 세포를 주입한 후 배양한다. 이틀 후 공기노출을 시키고 1.5 mM 칼슘이 첨가 된 분화배지로 교환하여 2틀에 한번씩 새로운 배지로 교환해주며 2주간 배양한다.
미세유체칩 제조
마스터 몰드는 실리콘 웨이퍼 상에 포토레지스트를 캐스팅하여 제조하였다. SU-100 (Microchem, US) 포토레지스트에 대한 표준 포토리소그래피 프로토콜 (비특허문헌 18: Xia, Y. et al. 1998)을 사용하여 150 um 두께의 몰드를 제조하였다. PDMS (Dow Corning, US)를 완성된 마스터 몰드에 붓고, 80℃ 드라이 오븐 내에서 경화시켰다. PDMS 및 세척된 커버슬립을 플라즈마 처리 (Femto Science, KR)로 결합시켰다. 소수성 형성을 위해, 결합된 장치를 80℃ 드라이 오븐 내에서 48시간 이상 유지하였다.
하이드로젤 및 세포 로딩
LFs (7 x 106 cells/ml)를 피브리노겐 용액 (2.5 mg/ml 피브리노겐, 0.15 U/ml 아프로티닌 및 0.5 U/ml 트롬빈)를 하이드로젤과 혼합하고, 제 1 배양채널 (210) 및 제 2 배양채널 (220) 각각 주입하였다. HUVECs (대부분의 실험에서 6 x 106 cells/ml, 일부 실험에서 3 또는 9 x 106 cells/ml 사용함)을 피브리노겐 용액 (2.5 mg/ml 피브리노겐, 0.15 U/ml 아프로티닌 및 0.5 U/ml 트롬빈)를 하이드로젤과 혼합하고 제 3 배양채널 (350)에 주입하였다. 피브린 중합화를 위해 2 분간 배양한 후, EGM-2 배지를 배지 채널에 넣었다. 장치는 7 ~ 8일간 배양하여 각각의 배지 채널에 대해 개방된 말단을 갖춘 완전히 내강을 갖는 루멘화 된 (lumenized) 미세혈관을 형성하였다. 혈관이 성숙된 후에, U87MG 및 MDA-MA-231 세포를 조직배양 디쉬로부터 회수하였다. 암 혈관신생을 위해, 피브리노겐 용액을 처리한 U87MG 세포는 제 1 배양채널에 주입하고, 제 2배양채널은 피브리노겐 용액으로 채웠다. 암세포 혈관내유입을 위해, MDA-MB-231 세포 (1x106 cells/ml)를 배지와 함께 제 1 배양채널로 주입하고, 40분간 기울여서 제 3 배양채널 (혈관형성채널) 사이의 피브린 벽에 부착시켰다. 암세포의 주화성 이동을 유발시키기 위해, EBM-2 (Lonza, 추가적인 성장 인자 보충이 없는 배지) 및 EGM-2 배지를 배지채널에 채웠다.
현미경
미세혈관 DIC (Differential Interference Contrast Microscope) 이미징을 위해, Nikon AE31 현미경을 사용하였다. 3D z-stack 및 횡단면의 이미징을 위해, 염색된 시료는 공초점 현미경 (Olympus FV1000)을 사용하여 이미징하였다. 공초점 이미지는 IMARIS 소프트웨어 (Bitplane, Switzland)를 사용하여 분석하였다. 형광 이미지를 위해, FITC-덱스트란 주입된 시료를 IX81 역상 현미경 (Olympus)를 사용하여 이미징 하였다.
제조예: 미세유체칩의 제작
본 발명의 미세유체칩을 인젝션 (injection) 몰딩 방법으로 제작하였다. 도 3을 참조하면, ① 채널의 역상이 패턴 된 프리-몰드 (pre-mold)를 유리에 본딩했다. ② 몰드와 유리의 빈 공간을 테플론 (듀퐁사 제조)으로 채운 후 건조하여 표면을 코팅하였다. ③ 다음 다시 빈 공간을 PDMS (Polydimethylsiloxane)로 채운 후 기포를 제거하고 굳혔다. ④ 유리에서 프리-몰드 (pre-mold)를 제거하였다. 전체 면적에 비해 본딩 된 면적이 좁기 때문에 쉽게 제거될 수 있었다. ⑤ 리저버 뚫린 포스트-몰드 (post-mold)를 준비하고 프리-몰드와 본딩하였다. ⑥ 프리-몰드를 조심스럽게 제거함으로써, 프리-몰드의 포스트였던 부분이 미세구멍이 되고 구멍이었던 부분이 미세기둥이 되어 초기 그리고자 하는 채널을 수득할 수 있었다. 필요한 리저버 구멍을 뚫었다. ⑦ 다시 유리와 본딩하고 드라이오븐에 보관하여 소수성인 표면을 제작한 후 실험에 사용하였다. 도 1은 상기 한 바와 같이 제조된 본 발명의 미세유체칩의 일예이다. 도 1에 도시된 것과 같이, 본 발명의 미세유체칩은 상부기판 (100) 및 하부기판 (200)의 2층 구조가 접합된다. 본 발명의 미세유체칩의 하부기판 (200)은 세포타입 1이 배양되는 제 1 배양채널 (210), 세포타입 2가 배양되는 제 2 배양채널 (220), 및 상기 제 1 배양채널의 일 측면 및 상기 제 2 배양채널 일 측면과 각각 미세기둥에 의해 분리되고 상호 유체가 이동하도록 병렬연결 된 제 1 배지채널 (110) 및 제 2 배지채널 (120), 및 상기 제 1 배지채널의 일 측면 및 상기 제 2 배지채널의 일 측면과 각각 미세기둥에 의해 분리되고 상호 유체가 이동하도록 병렬연결 된 제 3 배양채널 (350)을 포함한다. 상기 하부기판에 구비된 미세유체채널 즉, 제 1 배양채널, 제 2 배양채널, 제 3 배양채널, 제1 배지채널 및 제 2 배지채널 중 하나 이상이 상부기판에 구비된 싱크 (400) 및 상기 싱크 바닥면에 구비된 하나 이상의 미세구멍 (300)에 의해 개방된 미세유체채널 구조를 갖는다.
도 5는 본 제조예에 따라 제작한 미세유체칩의 다른 일 예로서, 하나의 미세유체칩 내에 종래기술에 따른 미세유체채널 구조와 본 발명의 미세유체채널 구조를 모두 포함한다. 도 5에서 왼쪽은 종래기술 (한국특허 제 10-1401199호)에 따른 혈관생성을 위한 미세유체채널 구조이고, 도 5의 가운데는 본 발명의 미세유체채널 구조로서 상부기판에 싱크 (400)가 구비되고 상기 싱크 바닥면은 하나의 미세오게 하는 방법이다.
도 6을 참조하면, 먼저 혈관형성을 위해, 상기 제조예에 따라 제작한 본 발명의 미세유체칩 (500)의 제 1 배양채널 (210) 및 제 2 배양채널 (220)에 섬유아세포를, 제 3 배양채널 (350) 에 혈관내피세포를 각각 하이드로젤에 혼합하여 주입하였다. 다음, 주입 후 2일에 한번 씩 세포배양액 EGM-2 (Endothelial cell growth medium-2)를 교체하면서, 인큐베이터에 보관구멍 (300)을 갖는다. 상기 미세구멍 (300)을 통해 하부기판의 제 1 배지채널 및 제 2 배지채널, 및 제 3 배양채널과 상호 유체가 이동할 수 있도록 (fluidic communication) 연결됨으로써, 세포의 이동은 불가능하지만 물질교환은 가능하게 하였다. 도 5의 오른쪽은 본 발명의 미세유체채널 구조에서 상부기판 (100)이 싱크 (400)를 포함하되 상기 싱크가 미세구멍(300) 없이 완전 개방된 구조를 갖도록 한 것이다. 따라서, 도 5의 가운데 또는 오른쪽 구조를 이용하면 예를 들어, 하부기판 (200)의 제 3 배양채널에 관류성 혈관망을 만들고 상부기판 (100)의 싱크 (400)를 이용하여 소조직 혹은 세포구를 공동배양 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 미세유체칩은 하나의 칩에 다양한 구조를 갖는 미세유체채널 및 싱크를 제작함으로써 동시에 다양한 실험을 수행할 수 있도록 할 수 있다. 또한, 본 제조예와 같은 인젝션 몰딩방법은 미세유체칩의 대량생산에 적합하다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 미세유체칩을 이용한 혈관생성 및 세포구 공동배양
상기 제조예에 따라 제작한 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여, 종래기술 (한국특허 제 10-1401199호 제 7쪽 ~ 제 13쪽)에 개시된 방법에 따라, 미세유체채널 내에 관류성 혈관을 생성시키고 암세포구를 공동배양하였다. 혈관의 생성은 혈관형성 (vasculogenesis) 또는 혈관신생 (angiogenesis) 과정을 수행하였다. 혈관형성은 섬유세포에서 분비된 생장물질이 혈관세포들에게 전반적으로 영향을 미쳐서 서로 연결되는 과정을 보여주며, 혈관신생은 신혈관형성 과정에 기초를 둔 방법으로 생장물질의 구배를 주어서 혈관세포가 생장물질 농도가 높은 방향으로 뻗어 나하여 혈관망이 형성되도록 하였다. 이와 함께, 현적배양법 (hanging drop)으로 세포구를 상기 본 발명의 미세유체칩 내 미세구멍 (300)위에 올려놓아 관류성 혈관과 세포구를 공동배양 할 수 있는 플랫폼을 완성하였다.
또한, 혈관신생을 위해, 상기 제조예에 따라 제작한 본 발명의 미세유체칩 (500)의 상기 제 1 배양채널 (210) 또는 상기 제 2 배양채널 (220) 중 어느 하나에 섬유아세포 NHLF (Normal human lung fibroblast)와 혼합한 하이드로젤을 채우고, 상기 제 3 배양채널 (350)에는 하이드로젤만 채웠다. 1일 후, 혈관내피세포를 배지유입구 (150)에 흘리고 미세유체칩을 90°로 30분 정도 기울여주어 상기 혈관내피세포가 하이드로젤 벽에 안착하도록 하였다. 다음, 현적배양법 (hanging drop)으로 세포구를 상기 미세유체칩 내 미세구멍 (300) 위에 올려놓아 관류성 혈관과 세포구를 공동배양 할 수 있는 플랫폼을 완성하였다.
실시예 2: 상부기판의 싱크를 통한 세포배양 중 배지공급
본 실시예를 위해 상기 제조예에서 제작한 미세유체칩 (500)과 종래기술에 따른 혈관형성을 위한 미세유체칩 (600)을 이용하였다. 관류성 혈관을 생성시키는 동안 배지공급의 영향을 비교하기 위해, 먼저 상기 본 발명의 미세유체칩과 종래기술의 미세유체칩 둘 모두에서 종래기술에 따라 (한국특허 제 10-1401199호 제 7 ~ 13쪽) 관류성 혈관을 생성시켰다. 다음, 배양을 시작 한 후 2일 째에 본 발명의 미세유체칩 (500)의 싱크를 통해 세포배양액 EGM-2 (Endothelial cell growth medium-2)를 가하였다.
도 2에서 왼쪽은 본 발명에 따른 미세유체칩을 이용하여 혈관망을 형성시킨 결과를 나타낸 것이고, 오른쪽은 종래기술에 따라 혈관망을 형성시킨 결과를 나타낸 것이다. 도 2에서 확인 되는 것과 같이, 종래 미세유체칩 (600)에서 배지공급의 한계로 인해 1 mm 이상의 길이를 갖는 관류성 혈관망 생성을 발견할 수 없었다. 반면에 본 발명의 미세유체칩 (500)에서는 5 mm 길이를 갖는 관류성 혈관망을 생성시켰다. 이는 종래기술과 같이 단일층 배양환경을 갖는 미세유체칩이, 배양채널의 폭이 커짐에 따라 배지의 확산이 느려져서 미세유체채널의 중간부분에서 세포가 잘 자라지 못하는 것을 보여준다. 반면에, 본 발명의 개방된 구조의 미세유체칩은 상부기판의 싱크에 구비된 미세구멍을 통하여 넓은 채널의 중간 부분까지 원활하게 배지를 공급할 수 있었다.
실시예 3: 관류성 혈관망의 내부 및 외부의 선택적 유체 접근
본 발명의 미세유체칩에서 관류성 혈관망을 형성시키고, 개방된 싱크를 통해 혈관 외부에서 물질을 처리하였다. 먼저 상기 실시예와 마찬가지로 종래기술에 제시된 방법에 따라 관류성 혈관망을 생성시켰다. 다음, 붉은색 시약 (Rhodamin-dextran, Sigma Aldrich)을 배지유입부 (150)에 가하였다. 도 4는 그 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 왼쪽 사진에서 확인되는 것과 같이, 붉은색 시약은 배지를 통해 혈관내부로 관류하여 혈관의 내부를 붉게 관측할 수 있게 하였다. 다음, 미세유체칩의 상부기판 (100) 중 싱크 (400)를 통해 개방된 제 3 배양채널 내로 녹색시약 (FITC, Sigma Aldrich)을 공급하였다. 상기 개방된 미세유체채널을 통한 공급된 녹색 시약은 혈관의 외부에만 전달되었고, 도 4의 오른쪽에 나타낸 것과 같이 혈관의 내부와 외부가 각각 붉은색과 녹색으로 염색된 결과를 수득하였다. 도 5에서 아래쪽 그래프 (그래프가 작습니다. 큰 그래프로 부탁드립니다)는, 본 발명의 미세유체칩에서 형성된 혈관벽을 사이에 둔 상기 두 종류 시약의 밝기를 측정한 것이며 (Confocal microscope, Olympus FV1000), 이와 같은 현상은 30분 이상 유지되었다.
실시예 4: 관류성 혈관과 암세포구의 공동배양
상기 제조예에 기술된 방법에 따라 본 발명의 미세유체칩을 제작하되 상부기판의 싱크가 200 μm의 크기의 미세구멍을 갖도록 하였다. 먼저 관류성 혈관망을 상기 실시예 및 종래기술에 개시된 것과 같은 방법으로 미세유체칩에 형성시켰다. 다음 암세포구 (U87MG, ACTCC)를 상기 기술한 것과 같이 배양하고, 이를 현적배양법 (hanging drop)으로 미세유체칩 상부기판의 미세구멍에 두었다. 이때 상기 암세포구는 400 μm를 갖는 것으로 확인되었다. 공동배양 7일 후 그 결과를 확인하고 도 7에 나타내었다. 도 7에서, 왼쪽 사진은 200 μm 의 미세구멍 배열이 있는 상부기판에 400 μm 크기를 갖는 암세포구를 공동배양 한 것이다. 미세유체채널의 하부기판에는 혈관세포가 망을 형성하였으며, 암세포구는 미세유체칩 상부기판의 싱크 내 미세구멍을 통해 하부기판의 혈관망과 상호 유체 이동하도록 연결되었다. 도 7의 오른쪽 사진은 하부기판에서 침투해 내려온 암세포가 혈관외부에 존재하는 것을 나타낸 형광 사진이다.
실시예 5: 인공피부와 공동 배양
본 발명의 상기 제조예에 따라 미세유체칩 (500)을 제작하되, 상부기판의 싱크에 시판 중인 트랜스웰 (코닝사, 제품 규격) (410)을 삽입하여 본 실시예에 사용하였다. 시판 중인 트랜스웰은 공동배양에 사용되는 장치로서 주로 멀티웰플레이트 (multi well plate)에서 사용된다. 먼저, 상기 실시예 및 종래기술에 기술된 방법에 따라 본 발명의 미세유체칩의 하부기판의 미세유체채널 중에 관류성 혈관망을 생성시켰다. 트랜스웰에 배양되어 있는 미리 수득한 인공피부조직, 또는 각질형성세포 (Human Epidermal Keratinocytes, neonatal, HEKn, Cascade Biologics)를 통해 층 분화하여 배양한 표피조직을 미세유체칩의 싱크에 삽입하여 인공피부조직과 관류성혈관망이 상호 유체 이동하도록 하였다. 먼저 LF 현탁액 (suspension) 5 mi/㎖를 피브린젤 (fibrin gel) (10 ㎎/㎖)과 3:1로 혼합하고 제1 배양채널 및 제 2 배양채널에 로딩하였다. HUVEC 현탁액 5 mi/㎖로 피브린젤 (10 ㎎/㎖)과 3:1로 혼합하여 제 3 배양채널에 로딩하였다. 하부기판의 배지채널에 EGM-2 배지를 넣고 상부기판의 싱크 또는 (일자) 채널에도 배지를 넣었다. 다음 날 상부 기판 상의 배지를 흡입 (suction) 하였다. 4 ~ 5 일 후 Keratinocytes (KC, Gibco)를 가하였다. 배지는 Epilife (Gibco)를 넣어 배양하였다. 3일 후 상부기판의 Epilife (Gibco)를 제거하고, 6주간 하부기판 상의 EGM 만 교체하면서 배양한 후 공초첨 현미경으로 분석하였다. 도 8은 그 결과를 나타낸 것으로서, 아래쪽 사진은 트랜스웰 내에서 배양되고 혈관화 된 표피층을 나타낸다.
실시예 6: 뇌 혈관 환경 모사
본 실시예에서는 하부 기판에 혈관형성 (vasculogenesis)으로 혈관망을 형성하고, 그 바로 위에 혈관주위세포 (pericyte) (PC) 를 2D로 배양하여 위의 혈관주위세포가 싱크의 미세구멍 (직경 200 ㎛)을 지나 하부 기판에 있는 채널의 혈관을 감싸는 형태를 제작하고자 하였다. LF (Lung fibroblast, Lonza, P6) 현탁액 5 mi/㎖로 피브린젤 (Lonza) (10 ㎎/㎖)과 3:1로 혼합하여 하부 기판의 제 1배양 채널 및 제 2 배양채널에 로딩하였다. HUVEC (Lonza, P4) 현탁액 5 mi/m㎖ 피브린젤 (10 ㎎/㎖)과 3:1로 혼합하여 제 3 배양채널에 로딩하였다. 하부기판의 배지채널에 EGM-2 배지(Lonza) 를 넣고, 상부 기판의 싱크 또는 (일자) 채널에도 배지를 제공하였다. 다음 날 상부 가판의 싱크 또는 (일자) 채널 양끝 (3 ㎜ 사이즈 레저버)에 있는 배지를 흡입 (suction) 하였다. 0.1 mi/㎖의 PC 현탁액 30 ㎕를 채널 한 쪽의 3 ㎜ 크기 레저버에 가하고, 채널 안으로 세포가 들어가도록 하였다. 30분 후 PC가 PDMS 구멍 멤브레인 바닥에 붙으면 채널에 EGM-2 배지를 가득 채웠다.
혈관화된 피부는 현재까지 알려진 바 없었다. 그러나 많은 질환과 조직반응은 혈관과의 상호작용을 포함하며 피부 또한 마찬가지이다. 동물실험이 금지된 화장품 분야, 동물실험이 과도하게 이용되는 신약개발 분야에 있어서 혈관화 된 인공피부의 배양법은 반드시 필요하다. 본 발명의 기술로 만들어진 혈관화 된 인공피부를 이용하면 종래 표피층과 진피층만 가지고 있었던 인공피부에서 볼 수 없던 실험결과를 기대할 수 있으며 피부과 혈관이 상호작용하여 서로에게 미치는 영향을 확인할 수 있을 것으로 기대한다.
Claims (15)
- 상부기판 및 하부기판으로 구성된 미세유체칩 구조물로서, 상기 하부기판은 하나 이상의 일렬 정렬된 미세기둥 (micropost)에 의해 구분되고, 상기 미세기둥의 간극을 통해 인접하는 미세유체채널과 상호 유체가 이동할 수 있도록 (fluidic communication) 병렬연결 된 하나 이상의 미세유체채널을 포함하며, 상기 상부기판은 하나 이상의 싱크 (sink)를 포함하고, 상기 상부기판과 상기 하부기판이 상기 싱크를 통해 상호 유체가 이동할 수 있도록 연결된 것인, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 1항에 있어서, 상기 싱크가 하나 이상의 미세구멍 (micropore)을 갖는 바닥면을 포함하고, 상기 미세구멍을 통해 상기 상부기판과 상기 하부기판이 상호 유체가 이동할 수 있도록 연결된 것인, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 싱크가 지름 5 ~ 10 mm의 크기를 갖는 것인, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 3항에 있어서, 상기 미세구멍이 지름 100 ~ 500 ㎛인 것인, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미세유체채널은 제 1 배양채널, 2 배양채널 및 제 3 배양 채널을 포함하고, 상기 제 3 배양채널은 양 측면에서 각각 제 1 배지채널 및 제 2 배지채널과 상호 유체가 이동하도록 인접하여 병렬연결 되며, 상기 제 1 배지채널은 다른 일 측면에서 상기 제 1 배양채널과 상호 유체가 이동하도록 병렬 연결되고, 상기 제 2 배지채널을 다른 일 측면에서 상기 제 2 배양채널과 상호 유체가 이동하도록 병렬연결 된 것인, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 1항 또는 제 2항의 미세유체칩의 하부기판에 구비된 미세유체채널 내에 1종이상의 세포 또는 관류성 혈관을 배양하고,상기 미세유체칩의 상부기판에 세포, 세포구 또는 조직을 배양하여, 상기 상부기판의 싱크를 통해 상기 상부기판의 세포, 세포구 또는 조직이 상기 하부기판의 미세유체채널 내의 세포 또는 관류성 혈관과 상호작용하는 것인,in vitro 에서 2종 이상의 세포, 세포구 또는 조직을 공동배양 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 미세유체채널 내에 관류성 혈관이 배양되고, 상기 상부기판에 암세포구가 배양되는 것을 특징으로 하는, in vitro 에서 2종 이상의 세포, 세포구 또는 조직을 공동배양 하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 미세유체채널 내에 관류성 혈관이 배양되고, 상기 상부기판의 싱크 내에 피부조직이 배양되는 것을 특징으로 하는, in vitro 에서 2종 이상의 세포, 세포구 또는 조직을 공동배양 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 미세유체칩의 하부기판에 구비된 미세유체채널 내에 관류성 혈관망을 형성시키고, 상기 미세유체칩의 상부기판의 싱크에 배지를 추가로 공급하는 것을 포함하는, 연장된 혈관 길이를 갖는 관류성 혈관망을 생성시키는 방법.
- 제 5항의 미세유체칩의 하부기판에 구비된 미세유체채널 내에 관류성 혈관망을 형성시키고, 상기 미세유체칩의 상부기판의 싱크에 배지를 추가로 공급하는 것을 포함하는, 연장된 혈관 길이를 갖는 관류성 혈관망을 생성시키는 방법.
- 제 9항에 있어서, 5 ㎜ 이상의 연장된 혈관 길이를 갖는 것을 특징으로 하는, 관류성 혈관망을 생성시키는 방법.
- 제 10항에 있어서, 5 ㎜ 이상의 연장된 혈관 길이를 갖는 것을 특징으로 하는, 관류성 혈관망을 생성시키는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 싱크 중에 임의의 공동배양장치가 삽입된 것을 특징으로 하는, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 13항에 있어서, 상기 공동배양장치가 트랜스웰 (상표명)인 것을 특징으로 하는, 개방된 미세유체채널을 갖는 미세유체칩.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 미세유체칩의 하부기판에 구비된 미세유체채널 내에서 조직 (tissue)을 배양하는 단계,상기 미세유체칩의 상부기판의 싱크에 분석대상 물질을 공급하는 단계; 및상기 분석대상 물질과 조직의 상호작용을 확인하는 단계를 포함하여,in vitro에서 상기 조직에 활성을 갖는 생리활성물질 또는 약물을 스크리닝 하는 방법.
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