WO2023136683A1 - 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도 - Google Patents

역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023136683A1
WO2023136683A1 PCT/KR2023/000715 KR2023000715W WO2023136683A1 WO 2023136683 A1 WO2023136683 A1 WO 2023136683A1 KR 2023000715 W KR2023000715 W KR 2023000715W WO 2023136683 A1 WO2023136683 A1 WO 2023136683A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
culture medium
biological tissue
chamber
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/000715
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
백상원
박성빈
Original Assignee
주식회사 휴먼에이스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 휴먼에이스 filed Critical 주식회사 휴먼에이스
Publication of WO2023136683A1 publication Critical patent/WO2023136683A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a human biological tissue chip including an inverted micro-bank structure and a use thereof.
  • Human biological tissue chip or organ-on-a-chip mimics the structure of the internal microenvironment of a specific organ in the human body and implements its characteristics by culturing cells constituting the organ in a microchamber. It is a system that Therefore, biological tissue chips are an effective alternative that can overcome these limitations of animal experiments, and are expected as a platform for preclinical drug development by realizing physiological activity at the tissue or organ level.
  • biotissue chips using cancer cells are used to achieve purposes such as testing the pharmacological activity of anticancer drug candidates and identifying mechanisms of cancer metastasis.
  • Korean Patent No. 10-1437149 A cancer cell culture chip in the form of supplying a culture medium enriched by fibroblasts to cancer cells is disclosed, and
  • Korean Patent Registration No. 10-1621211 discloses a microcomputer for verifying anticancer drugs that can check whether cancer cells invade vascular cells.
  • a fluid chip is disclosed, and
  • Korean Patent No. 10-1709312 discloses a hydrogel-based cell co-culture microfluidic chip capable of co-cultivating vascular endothelial cells and cancer cells, and Korean Patent No. 10-1701607 No.
  • Korean Patent No. 10-1784703 discloses a cell culture environment similar to a living body
  • a three-dimensional cell culture chip containing a hydrogel using bladder mucosal substratum is disclosed
  • Korean Patent Registration No. 10-1913777 uses a mesh-like microstructure having a three-dimensional pyramidal structure to culture cancer cells in a three-dimensional shape.
  • 10-2021-0014464 discloses normal vascular tissue , A microfluidic chip for co-culture of angiomimetic cells capable of mimicking cancer tissue and vascular tissue in which cancer has metastasized is disclosed.
  • a three-channel microfluidic system mimicking the lymphatic-tissue-vascular (LTB) structure capable of confirming cell-to-cell interactions in a cancer microenvironment is known (Cho H-Y, Choi J-H, Kim K-J, Shin M and Choi J-W ( 2021) Microguidic System to Analyze the Effects of Interleukin 6 on Lymphatic Breast Cancer Metastasis; Front. Bioeng. Biotechnol. 8:611802.).
  • the present inventors have newly developed a biological tissue chip capable of culturing human-derived cancer cells in an environment similar to an in vivo environment.
  • a main object of the present invention is to provide a biological tissue chip including a culture medium supply unit for supplying culture medium to cells, a cell supply unit including immobilized cells, and an inverted micro-bank structure provided therebetween.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy of an anticancer agent on cancer cells using the biotissue chip.
  • the biological tissue chip provided in the present invention, more accurate efficacy of anticancer drugs for cancer cells can be derived. Accordingly, by using it as an alternative test method for animal testing, it not only dramatically reduces the cost and period required for new drug development and drug screening, but also is useful for intracellular microenvironment research and other organ-on-a-chip research. will be able to use
  • FIG. 1 is a schematic view of a biotissue chip provided by the present invention, including a three-dimensional view and a microstructure diagram, and an overall schematic diagram including components within the chip.
  • FIG. 2 is a three-dimensional view of a biological tissue chip provided by the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view of a biological tissue chip provided by the present invention.
  • FIG. 4 is a partially enlarged view of a cell chamber and a culture medium provided in a biological tissue chip provided by the present invention.
  • FIG 5 is a partially enlarged view of the inverted micro-weir structure provided in the biological tissue chip provided by the present invention.
  • Figure 6 shows the result of comparing the degree of damage to breast cancer cells with a control group by injecting breast cancer cells (MCF-7) into a biotissue chip provided by the present invention, culturing for 2 days, and then treating with doxorubicin, an anticancer drug. It is a picture.
  • Figure 7 shows the result of comparing the degree of damage to cervical cancer cells with a control group by injecting cervical cancer cells (HeLa) into a biological tissue chip provided by the present invention, culturing them for 2 days, and then treating them with doxorubicin, an anticancer drug. It is a picture.
  • HeLa cervical cancer cells
  • liver cancer cells HepG2
  • doxorubicin an anticancer drug
  • One embodiment for achieving the above object of the present invention is (a) a culture medium supply chamber; a culture medium recovery chamber; And, a culture solution supply unit comprising; a culture solution channel communicating with each of the chambers; (b) a cell inlet provided at one side end; a residue outlet provided at the other end; and a cell chamber provided between the cell inlet and the retentate outlet and extending in the same direction in contact with the culture medium channel; and, (c) a biological tissue comprising an inverse-fine dam structure provided at a site selected from the group consisting of the junction of the culture medium and the cell chamber, the junction of the cell chamber and the retentate outlet, and combinations thereof. provide chips.
  • the "reverse-fine weir structure” provided in the present invention refers to a partial blocking member provided at the junction between the culture medium channel and the cell chamber or the junction between the cell chamber and the retentate outlet.
  • the reverse-fine weir Structure refers to a partial blocking member that blocks a part of the space at the junction between the culture medium channel and the cell chamber or at the junction between the cell chamber and the residue outlet to prevent the movement of cells while allowing the movement of liquid components. In the sense of a structure in the form of a weir, it was named “reverse-fine weir structure”.
  • the reverse-fine weir extends in the same direction along the junction, the upper end is coupled to the upper end of the junction, and the lower end is spaced apart from the bottom of the junction.
  • an inverse-fine weir structure extends in the same direction along the junction, and the upper end of the reverse-fine weir structure is coupled with the upper end of the junction.
  • the lower end of the reverse-fine weir structure may be provided to be spaced apart from the bottom of the connecting portion.
  • the inverted micro-bank structure included in the biological tissue chip provided by the present invention is provided so that its upper end is coupled to the upper end of the junction and its lower end is spaced apart from the bottom of the junction, through the spaced part.
  • Cells or hardened cells may not pass through, but liquid components may pass through.
  • the shape of the inverse-microbank structure is not particularly limited as long as it exhibits the above-described functionality, but as an example, it may be a microbarrier structure having a rectangular or arcuate cross section, which allows cells to escape to the outside of the cell chamber. This is to freely circulate the culture medium inside and outside the cell chamber in a state where it does not go out.
  • the distance between the spaced portions provided at the lower end is not particularly limited thereto as long as cells are not allowed to pass through, but may be, for example, 5 ⁇ m to 20 ⁇ m, and, as another example, 7 ⁇ m to 15 ⁇ m. It may be, and as another example, it may be 10 ⁇ m.
  • the gap between the spaced parts is less than 5 ⁇ m, the liquid component cannot pass between the lower end of the inverted-fine weir structure and the bottom of the junction due to surface tension, and when the space between the spaced parts is wider than 20 ⁇ m, Cells may move through the spaced-apart area and thus escape from the cell chamber.
  • the reverse-micro-dike structure provided at the junction between the culture medium channel and the cell chamber extends in the same direction along the junction and prevents cells from passing through the spaced portion at the lower end.
  • it may be configured to allow mutual flow of culture medium between the culture medium channel and the cell chamber.
  • the reverse-fine dam structure provided at the junction between the cell chamber and the remnant outlet is provided in the form of an arc bent in the direction of the retentate outlet, and through the spaced portion at the lower end of the cells. It can be configured to allow the discharge of retentate from the cell chamber to the retentate outlet, while preventing passage.
  • the inverted-fine dam structure which is an improved partial blocking member described above, partially opens the junction between the culture medium channel and the cell chamber instead of completely opening it like the conventional fine columnar structure, It shows the same effect in that it serves to prevent the movement of
  • the reverse-fine weir structure has a simpler shape than the fine columnar structure having an elaborate and complex shape, the manufacturing cost of the mold used for its manufacture can be reduced and the yield of the result obtained from the mold can be improved. There are advantages to being able to.
  • the microcolumn structure provided in the conventional endomyocardial-mimicking heart chip is round so that the cell mixture is injected only into the cell chamber and not into the culture medium channel.
  • the boundary it is necessary to induce the boundary to be formed by surface tension.
  • a post-processing process maintained in an oven at 80 ° C. for 48 hours must be performed, which increases production cost and time. there is.
  • the reverse-fine weir structure provided by the present invention is structurally designed so that cells cannot pass through, there is no need to form a boundary by surface tension and no need to perform a post-processing process for this. there is
  • the biotissue chip including the reverse-fine weir structure provided by the present invention has an advantage in that the manufacturing process can be further simplified, thereby exhibiting an effect of improving productivity.
  • the material of the overall structure of the biotissue chip provided in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit or adversely affect the fixation and culture of cells, but, for example, polycaprolactone (PCL) , poly(dimethylsiloxane), PDMS), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polydioxanone (PDO), and the like, and other examples As such, it can be optically transparent, durable, bio-friendly, and flexible PDMS.
  • PCL polycaprolactone
  • PDA poly(dimethylsiloxane)
  • PDMS polylactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PDO polydioxanone
  • the culture medium supply chamber included in the biological tissue chip provided by the present invention serves to store the culture medium for cell culture to be supplied to the cell chamber through the reverse-fine weir structure and to supply the stored culture medium to the cells through the medium channel. do.
  • the culture medium supply chamber may be used as a culture vessel for culturing hepatocytes.
  • the culture medium recovery chamber included in the biological tissue chip provided by the present invention is a part where the culture medium supplied from the culture medium supply chamber is finally stored after passing through the culture medium channel, and serves to recover the contaminated culture medium after cell culture. However, it is used for the purpose of preventing contamination of the surrounding environment due to the culture medium contaminated with various metabolites, waste products, etc. secreted from cells after culture.
  • the culture channel included in the biological tissue chip provided by the present invention serves as a main flow path for the culture medium through which the culture medium flows from the culture medium supply chamber to the culture medium recovery chamber. It serves to supply the culture medium and recover the culture medium used for cell culture.
  • the culture medium channel can be interpreted as a component simulating capillaries for supplying nutrients to cells existing in vivo.
  • the width of the culture medium channel is not particularly limited as long as it can mimic the function of capillaries, but as an example, it may have a width of 20 to 40 ⁇ m, and as another example, a width of 25 to 35 ⁇ m. , and as another example, may have a width of 30 ⁇ m.
  • a biological tissue chip can be manufactured in a form similar to a living environment.
  • the cell inlet included in the biotissue chip provided in the present invention serves to introduce a cell mixture to be supplied to the cell chamber.
  • the cell mixture may include cells and auxiliary components that assist in distribution and fixation of the cells.
  • the biological tissue chip of the present invention includes cells that are aligned and exist in a fixed form inside the cell chamber included therein. In order to inject the cells into the cell chamber and fix the injected cells into the cell chamber, Auxiliary components are needed to assist this.
  • the auxiliary component mimics the extracellular matrix (ECM) present in the microenvironment around cells, is essential for three-dimensional cell culture of cells, and plays a role in maintaining the structure and function of cultured cells similar to those in vivo.
  • ECM extracellular matrix
  • the auxiliary component is not particularly limited thereto as long as it can assist in influx and fixation of cells, but as an example, a hydrogel may be used, and as another example, a collagen hydrogel, an alginate hydrogel, and a GelMa hydrogel may be used. A gel or the like can be used.
  • the hydrogel is mixed with the cells to assist in the three-dimensional culture of the cells, and additionally imparts fluidity to the cells, allowing the cells to move from the cell inlets to the cell chambers.
  • the hydrogel can be cured under various conditions.
  • the collagen hydrogel can be cured by inducing a temperature increase by placing it in an incubator for 1 hour or more, and the alginate hydrogel can replace the medium in the culture medium. It can be hardened by injecting a CaCl 2 solution, and the Zelma hydrogel can be hardened by irradiating ultraviolet rays. After the cell mixture moves into the cell chamber and the hydrogel contained therein is cured, the cells contained in the cured hydrogel can be naturally immobilized. An external culture medium can be delivered to the cells to assist in culturing the fixed cells.
  • the cell chamber included in the biological tissue chip provided by the present invention can not only store and fix the cell mixture supplied through the cell inlet, but also serve as a culture vessel for culturing the fixed cells. there is.
  • the cell chamber can be interpreted as a component that mimics the microstructure of a cell existing in vivo.
  • the width of the cell chamber is not particularly limited as long as it can fix and culture cells, but may have a width of, for example, 20 to 2000 ⁇ m, and as another example, 100 to 1000 ⁇ m. It may have a width, and as another example, it may have a width of 600 ⁇ m.
  • the cell chamber may be in the form of a communication passage between the cell inlet and the residue outlet, and a reverse-fine dam structure is provided inside the portion communicating with the residue outlet, and thus, through the cell inlet
  • the cells included in the supplied cell mixture do not migrate to the retentate outlet and remain in the cell chamber.
  • the cells that can be injected into the cell chamber are not particularly limited thereto, but as an example, various types of solid cancer cells, cardiomyocytes, smooth muscle cells, rhabdomyomus cells, kidney cells, hepatocytes, epithelial cells, nerve cells, stem cells , may be a cell selected from the group consisting of vascular endothelial cells, bone cells, scalp cells, spleen cells, lung cells, oral cells, skin cells, hair follicle cells, brain cells, spinal cord cells, and combinations thereof, as another example. , breast cancer cells, cervical cancer cells, and solid cancer cells such as liver cancer cells.
  • the remnant outlet included in the biological tissue chip provided in the present invention can play a role of discharging contaminants such as metabolites or waste products generated from the cells while culturing the cells fixed in the cell chamber to the outside.
  • the role of discharging contaminants can be performed not only by the residue outlet but also by the cell inlet. That is, the cell inlet that has completed its role of introducing cells into the cell chamber may serve to discharge contaminants generated while culturing the cells fixed in the cell chamber to the outside.
  • the shape of the residue outlet is not particularly limited as long as it can play a role in discharging contaminants such as various metabolites and waste products secreted from cells included in the cell mixture to the outside, similar to the culture medium recovery chamber described above.
  • it may be configured in a form in which a nozzle of a tube or syringe can be coupled.
  • the biological tissue chip provided in the present invention basically includes at least one culture medium supply unit and one cell supply unit, but may include a plurality of culture medium supply units and cell supply units depending on the purpose of using the biological tissue chip.
  • each culture supply unit may be provided on both sides around the cell supply unit.
  • the reverse-fine dam structure It is formed between a plurality of culture medium channels and one cell chamber, and in order to exclude interference between each culture medium channel, each culture medium channel may be configured not to be adjacent to each other, or may be configured to be completely isolated from each other even if they are adjacent.
  • the biological tissue chip includes two culture medium supply chambers; two culture fluid recovery chambers; two media channels; one cell inlet; one residue outlet; one cell chamber connected to the culture medium channel; and a reverse-fine weir structure provided at a junction between the cell chamber and the culture solution channel and at a junction between the cell chamber and the retentate outlet.
  • the cell culture is completed within about 7 days, and the characteristics of the cultured cells can be studied.
  • apoptosis of breast cancer cells may occur due to the effect of the drug.
  • cell death of the cervical cancer cells may occur due to the effect of the drug.
  • liver cancer cell death may occur due to the effect of the drug.
  • the biotissue chip (2) provided by the present invention is in the form of a structure provided on a slide glass (1), and has a cardiomyocyte supply part composed of a cell inlet (5), a residue outlet (6) and a cell chamber (8).
  • a cardiomyocyte supply part composed of a cell inlet (5), a residue outlet (6) and a cell chamber (8).
  • two sets of culture solution supply units consisting of a culture solution supply chamber 3, a culture solution recovery chamber 4 and a culture solution channel 7 are provided on both sides, respectively.
  • the cell chamber 8 and the culture medium channel 7 are distinguished from each other by an inverse-fine weir structure 9 provided at their junction, and the junction between the cell chamber 8 and the retentate outlet 6. Edo reverse-fine weir structure 10 is provided.
  • Another embodiment for achieving the above object of the present invention provides a method for evaluating the efficacy of a drug on cells using the biological tissue chip.
  • One method for evaluating the efficacy of a drug on cells includes (a) culturing cells included in a cell chamber included in the biotissue chip; (b) administering a desired drug to a culture solution supply chamber included in the biological tissue chip; and (c) measuring changes in the cultured cells.
  • the change of the cell is not particularly limited thereto, but as an example, whether or not the cultured cell is damaged, whether it grows, whether or not the secreted component is changed, whether the gene expression level is changed, whether the protein level is changed, and combinations thereof It may be selected from the group consisting of, and as another example, the change of the cell may be the death of the cultured cancer cells in the case of cultured cancer cells.
  • Another method for evaluating the efficacy of drugs on cells includes (a) culturing hepatocytes in a culture medium supply chamber included in the biotissue chip; (b) culturing the cells included in the cell chamber included in the biological tissue chip; (c) administering a drug of interest to the culture solution supply chamber containing the cultured hepatocytes; and (d) measuring changes in the cultured cells.
  • breast cancer cells MCF-7
  • adhesion of breast cancer cells is confirmed at about 1 day after culture, and the attached breast cancer cells are stabilized.
  • apoptosis of breast cancer cells may occur due to the effect of the drug.
  • the effect of the desired drug on the breast cancer cells can be evaluated.
  • cervical cancer cells when cervical cancer cells (HeLa) are used as cells to be cultured, adhesion of cervical cancer cells is confirmed at about 1 day after culture, and the attached cervical cancer cells are stabilized.
  • a drug of interest is administered to the culture medium supply chamber at the time point, apoptosis of cervical cancer cells may occur due to the effect of the drug.
  • the effect of the target drug on cervical cancer cells can be evaluated by checking the degree of apoptosis of the cervical cancer cells.
  • liver cancer cells HepG2
  • adhesion of the liver cancer cells was confirmed at about 1 day after culture, and the time when the attached liver cancer cells were stabilized.
  • a drug of interest is administered to the culture medium supply chamber, apoptosis of liver cancer cells may occur due to the effect of the drug.
  • the effect of the target drug on liver cancer cells can be evaluated by checking the degree of apoptosis of the liver cancer cells.
  • the biological tissue chip of the present invention was fabricated using PDMS (polydimethylsiloxane) elastomer and slide glass.
  • the fabricated microfluidic device is immersed in a sonicator containing isopropyl alcohol, and the PDMS-based microfluidic device is immersed in a sonicator, subjected to sonication, and then washed with an air-gun. dried completely.
  • a biological tissue chip was fabricated by putting the PDMS-based microfluidic device and the slide glass into a plasma processor and bonding them through oxygen plasma treatment.
  • the fabricated biological tissue chip was placed in a 35 mm Petri dish, and heat was applied on a hot plate heated to 80° C. for 30 minutes to harden the adhesion by plasma treatment.
  • the total size of the biological tissue chip fabricated as described above is 2.7 cm in width and 2 cm in length, and the height of all channel microstructures in the chip is 50 ⁇ m, and the heights other than the inverse micro-weir structure are 5 ⁇ m.
  • the width of the cell channel is 600 ⁇ m, which is about three times the diameter of the myocardial bundle in vivo, which is about 200 ⁇ m.
  • the width of the culture medium channel is 30 ⁇ m, which is about 3 times the diameter of the capillaries in vivo, which is about 10 ⁇ m. designed to imitate.
  • the inverted-fine dam structure located in the direction of the residue outlet of the cell channel has a thickness of 60 ⁇ m and is located in an arc shape in the direction of the outlet in the portion immediately before the width of the cell channel narrows, so that the injected cell-hydrogel mixture escapes toward the residue outlet. It was designed to induce accumulation without going out, and only smooth injection and pressure generated during injection allowed the residue to escape toward the outlet.
  • the inverted-fine dam structure provided at the junction between the cell channel and the culture medium was designed in a rectangular shape with a thickness of 100 ⁇ m, and similarly, the cell-hydrogel mixture was designed to accumulate without escaping to the outside of the cell channel.
  • the diameter of each inlet and outlet connected to the cell channel was 1.5 mm, and the diameter of the culture solution channel connected to the culture medium supply chamber and the recovery chamber was set to 8 mm.
  • Example 2-1 Biological tissue chip containing breast cancer cells
  • Example 2-1-1 Fabrication of biotissue chip containing breast cancer cells
  • RPMI 1640 (Gibco) supplemented with 200 ⁇ l of culture medium (10% FBS (Fetal bovine serum, gibco)) in a set of culture medium supply chamber and recovery chamber included in the biological tissue chip of the present invention prepared in Example 1 above. ) was loaded, and the flow of the culture solution was connected between each chamber using a pipette, and then the culture medium was filled into the culture medium channels located on both sides to finally create the medium flow. At this time, it was confirmed that the medium formed a boundary between the culture solution channel and the cell chamber by the surface tension with the reverse-fine bank structure as a boundary.
  • culture medium 10% FBS (Fetal bovine serum, gibco)
  • breast cancer cells (Michigan Cancer Foundation-7, MCF-7) were injected into the cell inlet in an amount of 3 ⁇ 10 4 cells, and pipetting was performed to transfer the injected breast cancer cells into the cell chamber. injected. Thereafter, by confirming that the breast cancer cells are not lost and form a boundary by the reverse-fine-dike structure, it is confirmed that the breast cancer cells and the culture medium are successfully separated and injected, and then placed in a humidified incubator under conditions of 37° C. and 5% CO 2 . Cultured for 2 days.
  • Example 2-1-2 Function evaluation of biotissue chip containing breast cancer cells
  • doxorubicin 100 ⁇ M of doxorubicin (TOCRIS) was added to the culture solution supply chamber of the biological tissue chip containing breast cancer cells prepared in Example 2-1-1, and changes in breast cancer cells in the biological tissue chip by the doxorubicin were observed under an optical microscope. Observed, and the degree of damage of breast cancer cells was compared and analyzed with the control group (FIG. 6). At this time, as a control, a biological tissue chip containing breast cancer cells not treated with doxorubicin was used.
  • Figure 6 shows the result of comparing the degree of damage to breast cancer cells with a control group by injecting breast cancer cells (MCF-7) into a biotissue chip provided by the present invention, culturing for 2 days, and then treating with doxorubicin, an anticancer drug. It is a picture.
  • Example 2-2 Biological tissue chip containing cervical cancer cells
  • Example 2-2-1 Fabrication of biological tissue chip containing cervical cancer cells
  • 3 ⁇ 10 4 cells of cervical cancer cells were injected into the cell inlet using a pipette, and the injected cervical cancer cells (HeLa) were injected into the cell chamber by pipetting. Then, by confirming that the cervical cancer cells (HeLa) are not lost and form a boundary by the inverted-fine dam structure, after confirming that the cervical cancer cells (HeLa) and the culture medium were successfully separated and injected, 37 ° C and 5% CO 2 for 2 days in a humidified incubator.
  • Example 2-2-2 Function evaluation of biological tissue chip containing cervical cancer cells
  • doxorubicin 100 ⁇ M of doxorubicin was added to the culture solution supply chamber of the biological tissue chip containing cervical cancer cells (HeLa) prepared in Example 2-2-1, and changes in cervical cancer cells in the biological tissue chip by the doxorubicin were observed under an optical microscope. , and the degree of damage of cervical cancer cells was compared and analyzed with that of the control group (FIG. 7). At this time, as a control, a biological tissue chip containing cervical cancer cells not treated with doxorubicin was used.
  • Figure 7 shows the result of comparing the degree of damage to cervical cancer cells with a control group by injecting cervical cancer cells (HeLa) into a biological tissue chip provided by the present invention, culturing them for 2 days, and then treating them with doxorubicin, an anticancer drug. It is a picture.
  • HeLa cervical cancer cells
  • Example 2-3 Biological tissue chip containing liver cancer cells
  • Example 2-3-1 Fabrication of a biological tissue chip containing liver cancer cells
  • culture medium 25 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, gibco ), 25 mM NaHCO 3 (Sodium bicarbonate, Sigma-aldrich), 10% (v/v) FBS, MEM (Minimum Essential Media Eagle, high-glucose, gibco)
  • MEM Minimum Essential Media Eagle, high-glucose, gibco
  • liver cancer cells 3 ⁇ 10 4 cells of liver cancer cells (HepG2) were injected into the cell inlet using a pipette, and the injected liver cancer cells (HepG2) were injected into the cell chamber by pipetting. Then, by confirming that the liver cancer cells (HepG2) are not lost and form a boundary by the reverse-fine dam structure, after confirming that the liver cancer cells (HepG2) and the culture medium were successfully separated and injected, respectively, at 37 ° C. and 5% CO 2 It was cultured for 2 days in a humidified incubator.
  • Example 2-3-2 Function evaluation of biological tissue chip containing cervical cancer cells
  • doxorubicin 100 ⁇ M of doxorubicin was added to the culture solution supply chamber of the biotissue chip containing the liver cancer cells (HepG2) prepared in Example 2-3-1, and changes in the liver cancer cells in the biotissue chip by the doxorubicin were observed with an optical microscope. And, the degree of damage of liver cancer cells was compared with that of the control group (FIG. 8). At this time, as a control, a biological tissue chip containing cervical cancer cells not treated with doxorubicin was used.
  • liver cancer cells HepG2
  • doxorubicin an anticancer drug
  • the biological tissue chip provided by the present invention cultivates various solid cancers such as breast cancer, cervical cancer, and liver cancer under conditions similar to in vivo conditions, thereby increasing the activity of anticancer drugs. It was confirmed that it can be effectively verified.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 역-미세둑 구조가 포함된 생체조직칩 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 생체조직칩을 사용하면, 기존 2차원 in-vitro 세포 배양법의 인체 미세환경을 모방하지 못하는 한계점과 동물실험의 이종간의 차이에 따른 부정확성을 극복할 수 있고, 약물처리에 따른 세포에 대한 보다 정확한 효능 및 독성결과를 도출할 수 있다. 이에 따라, 동물실험 대체 시험법으로 이용함으로써 신약 개발 및 약물 스크리닝 시 필요한 비용 및 기간을 획기적으로 감소시킬 뿐 아니라 세포 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구, 신약 개발, 약물 대사 기전 연구 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도
본 발명은 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도에 관한 것이다.
약물 개발은 많은 시간과 노력을 필요로 하고 비용이 많이 들지만, 개발이 진행된 약들 중 극소수만이 승인을 받는다. 단일 의약품에 대한 규제 승인을 달성하기 위해선 약 25억 달러 이상의 엄청난 고비용과 10-15년 정도의 장 시간이 요구 된다. 이를 극복하기 위해, 많은 동물 또는 세포 기반 실험이 약물 개발의 초기 단계에서 일반적으로 수행되어 왔다.
동물에 기반한 실험은 고비용이고 장 시간이 필요하고 윤리적인 문제에서도 자유로울 수 없었으며, 인간과 다른 이온채널의 존재, 약동학적 차이 등 종간 차이(inter-species differences)라는 한계점을 지니고 있어 동물실험 결과가 인간에게 똑같이 적용되지 않는 경우가 많고, 동물실험을 거쳐 임상실험을 통과한다고 하더라도 부작용으로 다시 퇴출되는 경우가 있는 실정이다. 세포 기반 실험에서 세포는 보통 2차원 조건에서 배양된다. 이러한 2차원 세포 배양 모델은 취급의 용이성과 높은 처리량 면에서 장점이 있지만, 2차원 배양 과정에서 세포가 고유의 기능을 상실하여 잘못된 평가 결과가 나오기 때문에 이를 이용한 약물 효능 및 독성평가에는 한계가 있다. 인체 장기에서 세포는 세포외기질(ECM, Extracellular Matrix)과 함께 3차원 구조 환경에 있고 모세혈관에서 영양소와 산소를 확산으로 계속 공급받고 그 후 생성된 노폐물과 대사산물 그리고 이산화탄소를 혈관을 통해 확산 배출 시킨다. 따라서 실제 장기의 구조적, 생리적, 환경적 특성을 반영하는 효율적인 약물 효능 및 독성평가 플랫폼이 필요하다.
인간 생체조직칩 또는 생체조직칩(organ-on-a-chip; OoC)은 인체 특정 장기의 내부 미세환경(microenvironment) 구조를 모방하여 마이크로챔버에 해당 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써 그 특성을 구현하는 시스템이다. 따라서, 생체조직칩은 이러한 동물실험의 한계점들을 극복할 수 있는 효과적인 대안이며, 조직 또는 장기 수준의 생리활성을 구현함으로써 전 임상 신약개발 플랫폼으로 기대되고 있다.
이러한 인간 생체조직칩의 하나로서 암세포를 이용한 생체조직칩은 항암제 후보물질의 약리활성 시험, 암전이 작용기전의 규명 등의 목적을 달성하기 위하여 사용되고 있는데, 예를 들어, 한국등록특허 제10-1437149호에는 섬유아세포에 의해 농축된 배양액을 암세포에 공급하는 형태의 암세포 배양칩이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1621211호에는 암세포가 혈관세포를 침윤하는지의 여부를 확인할 수 있는 항암제 검증용 마이크로 유체칩이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-1709312호에는 혈관내피세포 및 암세포의 공동 배양이 가능한 하이드로젤 기반의 세포 공동-배양용 미세유체칩이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1701607호에는 세포 배양 챔버간 연속적인 농도구배를 유도함으로써 항암제 내성암세포를 스크리닝할 수 있는 미세유체 칩이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-1784703호에는 생체와 유사한 세포배양 환경을 조성할 수 있도록, 방광점막하기질을 이용한 하이드로겔을 포함하는 3차원 세포배양 칩이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1913777호에는 3차원 피라미드 구조를 갖는 메쉬형 미세구조체를 이용하여 3차원 입체적 형상의 암세포를 배양함으로써, 암세포의 본래 특성 재현 및 생체 내 환경과 유사한 활동성을 구현할 수 있는 3차원 메쉬형 미세구조체 기반 항암제 효능평가용 세포칩이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제10-2021-0014464호에는 정상 혈관조직, 암 조직 및 암이 전이된 혈관조직을 모사할 수 있는 혈관모사 세포공동배양용 미세유체칩이 개시되어 있으며, 림프 전이 과정 중 염증성 사이토카인, 스트로마 반응, 저산소증, 영양소 결핍 등 다양한 세포외 자극 하에서 암 미세 환경에서의 세포간 상호작용을 확인할 수 있는 림프관-조직-혈관(LTB) 구조를 모방한 3채널 미세유체 시스템이 공지되어 있다(Cho H-Y, Choi J-H, Kim K-J, Shin M and Choi J-W (2021) Microguidic System to Analyze the Effects of Interleukin 6 on Lymphatic Breast Cancer Metastasis; Front. Bioeng. Biotechnol. 8:611802.).
본 발명자들은 인간으로부터 유래된 암세포를 생체내 환경과 유사한 환경에서 배양할 수 있는 생체조직칩을 새로이 개발하였다.
본 발명의 주된 목적은 세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 세포를 포함하는 세포 공급부 및 이들 사이에 구비된 역-미세둑 구조를 포함하는 생체조직칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생체조직칩을 이용하여 암세포에 미치는 항암제의 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩을 사용하면, 암세포 등에 대한 항암제의 보다 정확한 효능을 도출할 수 있다. 이에 따라, 동물실험 대체 시험법으로 이용함으로써 신약 개발 및 약물 스크리닝 시 필요한 비용 및 기간을 획기적으로 감소시킬 뿐 아니라 세포 내 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩의 입체도와 미세구조도 및 칩 내 구성요소가 포함된 전체 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 생체조직칩의 입체도이다.
도 3은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩의 평면도이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 구비된 세포 챔버와 배양액 채널의 부분 확대도이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 구비된 역-미세둑 구조의 부분 확대도이다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 유방암 세포(MCF-7)를 주입하고, 2일 동안 배양한 다음, 항암제인 독소루비신을 처리하여, 유방암 세포의 손상정도를 대조군과 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 자궁경부암 세포(HeLa)를 주입하고, 2일 동안 배양한 다음, 항암제인 독소루비신을 처리하여, 자궁경부암 세포의 손상정도를 대조군과 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 간암 세포(HepG2)를 주입하고, 2일 동안 배양한 다음, 항암제인 독소루비신을 처리하여, 간암 세포의 손상정도를 대조군과 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태는 (a) 배양액 공급 챔버; 배양액 회수 챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부; (b) 일 측단에 구비된 세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 잔류물 유출구; 및, 상기 세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 구비되고, 상기 배양액 채널과 연접하여 동일한 방향으로 연장된 세포 챔버;를 포함하는 세포 공급부; 및, (c) 상기 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부, 상기 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 부위에 구비된 역-미세둑 구조를 포함하는, 생체조직칩을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 "역-미세둑 구조"란, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부 또는 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 부분 차단부재를 의미하는데, 구체적으로, 상기 역-미세둑 구조란, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부 또는 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부의 일부 공간을 차단하여 세포의 이동은 방지하면서 액상성분의 이동을 허용하는 부분 차단부재를 의미하는데, 거꾸로 천정부위에 결합된 둑(weir) 형태의 구조물이라는 의미에서 "역-미세둑 구조"라 명명하였다. 구체적인 예로서, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부의 경우 상기 연접부를 따라 동일한 방향으로 연장되고, 그의 상단이 연접부의 상단과 결합되고, 그의 하단이 연접부의 바닥과 이격되도록 구비된 형태의 역-미세둑 구조가 구비될 수 있고, 다른 예로서, 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부의 경우 상기 연접부를 따라 역-미세둑 구조가 동일한 방향으로 연장되는데, 역-미세둑 구조의 상단은 연접부의 상단과 결합되며, 역-미세둑 구조의 하단은 연접부의 바닥과 이격되도록 구비될 수 있다.
앞서 정의한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 역-미세둑 구조는 그의 상단이 연접부의 상단과 결합되고, 그의 하단이 연접부의 바닥과 이격되도록 구비되어, 상기 이격된 부위를 통해 세포 또는 경화된 세포는 통과하지 못하고, 액상성분은 통과할 수 있도록 구성될 수 있다.
상기 역-미세둑 구조의 형태는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 단면이 직방형 또는 호의 형태를 갖는 미세 장벽 구조가 될 수 있는데, 이는 세포가 세포 챔버 외부로 빠져나가지 않는 상태에서 배양액을 자유로이 세포 챔버의 내부와 외부로 유통시키기 위함이다. 또한, 하단에 구비된 이격된 부위의 간격은 세포의 통과가 허용되지 않는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 5 ㎛ 내지 20 ㎛가 될 수 있고, 다른 예로서, 7 ㎛ 내지 15 ㎛가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 10 ㎛가 될 수 있다.
상기 이격된 부위의 간격이 5 ㎛ 보다 작은 경우에는 표면장력에 의해 역-미세둑 구조의 하단과 연접부의 바닥사이로 액상성분이 통과할 수 없고, 상기 이격된 부위의 간격이 20 ㎛ 보다 넓은 경우에는 상기 이격된 부위를 통해 세포가 이동하여 세포 챔버로부터 세포가 빠져나갈 수 있다.
또한, 상기 역-미세둑 구조 중에서, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 연접부를 따라 동일한 방향으로 연장되도록 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 세포의 통과를 방지하면서도, 배양액 채널과 세포 챔버간에 배양액의 상호유통을 허용하도록 구성될 수 있다.
아울러, 상기 역-미세둑 구조 중에서, 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 잔류물 유출구 방향으로 굽어진 호의 형태로 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 세포의 통과를 방지하면서도, 세포 챔버로부터 잔류물 유출구로의 잔류물 배출을 허용하도록 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 있어서, 앞서 설명한 개량된 부분 차단부재인 역-미세둑 구조는 종래의 미세 기둥 구조물과 동일하게 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하여 세포의 이동을 방지하는 역할을 수행한다는 점에서 동일한 효과를 나타낸다.
그러나, 역-미세둑 구조는 정교하고 복잡한 형태를 갖는 미세 기둥 구조물에 비하여, 단순한 형태를 나타내므로, 이의 제조에 사용되는 주형의 제작비용을 절감할 수 있고, 주형으로부터 얻어진 결과물의 수율을 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.
뿐만 아니라, 종래의 심근내막 모방 심장칩에 구비된 미세 기둥 구조물은 세포 챔버에 세포 혼합물을 주입할 때, 상기 세포 혼합물이 세포 챔버에만 주입되고, 배양액 채널로는 주입되지 않도록, 미세 기둥 구조물의 둥근 모서리가 시작되는 부분에서 표면장력에 의해 경계가 형성되게끔 유도하여야 하는데, 이를 위하여 80℃ 오븐에서 48시간 동안 유지하는 후처리 공정을 필수적으로 수행하여야만 하므로, 이로 인하여 생산비용과 시간이 증가된다는 단점이 있다. 이에 반하여, 본 발명에서 제공하는 역-미세둑 구조는 구조적으로 세포가 통과할 수 없도록 설계되었기 때문에, 표면장력에 의한 경계를 형성할 필요도 없고, 이를 위한 후처리 공정을 수행할 필요도 없다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 역-미세둑 구조를 포함하는 생체조직칩은 제조공정을 보다 단순화 시킬 수 있어, 이에 의한 생산성 향상효과를 나타낼 수 있다는 장점이 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 생체조직칩의 전체적인 구조물의 재질은 세포의 고정 및 배양을 저해하거나 좋지않은 영향을 미치지 않는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리락틱산(polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO) 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 광학적으로 투명하고, 내구성이 강하며, 생물 친화적이고, 유연한 PDMS 등이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 배양액 공급 챔버는 역-미세둑 구조를 통해 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 배양용 배양액을 저장하고, 저장된 배양액을 배양액 채널을 통해 세포에 공급하는 역할을 수행한다. 아울러, 암세포에 대한 항암제의 효능을 보다 정밀하게 평가하기 위하여, 상기 배양액 공급 챔버는 간세포를 배양하기 위한 배양용기로서 사용될 수도 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 배양액 회수 챔버는 상기 배양액 공급 챔버로부터 공급된 배양액이 배양액 채널을 통과한 후, 최종적으로 저장되는 부위로서, 세포 배양 후 오염된 배양액을 회수하는 역할을 수행하는데, 배양 후 세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등으로 오염된 배양액으로 인한 주변환경 오염을 방지하기 목적으로 사용된다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 배양액 채널은 배양액 공급 챔버로부터 배양액 회수 챔버로 배양액이 유통하는 배양액의 메인 유로로서의 역할을 수행하는데, 상기 역-미세둑 구조를 통해 세포 챔버에 위치한 세포에 배양액을 공급하고, 세포 배양에 사용된 배양액을 회수하는 역할을 수행한다. 본 발명에 있어서, 상기 배양액 채널은 생체 내에 존재하는 세포에 영양을 공급하기 위한 모세혈관을 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 배양액 채널의 폭은 모세혈관의 기능을 모사할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 40㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 35㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 30㎛의 폭을 가질 수 있다.
아울러, 상기 배양액 채널의 내부에 혈관내피세포를 배양하여, 보다 생체환경과 유사한 형태로 생체조직칩을 제조할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 세포 유입구는 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는데, 예를 들어, 세포 혼합물이 로딩된 세포 유입구에 주사기의 노즐이 연결될 수 있는 구조를 갖도록 구성될 수 있다. 상기 세포 혼합물은 세포와 상기 세포의 유통과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 생체조직칩은 이에 포함된 세포 챔버 내부에 정렬되어 고정된 형태로 존재하는 세포를 포함하게 되는데, 상기 세포 챔버 내부에 세포를 주입하고, 주입된 세포가 상기 세포 챔버 내부에 고정되기 위해서는 이를 보조하는 보조성분을 필요로 한다. 상기 보조성분은 세포 주변의 미세환경에 존재하는 세포외기질(ECM)을 모방한 것으로서, 세포의 3차원 세포배양에 필수적이며, 배양된 세포의 구조 및 기능이 생체 내의 것과 유사하도록 유지하는 역할을 수행할 수 있다. 상기 보조성분은 세포의 유입과 고정을 보조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 하이드로젤을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 콜라겐 하이드로젤, 알지네이트 하이드로젤, 젤마(GelMa) 하이드로젤 등을 사용할 수 있다. 상기 하이드로젤은 세포와 혼합되어, 세포의 3차원 배양을 보조하고, 추가적으로 상기 세포에 유동성을 부여하여, 상기 세포가 세포 유입구로부터 세포 챔버로 이동할 수 있게 한다. 뿐만 아니라, 상기 하이드로젤은 다양한 조건에 의해 경화될 수 있는데, 예를 들어, 콜라겐 하이드로젤은 인큐베이터 내에 1시간 이상 두어 온도상승을 유도하여 경화시킬 수 있고, 알지네이트 하이드로젤은 배양액 채널에 배지를 대체하여 CaCl2 용액을 주입하여 경화시킬 수 있으며, 젤마 하이드로젤은 자외선을 조사하여 경화시킬 수 있다. 상기 세포 혼합물이 세포 챔버로 이동한 후, 이에 포함된 하이드로젤이 경화되면, 상기 경화된 하이드로젤 내에 포함된 세포가 자연스럽게 고정될 수 있는데, 하이드로젤의 내재적인 다공성 특징으로 인하여, 하이드로젤을 통해 외부의 배양액이 세포에 전달될 수 있어, 고정된 세포의 배양을 보조할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 세포 챔버는 상술한 바와 같이, 세포 유입구를 통해 공급된 세포 혼합물이 저장 및 고정될 뿐만 아니라, 고정된 세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 챔버는 생체내 존재하는 세포의 미세구조를 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 세포 챔버의 폭은 세포의 고정 및 배양을 수행할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 2000㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 100 내지 1000㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 600㎛의 폭을 가질 수 있다.
상기 세포 챔버는 세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 연통된 통로의 형태가 될 수 있는데, 상기 잔류물 유출구와 연통된 부위에는 내부에 역-미세둑 구조가 구비되어 있고, 이에 따라, 세포 유입구를 통해 공급된 세포 혼합물에 포함된 세포가 잔류물 유출구로 이동되지 않고, 세포 챔버 내에 잔류하게 된다.
또한, 상기 세포 챔버에 주입될 수 있는 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 다양한 종류의 고형암세포, 심근세포, 평활근 세포, 횡문근 세포, 신장세포, 간세포, 상피세포, 신경세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 뼈세포, 두피세포, 비장세포, 폐세포, 구강세포, 피부세포, 모낭세포, 뇌세포, 척수세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포가 될 수 있고, 다른 예로서, 유방암 세포, 자궁경부암 세포, 간암세포 등의 고형암 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 포함된 잔류물 유출구는 세포 챔버에 고정된 세포를 배양하면서 상기 세포로부터 생성된 대사산물 또는 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있다. 이처럼 오염물을 배출하는 역할은 잔류물 유출구 뿐만 아니라 세포 유입구도 함께 수행할 수 있다. 즉, 세포를 세포 챔버에 유입하는 역할이 종료된 세포 유입구는 세포 챔버에 고정된 세포를 배양하면서 생성되는 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수도 있다.
상기 잔류물 유출구의 형상은, 앞서 설명한 배양액 회수 챔버와 마찬가지로, 세포 혼합물에 포함된 세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 오염물로 인한 세포 주변환경의 오염을 방지하기 위하여 튜브 또는 주사기의 노즐이 결합될 수 있는 형태로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩은 적어도 하나의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 기본적으로 포함하지만, 상기 생체조직칩을 사용하는 목적에 따라, 다수의 배양액 공급부와 세포 공급부를 포함할 수도 있다.
예를 들어, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하거나, 하나의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하거나, 또는 복수개의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함할 수 있다. 특히, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하는 경우, 일 예로서, 세포공급부를 중심으로 양쪽에 각각의 배양액 공급부가 구비된 형태가 될 수 있는데, 이 경우, 상기 역-미세둑 구조는 복수개의 배양액 채널과 하나의 세포 챔버사이에 형성되고, 각 배양액 채널간의 간섭을 배제하기 위하여, 각 배양액 채널은 인접하지 않도록 구성되거나 또는 인접하더라도 상호 완전 격리되도록 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 생체조직칩은 두 개의 배양액 공급 챔버; 두 개의 배양액 회수 챔버; 두 개의 배양액 채널; 한 개의 세포 유입구; 한 개의 잔류물 유출구; 상기 배양액 채널과 연접한 한 개의 세포 챔버; 및 세포 챔버와 배양액 채널의 연접부 및 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조가 포함된 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 목적하는 세포를 배양하게 되면, 약 7일 이내에 세포배양이 종료되고, 배양된 세포의 특징을 연구할 수 있다. 예시적으로, 유방암 세포를 배양할 경우 세포배양이 완료된 시점에서 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 유방암 세포의 세포 사멸이 발생할 수 있다. 다른 예로서, 자궁경부암세포를 배양할 경우, 세포배양이 완료된 시점에서 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 자궁경부암 세포의 세포 사멸이 발생할 수 있다. 또 다른 예로서, 간암세포를 배양할 경우, 세포배양이 완료된 시점에서 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 간암 세포의 세포 사멸이 발생할 수 있다.
이하, 본 발명의 도 1 내지 도 5를 참조하여, 본 발명에서 제공하는 생체조직칩의 구조를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 제공하는 생체조직칩(2)은 슬라이드 글라스(1)위에 구비된 구조물의 형태로서, 세포 유입구(5), 잔류물 유출구(6) 및 세포 챔버(8)로 구성된 심근세포 공급부를 중심으로, 배양액 공급 챔버(3), 배양액 회수 챔버(4) 및 배양액 채널(7)로 구성된 두 세트의 배양액 공급부가 각각 양쪽에 구비된 형태이다. 상기 세포 챔버(8)와 배양액 채널(7)은 이들의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조(9)에 의해 각각 구별되고, 상기 세포 챔버(8)와 잔류물 유출구(6)의 연접부에도 역-미세둑 구조(10)가 구비되어 있다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태는 상기 생체조직칩을 이용하여, 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 하나의 방법은 (a) 상기 생체조직칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 생체조직칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 세포의 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 배양된 세포의 손상여부, 성장여부, 분비성분의 변화여부, 유전자 발현수준의 변화여부, 단백질 수준의 변화여부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 세포의 변화는 배양된 암세포의 경우 배양된 암세포의 사멸 여부가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 다른 방법은 (a) 상기 생체조직칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계; (b) 상기 생체조직칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (d) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 배양되는 세포로 유방암 세포(MCF-7)를 사용할 경우, 배양 후 약 1일이 경과된 시점에서 유방암 세포의 부착이 확인되었고, 상기 부착된 유방암 세포가 안정화 된 시점에서 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 유방암 세포의 세포 사멸이 발생할 수 있다.
따라서, 상기 유방암 세포의 세포 사멸정도를 확인하여, 목적하는 약물이 유방암 세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 배양되는 세포로 자궁경부암 세포(HeLa)를 사용할 경우, 배양 후 약 1일이 경과된 시점에서 자궁경부암 세포의 부착이 확인되었고, 상기 부착된 자궁경부암 세포가 안정화 된 시점에서 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 자궁경부암 세포의 세포 사멸이 발생할 수 있다.
따라서, 상기 자궁경부암 세포의 세포 사멸정도를 확인하여, 상기 목적하는 약물이 자궁경부암 세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 배양되는 세포로 간암 세포(HepG2)를 사용할 경우, 배양 후 약 1일이 경과된 시점에서 간암 세포의 부착이 확인되었고, 상기 부착된 간암 세포가 안정화 된 시점에서 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 간암 세포의 세포 사멸이 발생할 수 있다.
따라서, 상기 간암 세포의 세포 사멸정도를 확인하여, 상기 목적하는 약물이 간암 세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 역-미세둑 구조 생체조직칩의 제작
본 발명의 생체조직칩은 PDMS(polydimethylsiloxane)탄성중합체와 슬라이드글라스 (slide glass)를 이용하여 제작하였다.
감광액 패터닝(PR patterning)이 완료된 주형(mold) 위에 PDMS 실리콘계 엘라스토머(silicone base elastomer)와 경화제(curing agent, SYLGARD 184 silicone elastomer kit, Dow Corning)의 비율을 10:1로 섞은 후 플라즈마 처리기(plasma processing system, CUTE, FEMTO Science)의 진공 시스템을 이용하여 믹싱 시 발생하는 기포를 제거하였다. 이후 SU-8 주형 위에 상기 혼합물을 부은뒤 80℃의 열판 위에서 10시간 동안 열처리를 가해 고형화 하였다. 이를 주형으로부터 분리해 낸 후, 칩의 적정 크기에 따라 자른 후 원통형 1.2mm 및 8mm 직경의 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 세포 및 하이드로젤 혼합물 유입구 및 유출구와 배지 저장 및 유입구 및 유출구를 각각의 크기에 맞게 펀치아웃(punch out)하여 미세유체소자를 제작하였다.
상기 제작된 미세유체소자를 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)이 담겨있는 초음파 발생 장치(sonicator)에 PDMS 기반 미세유체소자를 담가 초음파 처리(sonication)를 수행하여 세척한 후, 에어건(air-gun)으로 완전히 건조시켰다.
세척이 완료 된 PDMS기반 미세유체소자와 슬라이드글라스는 80℃ 드라이 오븐(dry oven) 내에서 10분 동안 건조시킨 뒤 30분 동안 자외선에 노출시켜 멸균시켰다. 최종적으로, PDMS 기반 미세유체소자와 슬라이드 글라스를 플라즈마 처리기에 넣고 산소 플라즈마 처리(oxygen plasma treatment)를 통해 접착시켜 생체조직칩을 제작하였다. 제작된 생체조직칩을 35mm 페트리 디쉬(petri dish)에 넣고, 플라즈마 처리에 의한 접착력을 단단하게 하기 위해 80℃로 가열된 핫플레이트(hot plate) 위에서 30분 동안 열을 가하였다.
상기와 같이 제작된 생체조직칩의 전체 크기는 가로 2.7cm, 세로 2cm 이며 칩 내 모든 채널 미세구조의 높이는 50㎛ 이며, 역 미세 둑 구조 이외의 높이는 5㎛이다. 세포 채널의 폭 사이즈는 600㎛로, 이는 생체 내 심근다발의 직경인 약 200㎛의 3배 정도의 크기이다.
배양액 채널의 폭은 30㎛이며, 이는 생체 내 모세혈관의 직경인 약 10㎛의 3배 정도로, 세포 채널을 중심으로 양쪽 최외각에 배치함으로써 생체내 심근섬유들의 사이사이에 위치하고 있는 모세혈관망을 모방하고자 디자인 하였다.
세포 채널의 잔류물 유출구 방향에 위치한 역-미세둑 구조는 세포 채널의 폭이 좁아지는 직전 부분에 두께 60㎛으로 유출구 방향으로 호 형태로 위치하여 주입되는 세포-하이드로젤 혼합물이 잔류물 유출구 쪽으로 빠져나가지 않고 누적되게끔 유도하기 위한 디자인하였으며, 원활한 주입과 주입 시 발생하는 압력만은 잔류물 유출구 쪽으로 빠져나갈 수 있게 하였다. 또한, 세포 채널과 배양액 채널의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 두께 100μm의 직사각형 형태로 디자인하였으며, 마찬가지로 세포-하이드로젤 혼합물이 세포 채널의 바깥으로 빠져나가지 않고 누적되게끔 디자인하였다. 세포 채널과 연결되어 있는 각 유입구(inlet)와 유출구(outlet)의 지름은 1.5mm 이며, 배양액 공급챔버 및 회수챔버에 연결된 배양액 채널의 지름은 8mm으로 설정하였다.
실시예 2: 생체조직칩의 기능 평가
실시예 2-1: 유방암 세포가 포함된 생체조직칩
실시예 2-1-1: 유방암 세포가 포함된 생체조직칩의 제작
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 생체조직칩에 포함된 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕의 배양액(10% FBS (Fetal bovine serum, gibco)를 보충한 RPMI 1640 (Gibco))을 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 챔버간에 배양액의 흐름이 연결되도록 한 다음, 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 배양액을 채워 최종적으로 배지 흐름을 만들어주었다. 이때, 역-미세둑 구조를 경계로 배양액 채널과 세포 챔버 사이에 표면장력에 의해 배지가 경계를 이루는 것을 확인하였다.
그런 다음, 파이펫을 이용하여 유방암 세포(Michigan Cancer Foundation-7, MCF-7)를, 3 × 104개의 세포 수만큼 세포 유입구에 주입하고, 파이펫팅을 수행하여 주입된 유방암 세포를 세포 챔버에 주입하였다. 이후, 역-미세둑 구조에 의해 유방암세포가 유실되지 않고 경계를 이루는 것을 확인함으로써, 유방암세포와 배양액이 각각 성공적으로 분리 주입되었음을 확인한 후, 37℃ 및 5% CO2에서 조건의 가습한 인큐베이터에 2일 동안 배양하였다.
실시예 2-1-2: 유방암 세포가 포함된 생체조직칩의 기능 평가
상기 실시예 2-1-1에서 제작한 유방암 세포가 포함된 생체조직칩의 배양액 공급 챔버에 100μM의 독소루비신(doxorubicin, TOCRIS)을 가하고, 상기 독소루비신에 의한 생체조직칩 내 유방암 세포의 변화를 광학현미경으로 관찰하고, 유방암 세포의 손상정도를 대조군과 비교 분석하였다(도 6). 이때, 대조군으로는 독소루비신을 처리하지 않은 유방암 세포가 포함된 생체조직칩을 사용하였다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 유방암 세포(MCF-7)를 주입하고, 2일 동안 배양한 다음, 항암제인 독소루비신을 처리하여, 유방암 세포의 손상정도를 대조군과 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
상기 도 6에서 보듯이, 독소루비신을 처리하고 24시간이 경과한 후, 생체조직칩 내 배양된 유방암 세포가 대부분 사멸한 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해 대조군은 24시간이 경과한 후에도, 세포 사멸 없이 정상적으로 배양이 이루어짐을 확인할 수 있었다.
따라서, 유방암 세포가 포함된 생체조직칩을 이용하면, 유방암 세포에 대한 독소루비신의 항암활성을 효과적으로 검증할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩
실시예 2-2-1: 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩의 제작
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 생체조직칩에 포함된 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕의 배양액(10% FBS를 보충한 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, gibco))을 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 챔버간에 배양액의 흐름이 연결되도록 한 다음, 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 배양액을 채워 최종적으로 배지 흐름을 만들어주었다. 이때, 역-미세둑 구조를 경계로 배양액 채널과 세포 챔버 사이에 표면장력에 의해 배지가 경계를 이루는 것을 확인하였다.
그런 다음, 파이펫을 이용하여 자궁경부암 세포(HeLa)를, 3 × 104개의 세포 수만큼 세포 유입구에 주입하고, 파이펫팅을 수행하여 주입된 자궁경부암 세포(HeLa)를 세포 챔버에 주입하였다. 이후, 역-미세둑 구조에 의해 자궁경부암 세포(HeLa)가 유실되지 않고 경계를 이루는 것을 확인함으로써, 자궁경부암 세포(HeLa)와 배양액이 각각 성공적으로 분리 주입되었음을 확인한 후, 37℃ 및 5% CO2에서 조건의 가습한 인큐베이터에 2일 동안 배양하였다.
실시예 2-2-2: 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩의 기능 평가
상기 실시예 2-2-1에서 제작한 자궁경부암 세포(HeLa)가 포함된 생체조직칩의 배양액 공급 챔버에 100μM의 독소루비신을 가하고, 상기 독소루비신에 의한 생체조직칩 내 자궁경부암 세포의 변화를 광학현미경으로 관찰하고, 자궁경부암 세포의 손상정도를 대조군과 비교 분석하였다(도 7). 이때, 대조군으로는 독소루비신을 처리하지 않은 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩을 사용하였다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 자궁경부암 세포(HeLa)를 주입하고, 2일 동안 배양한 다음, 항암제인 독소루비신을 처리하여, 자궁경부암 세포의 손상정도를 대조군과 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
상기 도 7에서 보듯이, 독소루비신을 처리하고 24시간이 경과한 후, 생체조직칩 내 배양된 자궁경부암 세포가 대부분 사멸한 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해 대조군은 24시간이 경과한 후에도, 세포 사멸 없이 정상적으로 배양이 이루어짐을 확인할 수 있었다.
따라서, 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩을 이용하면, 자궁경부암 세포에 대한 독소루비신의 항암활성을 효과적으로 검증할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 간암 세포가 포함된 생체조직칩
실시예 2-3-1: 간암 세포가 포함된 생체조직칩의 제작
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 생체조직칩에 포함된 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕의 배양액(25 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, gibco), 25 mM NaHCO3 (Sodium bicarbonate, Sigma-aldrich), 10% (v/v) FBS, P/S (100Uml-1penicillin/100Uml-1streptomycin, Sigma-Aldrich Co.,MO)를 보충한 MEM (Minimum Essential Media Eagle, high-glucose, gibco))을 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 챔버간에 배양액의 흐름이 연결되도록 한 다음, 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 배양액을 채워 최종적으로 배지 흐름을 만들어주었다. 이때, 역-미세둑 구조를 경계로 배양액 채널과 세포 챔버 사이에 표면장력에 의해 배지가 경계를 이루는 것을 확인하였다.
그런 다음, 파이펫을 이용하여 간암 세포(HepG2)를, 3 × 104개의 세포 수만큼 세포 유입구에 주입하고, 파이펫팅을 수행하여 주입된 간암 세포(HepG2)를 세포 챔버에 주입하였다. 이후, 역-미세둑 구조에 의해 간암 세포(HepG2)가 유실되지 않고 경계를 이루는 것을 확인함으로써, 간암 세포(HepG2)와 배양액이 각각 성공적으로 분리 주입되었음을 확인한 후, 37℃ 및 5% CO2에서 조건의 가습한 인큐베이터에 2일 동안 배양하였다.
실시예 2-3-2: 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩의 기능 평가
상기 실시예 2-3-1에서 제작한 간암 세포(HepG2)가 포함된 생체조직칩의 배양액 공급 챔버에 100μM의 독소루비신을 가하고, 상기 독소루비신에 의한 생체조직칩 내 간암 세포의 변화를 광학현미경으로 관찰하고, 간암 세포의 손상정도를 대조군과 비교 분석하였다(도 8). 이때, 대조군으로는 독소루비신을 처리하지 않은 자궁경부암 세포가 포함된 생체조직칩을 사용하였다.
도 8은 본 발명에서 제공하는 생체조직칩에 간암 세포(HepG2)를 주입하고, 2일 동안 배양한 다음, 항암제인 독소루비신을 처리하여, 간암 세포의 손상정도를 대조군과 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
상기 도 8에서 보듯이, 독소루비신을 처리하고 24시간이 경과한 후, 생체조직칩 내 배양된 간암 세포가 대부분 사멸한 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해 대조군은 24시간이 경과한 후에도, 세포 사멸 없이 정상적으로 배양이 이루어짐을 확인할 수 있었다.
따라서, 간암 세포가 포함된 생체조직칩을 이용하면, 간암 세포에 대한 독소루비신의 항암활성을 효과적으로 검증할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 실시예 2-1 내지 2-3의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 생체조직칩은 유방암, 자궁경부암, 간암 등의 다양한 고형암을 생체내 조건과 유사한 조건으로 배양함으로써, 항암제의 활성을 효과적으로 검증할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
부호의 설명
1 : PDMS 기반 미세유체 소자
2 : 슬라이드 글라스
3 : 배양액 공급챔버
4 : 배양액 회수챔버
5 : 심근세포 유입구
6 : 잔류물 유출구
7 : 배양액 채널
8 : 세포 챔버
9 : 세포 챔버와 배양액 채널의 연접부에 위치한 역-미세둑 구조
10 : 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 위치한 역-미세둑 구조

Claims (30)

  1. (a) 배양액 공급 챔버; 배양액 회수 챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부;
    (b) 일 측단에 구비된 세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 잔류물 유출구; 및, 상기 세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 구비되고, 상기 배양액 채널과 연접하여 동일한 방향으로 연장된 세포 챔버;를 포함하는 세포 공급부; 및
    (c) 상기 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부, 상기 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 부위에 구비된 역-미세둑 구조를 포함하는, 생체조직칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 역-미세둑 구조는 그의 상단이 연접부의 상단과 결합되고, 하단이 연접부의 바닥과 이격되도록 구비되어, 상기 이격된 부위를 통해 세포 또는 경화된 세포는 통과하지 못하고, 액상성분은 통과할 수 있도록 구성되는 것인, 생체조직칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 이격된 부위의 간격은 5 내지 20 ㎛인 것인, 생체조직칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 역-미세둑 구조의 단면은 직방형 또는 호의 형태인 것인, 생체조직칩.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 연접부를 따라 동일한 방향으로 연장되도록 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 배양액 채널과 세포 챔버간에 배양액의 상호유통을 허용하도록 구성되는 것인, 생체조직칩.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 잔류물 유출구 방향으로 굽어진 호의 형태로 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 세포 챔버로부터 잔류물 유출구로의 잔류물 배출을 허용하도록 구성되는 것인, 생체조직칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 공급 챔버는 배양액 채널 및 역-미세둑 구조를 통해 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 배양용 배양액을 저장하는 것인, 생체조직칩.
  8. 제1항에 있어서,
    약물의 효능 및 독성 평가를 위하여, 상기 배양액 공급 챔버에서 간세포를 추가로 배양하는 것인, 생체조직칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널은 상기 배양액 공급 챔버로부터 배양액 회수 챔버로 배양액이 유통하는 경로인 것인, 생체조직칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널의 폭은 20 내지 40㎛인 것인, 생체조직칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포 유입구는 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는 것인, 생체조직칩.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포 혼합물은 세포 및 세포의 유통과 고정을 보조하는 하이드로젤을 포함하는 것인, 생체조직칩.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 세포 챔버는 세포 유입구를 통해 공급된 세포 혼합물에 포함된 세포가 정렬하여 고정되고, 고정된 세포를 배양하는 배양용기로서의 역할을 수행하는 것인, 생체조직칩.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 세포의 고정은 세포 혼합물에 포함된 하이드로젤의 경화에 의해 수행되는 것인, 생체조직칩.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 세포의 배양은 역-미세둑 구조의 하단부와 연접부의 바닥 사이에 형성된 이격부위를 통해 배양액 채널로부터 공급된 배양액이 세포 챔버에 고정된 세포에 공급되어 수행되는 것인, 생체조직칩.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 배양의 대상이 되는 세포는, 암세포, 심근세포, 평활근 세포, 횡문근 세포, 신장세포, 간세포, 상피세포, 신경세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 뼈세포, 두피세포, 비장세포, 폐세포, 구강세포, 피부세포, 모낭세포, 뇌세포, 척수세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포인 것인, 생체조직칩.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 배양의 대상이 되는 암세포는, 유방암 세포, 자궁경부암 세포 또는 간암 세포인 것인, 생체조직칩.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 세포 챔버의 폭은 20 내지 2000㎛인 것인, 생체조직칩.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 잔류물 유출구는 세포 챔버에 고정된 세포를 배양하면서 상기 세포로부터 생성된 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행하는 것인, 생체조직칩.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직칩은 하나의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하는 것인, 생체조직칩.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직칩은 복수개의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하는 것인, 생체조직칩.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 배양액 공급부는 세포 공급부를 중심으로 양쪽으로 정렬된 것인, 생체조직칩.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직칩은 하나의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하는 것인, 생체조직칩.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직칩은 복수개의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하는 것인, 생체조직칩.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직칩은 두 개의 배양액 공급 챔버(3); 두 개의 배양액 회수 챔버(4); 두 개의 배양액 채널(7); 한 개의 세포 유입구(5); 한 개의 잔류물 유출구(6); 상기 배양액 채널과 연접한 한 개의 세포 챔버(8); 및, 세포 챔버와 배양액 채널의 연접부 및 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조(9, 10)를 포함하는 것인, 생체조직칩.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 두 개의 배양액 채널(7)은 세포 챔버(8)를 중심으로 양쪽으로 정렬된 것인, 생체조직칩.
  27. (a) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 생체조직칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 생체조직칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 세포의 변화는 배양된 세포의 손상여부, 성장여부, 분비성분의 변화여부, 유전자 발현수준의 변화여부, 단백질 수준의 변화여부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 세포는 암세포이고, 상기 암세포의 변화는 배양된 세포의 손상여부인 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 암세포는 유방암 세포, 자궁경부암 세포 또는 간암 세포인 것인, 방법.
PCT/KR2023/000715 2022-01-14 2023-01-16 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도 WO2023136683A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2022-0006035 2022-01-14
KR20220006035 2022-01-14
KR20220011109 2022-01-26
KR10-2022-0011109 2022-01-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023136683A1 true WO2023136683A1 (ko) 2023-07-20

Family

ID=87279469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/000715 WO2023136683A1 (ko) 2022-01-14 2023-01-16 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20230110153A (ko)
WO (1) WO2023136683A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090221073A1 (en) * 2005-10-07 2009-09-03 Mehmet Toner Devices and methods for cell manipulation
US20160327470A1 (en) * 2007-02-08 2016-11-10 Emd Millipore Corporation Microfluidic Particle Analysis Method, Device And System
KR102157266B1 (ko) * 2019-11-22 2020-09-18 차의과학대학교 산학협력단 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도
WO2021013066A1 (zh) * 2019-07-23 2021-01-28 北京大学 一种适用于循环肿瘤细胞捕获的微流控芯片
KR20210024342A (ko) * 2019-08-22 2021-03-05 차의과학대학교 산학협력단 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090221073A1 (en) * 2005-10-07 2009-09-03 Mehmet Toner Devices and methods for cell manipulation
US20160327470A1 (en) * 2007-02-08 2016-11-10 Emd Millipore Corporation Microfluidic Particle Analysis Method, Device And System
WO2021013066A1 (zh) * 2019-07-23 2021-01-28 北京大学 一种适用于循环肿瘤细胞捕获的微流控芯片
KR20210024342A (ko) * 2019-08-22 2021-03-05 차의과학대학교 산학협력단 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
KR102157266B1 (ko) * 2019-11-22 2020-09-18 차의과학대학교 산학협력단 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230110153A (ko) 2023-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11859165B2 (en) Open-top microfluidic device with structural anchors
WO2021101313A1 (ko) 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도
WO2021034107A1 (ko) 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
Li et al. Micropatterned cell–cell interactions enable functional encapsulation of primary hepatocytes in hydrogel microtissues
EP2183353B1 (en) Culture system and method for immunogenicity and immunofunction testing in vitro
JP5676436B2 (ja) 流動導管の調査用デバイス
Lee et al. Liver microsystems in vitro for drug response
WO2023136683A1 (ko) 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도
US20230011800A1 (en) Biomimetic nerve chip for evaluating efficacy and toxicity on nerve, and use thereof
Raut et al. In vitro models of the blood–brain barrier
WO2024025177A1 (ko) 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도
EP4349957A1 (en) Non-alcoholic fatty liver artificial tissue model
WO2021029567A1 (ko) 바이오 접착제가 전처리된 3차원 세포 조직체의 배양 및 테스트 장치
WO2021162530A1 (ko) 심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법
WO2023195689A1 (ko) 장기 모사 칩 구조체 제조방법
WO2023239048A1 (ko) 암 미세환경 모사 췌장암 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도
KR20230110031A (ko) 콜라겐층이 구비된 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도
WO2022108315A1 (ko) 신장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 신장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법
WO2023195687A1 (ko) 장기 모사 칩
Licciardello et al. A miniaturized multicellular platform to mimic the 3D structure of the alveolar-capillary barrier
WO2023003254A1 (ko) 노화 피부 모델 및 그 제작 방법
WO2022265352A1 (ko) 다중 장기 모델
KR20240014423A (ko) 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도
Kamiya et al. Culture system of bile duct-like cystic structures derived from human-inducible pluripotent stem cells
WO2022220562A1 (ko) 세뇨관 배양부 및 간질 배양부를 포함하는 신장 모사 장기 칩

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23740526

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1