CN104099248B - 细胞培养微沟道中注入溶液的方法以及贴壁细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞培养微沟道中注入溶液的方法以及贴壁细胞培养方法。细胞培养沟道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体；以及微沟道本体左右两侧的与外界相连通的液滴入口。该细胞培养微沟道中注入溶液的方法包括：用两支移液枪吸取不同量的溶液，分别对准两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入溶液，在两侧液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微沟道本体内。本发明基于重力作用实现贴壁细胞的片上接种、培养和染色，只需要移液枪作为接种工具，更容易为广大细胞生物学实验室所接受。

Description

细胞培养微沟道中注入溶液的方法以及贴壁细胞培养方法
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种细胞培养微沟道中注入溶液的方法以及贴壁细胞培养方法。
背景技术
心血管疾病(cardiovasculardisease，CVD)严重危害人类健康和生命，全世界每年约有1670万人死于CVD，占全球死亡率第一位，而动脉粥样硬化是CVD的重要病理基础。在动脉粥样硬化形成过程中，血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells，VSMC)的增殖并向内膜迁移和合成细胞外基质则是“祸首”之一。因此研究VSMC细胞的致病机制是十分重要的。
在VSMC细胞的机制研究中，细胞培养是基本实验模型，通过一个能模拟体内环境的体外空间，配置以无菌、适当温度、酸碱度和一定营养条件培养细胞，使之生长繁殖并维持其结构和功能。其目标就是在体外尽可能地控制细胞外微环境的一致又能保持实验的简单可重复性，进而提供大量细胞层面和分子层面的信息。因此VSMC细胞体外培养的研究是十分必要的。
VSMC细胞的体外培养始于20世纪70年代，由Ross和Campbell采用贴块法获得成功。现阶段VSMC细胞的体外培养技术，仍停留在传统的开放的瓶皿或孔板形式。
微流控技术是本世纪一项重要的科学技术，由于其通道尺寸与哺乳类细胞线性尺寸相比拟，多维网络结构与生理状态下细胞的空间特征相接近，已被广泛用于细胞生物学研究。在芯片上，一般用外围的泵和连接导管对微尺度的流体进行操作和控制，使灌注系统中产生稳定的流场以满足营养物质的传输和废物的排泄。
在实现本发明的过程中，申请人发现现有技术VSMC细胞培养方法存在如下技术缺陷：
(1)现有的微流控细胞培养技术，导管要与注射泵相连实现流量的控制，使得许多不具有注射泵实验条件的实验室在操作技术上形成阻碍；
(2)现有的体外培养VSMC细胞环境，相对于体内血管壁的微小尺寸和营养物质的代谢形式，差异十分明显，客观上难以真实反映生理状态VSMC细胞的生物学特征。因此需要能更好地模拟活体血管壁微环境的细胞培养装置；
(3)现有的微流控细胞培养技术，需要连接导管进行细胞接种，存在细胞吸附导管壁，导致细胞接种不均匀；导管的存在有扰动、漏液等问题，导致细胞所处微环境不稳定，实验一致性较差。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题，本发明提供了一种细胞培养微沟道中注入溶液的方法以及贴壁细胞培养方法。
(二)技术方案
根据本发明的一个方面，提供了一种细胞培养微沟道中注入溶液的方法。该细胞培养沟道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体；以及微沟道本体左右两侧的与外界相连通的液滴入口。该细胞培养微沟道中注入溶液的方法包括：步骤B：用两支移液枪吸取不同量的溶液，分别对准两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入溶液，在两侧液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微沟道本体内。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种贴壁细胞培养方法。该贴壁细胞培养方法包括：步骤A：提供包括若干条细胞培养微沟道的微流控芯片，其中，每一条细胞培养微沟道包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体以及微沟道本体两侧的液滴入口；步骤B：对细胞培养微沟道进行表面修饰，以便于贴壁细胞的接种；步骤C：将吸壁细胞悬液用培养液调整至预设浓度，用两支移液枪吸取不同量的吸壁细胞悬液，分别对准左右两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入吸壁细胞悬液，在两侧液面差的作用下，吸壁细胞悬液依靠重力作用流入微沟道本体内；以及步骤D：在细胞培养微沟道内对吸壁细胞进行培养，每间隔预设时间，用移液枪吸出每个液滴入口处的培养液，并用两支移液枪在两端的液滴入口同时滴入新鲜的培养液。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明细胞培养微沟道中注入溶液的方法以及贴壁细胞培养方法具有以下有益效果：
(1)与已经报道需要的注射泵的微流控细胞培养方法相比，基于重力作用实现VSMC细胞的片上接种、培养和染色，只需要移液枪作为接种工具，更容易为广大细胞生物学实验室所接受；
(2)将微流控技术与传统VSMC细胞的培养技术相结合，在微流控技术中实现衬底修饰、VSMC细胞的均匀片上培养和VSMC细胞染色，为VSMC细胞体外培养提供更接近生理环境的方法；
(3)与已经报道需要的导管的微流控细胞培养方法相比，基于重力作用实现细胞的片上接种与培养，由于没有导管的扰动以及细胞吸附导管壁等问题，可以实现接种密度可控的微流控片上培养。
附图说明
图1为根据本发明实施例基于微流控技术的VSMC细胞培养方法的流程图；
图2为图1所示VSMC细胞培养方法中微流控芯片的示意图；
图3为微流控芯片制作的流程图；
图4为微流控芯片制作过程中器件的剖视图；
图5为在细胞培养微沟道中形成修饰层的示意图；
图6为细胞培养微沟道内细胞的分布情况；
图7为细胞培养微沟道内细胞的分布情况的统计分布；
图8为对细胞培养微沟道内细胞进行染色前后的细胞状态显微图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向。因此，使用的方向用语是用来说明并非用来限制本发明的保护范围。
本发明将微流控芯片技术与VSMC细胞的培养技术结合，在VSMC细胞体外微环境的重建上实现更好的模拟VSMC细胞体内生长的微环境。本发明还完全使用重力法完成片上培养VSMC细胞的过程。所谓重力法，就是在本发明中，使用移液枪直接向芯片滴入试剂，并且依靠重力作用使试剂流入细胞培养微沟道，也同样使用移液枪取出废液。
一、第一实施例
在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种细胞培养微沟道中注入溶液的方法。
该细胞培养沟道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体；以及微沟道本体左右两侧的与外界相连通的液滴入口
本实施例中，细胞培养微沟道中注入溶液的方法包括：
步骤S102：用一支移液枪吸取浸润缓冲液，对准微沟道本体一侧的液滴入口，向细胞培养微沟道内注入，是细胞培养微沟道完全被该浸润缓冲液浸润，而后静置预设时间，以提高细胞培养微沟道的亲水性；
本步骤中，浸润缓冲液为磷酸盐缓冲液，预设时间至少为1小时。
步骤S104：用两支移液枪吸取不同量的溶液，分别对准微沟道本体左右两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入溶液，在两侧液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微沟道本体内。
本实施例中，其中一支移液枪吸取溶液的量为20μl，另外一支移液枪吸取溶液的量为10μl或15μl。需要说明的是，两支移液枪必须全部吸附溶液并向细胞培养沟道内注入，而不能只有一只移液枪吸取溶液。
本实施例与已经报道需要的注射泵的微流控细胞培养方法相比，基于重力作用实现VSMC细胞的片上接种、培养和染色，只需要移液枪作为接种工具，更容易为广大细胞生物学实验室所接受。此外，本实施例与已经报道需要的导管的微流控细胞培养方法相比，基于重力作用实现细胞的片上接种与培养，由于没有导管的扰动以及细胞吸附导管壁等问题，可以实现接种密度可控的微流控片上培养。
至此，本实施例细胞培养微沟道中注入溶液的方法介绍完毕。
二、第二实施例
在本发明的另一个示例性实施例中，提供了一种基于微流控技术的VSMC细胞培养方法。图1为根据本发明实施例基于微流控技术的VSMC细胞培养方法的流程图。请参照图1，本实施例微流控技术的VSMC细胞培养方法包括：
步骤S202：提供包括若干条细胞培养微沟道的微流控芯片，其中，每一条细胞培养微沟道包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体以及微沟道本体两侧的液滴入口；
图2为图1所示VSMC细胞培养方法中微流控芯片的示意图。其中，A为俯视图；B为纵剖面示意图。请参照图2，微流控芯片包括4个细胞培养微沟道。每个细胞培养微沟道的纵剖面呈U型结构。在细胞培养微沟道中，微沟道本体形成于微流控芯片中，呈为长方体形状，微沟道本体两端分别设置液滴入口，液滴入口为圆形。其中液滴入口的直径大于微沟道本体的宽度。其中，微沟道的长度为1cm，高度为100μm，宽度为800μm。液滴入口的直径是4mm，高度为2mm，其可以容纳约20μL的溶液。
其中，微流控芯片的制作流程包括SU8-5种子层的制作和SU8-2100阳模的制作，以及PDMS的浇注、翻模、打孔和与玻璃基底的键合，其流程图如图3：
子步骤S202a：光刻胶SU8-5制作种子层；
载玻片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀旋转涂敷一层SU-85，曝光形成种子层，见图4中A所示。
子步骤S202b：光刻胶SU8-2100制作阳模；
种子层上再均匀旋转涂敷一层SU8-2100，放上掩模版曝光，如图4中B所示；显影、坚膜得到细胞培养微沟道阳模，见图4中C所示。
子步骤S202c：PDMS的浇注、翻模、打孔与键合；
细胞培养微沟道阳模浇注聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)固化、翻模得到细胞培养微沟道的PDMS翻模，在细胞培养微沟道两端打孔后，键合PDMS翻模与载玻片，VSMC细胞培养芯片的制作，见图4中D、E、F所示。
步骤S204：对微流控芯片中细胞培养微沟道进行表面修饰，以便于后期VSMC细胞的接种；
该步骤S204具体包括：
子步骤S104a：对微流控芯片进行紫外光照射灭菌；
子步骤S204b：用移液枪对准细胞培养微沟道一侧的液滴入口，向其中注入磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)，使细胞培养微沟道完全浸润，而后静置至少1小时；
为了保证后续加入其他试剂时，试剂会依靠重力作用流入沟道，本实施例中，加入PBS后静置至少1小时，使细胞培养微沟道内亲水性能良好。
子步骤S204c：用移液枪将液滴入口处的PBS缓冲液吸出；
除液滴入口处的PBS缓冲液之外，微沟道本体内还会残存部分的PBS缓冲液。
子步骤S204d：用两支移液枪同时吸取含有修饰分子的溶液，左侧移液枪吸取20μl，右侧移液枪吸取10μl，分别对准细胞培养微沟道左右两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入溶液，如图5中A所示。
本实施例中，特意将左侧移液枪和右侧移液枪注入液体的量设计为不同。从而细胞培养微沟道两侧存在液面差，溶液会依靠重力作用流入细胞培养微沟道，直至两液滴入口液面平衡。
子步骤S204e：根据实验需要，静置一段时间，使溶液中的修饰分子沉降于细胞培养微沟道底面，形成修饰层，如图5中B所示；
静置时间需要根据修饰分子的类型和实验需要进行设计。在静置时间较长的情况下，该溶液会自动挥发。在静置时间较短的情况下，需要将该溶液吸出。而如果液滴入口处和微沟道本体内的溶液全部风干，则需要重新执行子步骤S204b和S204c。
子步骤S204f：用两支移液枪同时吸取杜尔伯科改良伊戈尔培养基(DulbeccoModifiedEagleMedium，DMEM)溶液，左侧移液枪吸取20μl，右侧移液枪吸取10μl，分别对准细胞培养微沟道左右两侧的液滴入口，同时打出溶液，静置至少1小时，而后吸出DMEM溶液。
该子步骤的目的是为后期VSMC细胞接种提供合适环境。
步骤S206：将VSMC细胞悬液调整浓度至106个/ml，用两支移液枪同时吸取VSMC细胞悬液，左侧20μl，右侧15μl，分别对准细胞培养微沟道左右两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入VSMC细胞悬液；
其中，VSMC细胞悬液为将VSMC细胞用DMEM溶液稀释后的悬液。
值得注意的是，细胞接种至细胞培养微沟道以后，将芯片原地静置约5min，待细胞培养微沟道内溶液稳定、细胞沉降，便可将芯片放于显微镜下观察记录接种的密度和均匀程度等情况。
本发明技术中，在细胞培养微沟道的一侧设置了位置标记，如图6所示，方形小标记的数量代表细胞培养微沟道位置的序号。这不是必要的，但在这里可以清楚地分析细胞培养微沟道内细胞的分布情况。图6中A、B、C依次为1号位置、5号位置和8号位置。本发明技术中，设计了8个位置，经过统计，位置1～8的细胞密度(细胞个数/mm2)依次为105.00±18.09；100.18±20.79；94.64±13.74；100.89±16.99；91.61±16.34；94.64±15.88；91.79±9.73；89.64±8.15；全部结果均值为96.00±16.30(统计中数据组数n≥3)。上述结果的柱状图见图7：
步骤S208：对VSMC细胞进行培养，每间隔12小时，就用移液枪吸出每个液滴入口处的DMEM，并用液滴在两端的液滴入口同时滴入20μl新鲜DMEM，为VSMC细胞提供必要的营养物质；
同时加入相同液量DMEM的目的是消除细胞培养微沟道两端液面差，保证细胞培养微沟道内没有液体流动，即VSMC细胞不会被流体剪切力作用而影响生长。培养72小时后，细胞状态显微图见图8中A。
步骤S210：对细胞培养微沟道内的VSMC细胞进行α肌动蛋白的细胞免疫染色，其染色步骤与参数包括：
染色子步骤S210a：4％多聚甲醛固定15min；
染色子步骤S210b：用PBS配置3％的过氧化氢封闭液，封闭15min；
染色子步骤S210c：用PBS配置0.3％的曲拉通X-100透膜液透膜15min；
染色子步骤S210d：用PBS配置10％山羊血清，37℃孵育60min；
染色子步骤S210e：一抗∶PBS＝i∶100，37℃孵育一抗60min；
染色子步骤S210f：37℃孵育二抗60min；
染色子步骤S210g：二氨基联苯胺四盐酸显色5min。
上述染色子步骤S110a-S110g，本实施例有以下两点关键说明：
其中，上述每一染色子步骤均依靠重力作用实现，每一染色子步骤换液时的方法为，先吸出液滴入口中所有溶液，再用左边移液枪吸取目标溶液20μl，右边移液枪吸取目标溶液10μl，同时滴入液滴入口。并且先加一次，允许溶液稳定2min，吸出液滴入口的溶液后再复加一次，其中染色子步骤S210e复加两次，保证一抗浓度不被稀释。
除染色子步骤S210e之外，其他每一染色子步骤进行之前均用PBS溶液冲洗。其中染色子步骤S210f之前冲洗3次，其余冲洗2次。冲洗方法是用说明1中所述换液方法，每次冲洗静置5min。
本发明技术染色情况在图8中B所示。免疫染色是细胞染色中较为复杂的染色方法，VSMC细胞在染色前和染色后形态上基本没有变化，因此，本发明技术可以用在有关VSMC细胞的其他很多种染色。
至此，已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明基于微流控技术的VSMC细胞培养方法有了清楚的认识。
此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：
(1)细胞培养微沟道不局限为矩形，可以替换为梯形、蛇形等双入口结构；液滴入口也不局限于圆形，可以替换为正方形、三角形等。
(2)细胞接种的密度不局限于106个/ml，可以用任意实验需求的细胞密度来代替。
(3)长时间VSMC细胞培养过程中，换液时间不局限于12小时，可以为实验需要的任意时间间隔。
(4)VSMC细胞的染色可以用其他任何实验需要的染色来代替α肌动蛋白的细胞免疫染色，如：钙黄绿素荧光染色、增殖细胞核抗原免疫染色等；
(5)上述实施例均以VSMC细胞为例进行说明，但本发明并不以此为限，任何贴壁细胞，均可以采用第二实施例方式进行培养，此处不再重述。
综上所述，本发明将微流控技术与传统贴壁细胞的培养技术相结合，在微流控技术中实现衬底修饰、VSMC的均匀片上培养和VSMC染色，为VSMC体外培养提供更接近生理环境的方法。尤其是，基于重力作用实现细胞的片上接种与培养，由于没有导管的扰动以及细胞吸附导管壁等问题，可以实现接种密度可控的微流控片上培养。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞培养微沟道中注入溶液的方法，其特征在于，所述细胞培养微沟道呈U型结构：
该细胞培养沟道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体；以及微沟道本体左右两侧的与外界相连通的液滴入口，液滴入口的直径大于微沟道本体的宽度；
该细胞培养微沟道中注入溶液的方法包括：
步骤B：用两支移液枪吸取不同量的溶液，分别对准两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入溶液，在两侧液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微沟道本体内。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微沟道本体的纵剖面为矩形，液滴入口的横切面为圆形。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B之前还包括：
步骤A：用一支移液枪吸取浸润缓冲液，对准微沟道本体一侧的液滴入口，向细胞培养微沟道内注入浸润缓冲液，使细胞培养微沟道完全被该浸润缓冲液浸润，而后静置预设时间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，所述浸润缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述预设时间至少为1小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B中，其中一支移液枪吸取溶液的量为20μl，另外一支移液枪吸取溶液的量为10μl或15μl。
6.一种贴壁细胞培养方法，其特征在于，基于微流控技术，包括：
步骤A：提供包括若干条细胞培养微沟道的微流控芯片，其中，每一条细胞培养微沟道包括：形成于微流控芯片内的微沟道本体以及微沟道本体两侧的液滴入口；
步骤B：对细胞培养微沟道进行表面修饰，以便于贴壁细胞的接种；
步骤C：将吸壁细胞悬液用培养液调整至预设浓度，用两支移液枪吸取不同量的吸壁细胞悬液，分别对准左右两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入吸壁细胞悬液，在两侧液面差的作用下，吸壁细胞悬液依靠重力作用流入微沟道本体内；以及
步骤D：在细胞培养微沟道内对吸壁细胞进行培养，每间隔预设时间，用移液枪吸出每个液滴入口处的培养液，并用两支移液枪在两端的液滴入口同时滴入新鲜的相同液量的培养液。
7.根据权利要求6所述的贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述步骤B包括：
子步骤B1：对微流控芯片进行紫外光照射灭菌；
子步骤B2：用移液枪对准细胞培养微沟道一侧的液滴入口，向其中注入磷酸盐缓冲液，使细胞培养微沟道完全浸润，而后静置至少1小时；
子步骤B3：用移液枪将液滴入口处的磷酸盐缓冲液吸出；
子步骤B4：用两支移液枪吸取不同量的含有修饰分子的溶液，分别对准两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入含有修饰分子的溶液；
子步骤B5：静置预设时间，使溶液中的修饰分子沉降于细胞培养微沟道底面，形成修饰层；以及
子步骤B6：用两支移液枪吸取不同量的培养液，分别对准细胞培养微沟道左右两侧的液滴入口，同时注入培养液，静置至少1小时，而后吸出培养液。
8.根据权利要求6所述的贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述贴壁细胞为VSMC细胞。
9.根据权利要求8所述的贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述步骤D之后还包括：
步骤E，对细胞培养微沟道内的VSMC细胞进行α肌动蛋白的细胞免疫染色。
10.根据权利要求9所述的贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述步骤E的染色步骤包括：
用移液枪分别吸出液滴入口中所有溶液；
用两支移液枪吸取不同量的目标溶液，分别对准细胞培养微沟道左右两侧的液滴入口，同时向细胞培养微沟道内注入目标溶液。
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A passive pumping method for microfluidic devices;Glenn M. Walker et al,;《 Lab Chip》;20020805;131-132 *
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