CN105420103A - 一种简易的微流控芯片及细胞分析方法 - Google Patents

一种简易的微流控芯片及细胞分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微流控芯片技术领域，具体地说是涉及一种用于细胞学分析的简易微流控芯片及细胞分析方法。所述的简易微流控芯片包括基底层和位于所述基底层上的细胞培养层，所述细胞培养层上设置有位于同一平面的储液池，所述细胞培养层上还设置有微通道，至少两个储液池的底部由微通道连通。利用该简易微流控芯片进行细胞培养，然后对微流控芯片微通道内培养的细胞进行细胞学分析，相对于现有微流控芯片，本发明的微流控芯片更易被普通生物学实验室采用加工和进行细胞培养及细胞分析的操作。

Description

一种简易的微流控芯片及细胞分析方法
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，具体地说是涉及一种用于细胞学分析的简易微流控芯片及细胞分析方法。
背景技术
细胞是生命体结构和生命活动单元，细胞增殖、分化、迁移和代谢等行为与胚胎发育、血管新生、组织修复、免疫防御、以及肿瘤发生等重要生理病理过程都密切相关，因此，对细胞的研究是现代生命科学研究的基础。
近年来，有报道将微流控芯片技术应用于细胞研究，给细胞研究提供了新的方法和平台。微流控芯片为细胞研究提供新的技术平台，其独特优势包括：与细胞相似的微流体通道尺寸；有效细胞微环境控制及细胞体内微环境模拟；减低分析试剂消耗；具备高通量和高内涵分析潜力；系统化集成等。基于上述优势，微流控芯片分析技术已在细胞生长和分化、细胞趋化、细胞迁移和细胞药物筛选等领域展开。
然而，微流控芯片研究中涉及的相关技术对于无相关经验的普通生物医学实验室仍是挑战。如现有微流控芯片大多是利用软光刻法加工制作微流控芯片，其制作过程较为繁复且需要借助一些昂贵、高精度的仪器来完成。例如：其掩膜的制作需借助高精度胶片打印机来完成；利用SU-8负性光刻胶光刻制作阳模的过程相当复杂、繁琐；大多数的芯片必须借助等离子表面处理器键合来完成封装；芯片灌胶必须借助精密仪器来完成等。而且此类芯片清洗困难，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了实验成本。这些都使微流控芯片在大多数生物医学实验室的应用受到了很大范围的限制。又如微流控芯片上成功的细胞培养是进行细胞分析的基础，其技术关键为细胞在空间受限的微通道内培养时营养物质提供。微通道内细胞培养主要采用灌注式培养，即通过外围流体灌注设备使细胞培养液持续在微通道内流动，从而为细胞提供营养物质并将细胞代谢废物移除。然而，培养液流动产生流体剪切力将对细胞造成一定的损伤，同时微流控芯片与外围液路的接口问题使细胞培养操作变得复杂。微通道内细胞培养另一种方式是采用静态培养，静态培养是细胞培养最常使用的方式，该方法虽不对细胞造成损伤，但将静态培养技术应用在空间受限的微通道内，仅通过扩散作用细胞常常不能获得足够的营养物质。
为此，基于上述微流控芯片加工、细胞培养及细胞响应分析的三大技术难点，本发明发展一种简易且易于在普通生物医学实验室开展的微流控芯片及细胞分析方法。
发明内容
有鉴于此，本发明首先提供了一种简易微流控芯片，该芯片相对于现有微流控芯片更易被普通生物学实验室采用加工和进行细胞培养及细胞分析的操作。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种简易微流控芯片，其特征在于，包括基底层和位于所述基底层上的细胞培养层，所述细胞培养层上设置有位于同一平面的储液池，所述细胞培养层上还设置有微通道，至少两个储液池的底部由微通道连通。
进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述微通道为直微通道。
进一步，所述的一种简易微流控芯片，由微通道连通的储液池大小相同。
进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述微通道的宽度最低为30μm，深度为30μm-200μm。
进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述基底层为玻璃，所述细胞培养层为PDMS材质。聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)是一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。其是一种高分子有机硅化合物，具有无毒性、高透气性、透光性良好、生物相容性佳、易与多种材质室温接合等特点。此外，其成本低，使用简单，且有极佳的可塑性、热稳定性和化学惰性。由于以上显著优点，使其成为目前微流控芯片制作使用最多的聚合物材料，也常用于芯片封装、微流道、微混合器、微泵浦、微阀门等元件制作等领域。
进一步，所述的一种简易微流控芯片，所述储液池与基底层连通。
微流控芯片的快速加工是开展微流控芯片分析的基础，因此，本发明还提供了一种快速加工微流控芯片的方法，该方法采用感光干膜代替了液态的光刻胶作为芯片阳模。
芯片阳模是微流控芯片加工的关键，传统软光刻工艺中主要采用液态SU-8光刻胶为基础，在洁净空间通过光刻技术加工而成。该技术主要缺点在于需要昂贵的仪器设备、及严格操作流程，在一定程度上限制了大多数生物医学实验室对该技术的应用。因此，本发明提供一种采用低成本的感光干膜替代液态光刻胶的制备方法，不但降低了微流控芯片加工成本和难度，同时不需要额外解决空间和大型设备，更易被普通生物学实验室采用加工。
感光干膜作为一种光聚合物材料主要应用于印刷板电路板工艺。相对于液体光刻胶，感光干膜具有诸多优势，如良好的适应性，基材粘附性、平整性、感光材料均匀分布性、低曝光功耗及低成本。更为重要的是，感光干膜光刻不需要超洁净空间和昂贵的光刻设备，作为液态光刻胶的替代物还可应用在微流体通道加工、电铸模具等。利用感光干膜制备微流控芯片可参考任何现有文献。而在本发明的一个具体实施例中，加工流程示意图如图4(A)所示，具体方法为：首先将三层感光干膜通过覆膜机依次层压在玻璃板上使感光层厚度约为100μm，将微通道图案通过爱普生喷墨打印机打印在透明胶片上制成光掩膜，紫外线透过光掩膜对感光干膜照射70s，1％碳酸钠显影制成微通道阳模；将PDMS基质和固化剂按重量10：1混合而成的预聚物浇铸在微通道阳模上，抽真空除气泡，60℃下固化3h。将固化后的PDMS基片从感光干膜阳模上剥离，利用平头打孔器(直径5mm)在微通道两侧打孔形成储液池，氧等离子表面处理(30w，1min)与载玻片进行不可逆键合，形成玻璃-PDMS复合微流控芯片。
与传统加工工艺比较而言，本发明采用一种低成本的感光干膜作为液态光刻胶的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和难度，同时不需要额外解决空间和大型设备，更易被普通生物学实验室采用加工。同时，在没有配置专业设备的基础上，利用该方法能够加工的微通道宽度最低为50μm，深度范围为30μm-200μm。同时，为简化芯片结构复杂度，避免引入外围的灌流设备，本发明设计的微流控芯片由储液池和微通道组成，储液池内的液体样品在静水压作用下进入微通道。
本发明的目的还在于提供一种利用上述设计的简易微流控芯片进行细胞培养及分析的方法，该方法是一种间歇性细胞动态培养分析方法，通过该方法，不但能够为细胞提供足够营养物质，避免损伤生长中的细胞，而且仅仅通过对储液池的液体更换就能够完成微流体操作和细胞培养，降低实验难度。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
基于上述的一种简易微流控芯片进行间歇性细胞动态培养分析方法，包括如下进行的步骤：
(1)将简易微流控芯片进行消毒，然后采用人层粘连蛋白溶液对微通道进行修饰；
(2)将细胞悬液滴加至微通道的入口处，在毛细管作用力下细胞进入微通道内，然后在微通道一侧的储液池中注满细胞培养液，细胞培养液在重力作用下持续进入微通道并流向另一侧的储液池中，每隔一定时间将微通道两侧的储液池中的细胞培养液更换一次，即实现间歇性细胞动态培养；然后对微通道内培养的细胞进行细胞学分析。
进一步，所述的间歇性细胞动态培养分析方法，所述消毒为：紫外灯(UV)近距离照射，然后70％乙醇冲洗微通道，最后PBS溶液冲洗微通道。
本发明的目的还在于提供所述的一种简易微流控芯片在细胞学分析中的应用。
进一步，所述的应用，所述细胞学分析包括细胞形态分析、细胞存活分析、细胞毒性分析、细胞药物筛选。
本发明的有益效果：(1)本发明的简易微流控芯片简化了芯片结构复杂度，避免引入外围的灌流设备，本发明设计的微流控芯片由储液池和微通道组成，储液池内的液体样品在静水压作用下进入微通道，相对于现有微流控芯片更易被普通生物学实验室采用加工和进行细胞培养及细胞分析的操作。(2)本发明的简易微流控芯片的制备可采用一种低成本的感光干膜作为液态光刻胶的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和难度，同时不需要额外解决空间和大型设备，更易被普通生物学实验室采用加工。同时，在没有配置专业设备的基础上，利用该方法能够加工的微通道宽度最低为30μm，深度范围为30μm-200μm。(3)基于本发明的简易微流控芯片，可采用间歇性细胞动态培养方法，该方法是利用微通道两侧储液池间建立的液体静水压驱动培养液流过细胞培养微通道，从而为细胞生长提供足够的营养物质。通过该方法，不但能够为细胞提供足够营养物质，避免损伤生长中的细胞，而且仅仅通过对储液池的液体更换就能够完成微流体操作和细胞培养，降低实验难度。
附图说明
图1简易微流控芯片的结构示意图(其中a为微流控芯片的结构示意图，b为微流控芯片的侧面剖视图)。
图2实施例1的微流控芯片实物图。
图3实施例1的微流控芯片的俯视图(图3a)和侧视图(图3b)。
图4实施例1基于感光干膜软光刻工艺加工微流控芯片的加工流程示意图(图4A)及加工主要设备图片(图4B)。
图5微流控芯片流体动力学行为有限元分析结果，其中(a)为微流控芯片上液体样品体积分数分布云图，(b)为微通道内流体流动速度-时间曲线，(c)为微通道内流体流动矢量图。
图6微通道内A549细胞培养不同时间点的细胞形态及细胞存活荧光分析。
图7不同类型细胞在微通道内培养48h后的显微形态学图像。
图8不同浓度的重楼皂苷I作用微通道内A549细胞8h后细胞形态学改变分析图。
图9不同浓度重楼皂苷I作用后微通道内A549细胞荧光显微图。
图10重楼皂苷I浓度与微通道内A549细胞存活率间关系曲线图。
图11微流控芯片与传统96孔平台测量的重楼皂苷I浓度与A549细胞毒性关系曲线图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
如图1所示，本发明的一种简易微流控芯片，包括基底层1和位于所述基底层1上的细胞培养层2，所述细胞培养层2上设置有位于同一平面的储液池3，所述细胞培养层2上还设置有微通道4，至少两个储液池3的底部由微通道4连通。
作为上述技术方案的进一步改进，所述的一种简易微流控芯片，所述微通道4为直微通道。
作为上述技术方案的进一步改进，所述的一种简易微流控芯片，由微通道4连通的储液池3大小相同。
作为上述技术方案的进一步改进，所述的一种简易微流控芯片，所述微通道4的宽度最低为30μm，深度为30μm-200μm。
作为上述技术方案的进一步改进，所述的一种简易微流控芯片，所述基底层1为玻璃，所述细胞培养层2为PDMS材质。
作为上述技术方案的进一步改进，所述的一种简易微流控芯片，所述储液池3与基底层1连通。
实施例1微流控芯片
本实施例的一种简易微流控芯片，包括基底层1和位于所述基底层1上的细胞培养层2，所述基底层1为玻璃，所述细胞培养层2为PDMS材质；所述细胞培养层2上设置有位于同一平面的储液池3，所述储液池3与基底层1连通，所述细胞培养层2上还设置有微通道4，至少两个储液池3的底部由微通道4连通；所述微通道4为直微通道，由微通道4连通的储液池3大小相同，所述微通道4的长度为5mm，宽度为30μm，深度为80μm，储液池直径为3mm，深3mm。
实施例2微流控芯片
本实施例的具体的微流控芯片所述基底层1为玻璃，所述细胞培养层2为PDMS材质，含六条独立的平行直微通道，每条微通道的长、宽、深分别为5mm，500μm和100μm，储液池直径为5mm，深5mm。因此，这样一片芯片上可独立实施6次实验，一个微通道内单次分析试剂耗量约为50μl。
为了方便观察，在储液池和微通道内注入颜料，微流控芯片实物图如图2所示，俯视图和侧视图如图3所示。
本实施例微流控芯片的制备方法：
首先将三层感光干膜通过覆膜机依次层压在玻璃板上使感光层厚度约为100μm，将微通道图案通过爱普生喷墨打印机打印在透明胶片上制成光掩膜，紫外线透过光掩膜对感光干膜照射70s，1％碳酸钠显影制成微通道阳模；将PDMS基质和固化剂按重量10:1混合而成的预聚物浇铸在微通道阳模上，抽真空除气泡，60℃下固化3h。将固化后的PDMS基片从感光干膜阳模上剥离，利用平头打孔器(直径5mm)在微通道两侧打孔形成储液池，氧等离子表面处理(30w,1min)与载玻片进行不可逆键合，形成玻璃-PDMS复合微流控芯片。利用感光干膜制备微流控芯片的加工流程示意图如图4(A)所示。基于感光干膜软刻工艺加工微流控芯片所需主要设备照片如图4(B)所示。
为简化芯片结构复杂度，避免引入外围的灌流设备，本发明的微流控芯片由储液池和微通道组成，储液池内的液体样品在静水压作用下进入微通道。本发明采用一种低成本的感光干膜作为液态光刻胶的替代，不但降低了微流控芯片加工成本和难度，同时不需要额外解决空间和大型设备，更易被普通生物学实验室采用加工。同时，在没有配置专业设备的基础上，利用该方法能够加工的微通道宽度最低为30μm，深度范围为30μm-200μm。为分析微流控芯片性能，通过有限元分析软件ANSYS14.0(美国ANSYS公司)对微通道内流体动力学行为进行分析，储液池式微流控芯片流体动力学行为的数值有限元分析结果如图5所示。图5(a)为将液体样品加入微通道一侧的储液池(直径为5mm)后10s和700s时样品体积分数云图。该图可见液体样品将通过微通道流入另一侧储液池，当两侧储液池液面高度相同时，液体流动停止。图5(b)为微通道内流体流动速度与时间的关系曲线。由图5(b)结果可知，随着时间的延长，微通道内流体流动速度逐渐降低，其原因为两侧储液池液面高度差随时间延长降低，从而导致推动微通道内液体流动的静水压差降低。微通道内典型的液体流场矢量图如图5(c)所示，显示微通道内流体沿微通道平行方向流动，呈典型的层流模式。此外，图5(b)还显示储液池直径大小影响微通道内流体流动行为。即储液池直径越大，微通道内流体流动持续时间速度越长，速度降低越慢，其原因与微通道两侧储液池间静水压差改变模式有关。因此，通过改变储液池直径能够提供一种调控微通道内流体流动行为的一种策略。相比现有文献报道的通过改变储液池高度调节模式，本发明的微流控芯片可避免额外的储液池加工和计量储液池液面高度的步骤。
实施例3微流控芯片细胞分析方法：以天然抗癌药物重楼皂苷I促人肺癌细胞A549凋亡作用分析为例
以实施例2制备的微流控芯片进行操作。
重楼皂苷I是一种被证实具有抗癌作用的天然药物分子。在此基础上，本实施例以重楼皂苷I促人肺腺癌A549凋亡作用分析为例，对发明的微流控芯片细胞分析技术进行验证。
以下实施例中所涉及的实验材料及设备：
材料包括：重楼皂苷I(含量为98.36％)购于上海纯优生物科技有限公司，DMSO溶解，4℃保存；人层粘连蛋白(美国PROSPEC公司)；葡聚糖(70kDa)(上海生工)；LIVE/DEADViability/Cytotoxicity试剂盒(美国Molecularprobes公司)；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、链青霉素、胰酶(碧云天)，RPMI-1640培养液、胎牛血清(Gibco)；Sylgard184型聚二甲基硅氧烷(美国DowCorning公司)；HQ-6100感光干膜(长兴化工)；常规化学试剂(长江化工)。
设备包括：紫外曝光灯(实验室自制)；FM-360覆膜机(杭州新彩)；Harrick等离子清洗机(PDG-32G-2)；HF90二氧化碳细胞培养箱(力康)；1390喷墨打印机(爱普生)；IX71导致荧光显微镜(奥林巴斯)；CCD(QICAMfast1394,QImanging)。
人肺癌细胞株A549细胞培养及细胞悬液制备：
人肺癌细胞株A549由重庆医科大学附属永川医院中心实验室常规培养。A549细胞用含10％胎牛血清、100U/毫升青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中在37℃、5％二氧化碳条件下培养。待细胞生长至对数生长期，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化细胞，1500rmp离心4min，用含4％的葡聚糖的RPMI1640培养液重悬细胞，制成浓度约为5×106cells/ml细胞悬液。
(1)微流控芯片上A549细胞培养
微流控芯片上细胞培养包括三个步骤：芯片消毒，微通道修饰及细胞加载培养。芯片消毒：紫外灯(UV)近距离照射30min，70％乙醇冲洗微通道5min，PBS冲洗微通道2次；微通道修饰：在微通道内注入浓度为0.1mg/ml的人层粘连蛋白溶液，37℃下孵育1h，PBS冲洗微通道2次；细胞加载培养：将5μlA549细胞悬液滴加进微通道入口，在毛细管作用力下细胞进入微通道内，芯片放置进37℃、5％二氧化碳浓度培养箱中静止1h，在微通道一侧储液池中注满含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，培养液在重力作用下持续进入微通道并流向另一侧储液池中，储液池中培养液8-12h更换一次。微通道内培养不同时间的A549细胞形态学通过倒置光学显微镜明场观察，培养的细胞活性通过细胞存活/死亡检测试剂盒Calcein-AM荧光染色分析。
对微通道内A549细胞采用间歇式动态细胞培养技术不同阶段的A549细胞相差显微形态图如图6，该结果显示A549细胞能够在微通道内粘附、铺展和增殖，培养48h细胞就能够铺满微通道，进一步CalceinAM荧光染色显示细胞处于存活状态。
另外，为验证储液池式微流控上通过间歇性细胞动态培养技术进行细胞培养的通用性，本发明中还按照上述方法进行了人肾上皮细胞株293、血管内皮细胞株EA.hy926、人原代嗅粘膜细胞及人膀胱癌细胞T24微流控芯片培养，培养48h后微通道内细胞形态学如图7所示。结果显示上述四种细胞均能够在微通道进行增殖，也进一步说明微流控芯片细胞培养方式具有优良的通用性。
微流控芯片上成功的细胞培养是进行细胞分析的基础，其技术关键为细胞在空间受限的微通道内培养时营养物质提供。微通道内细胞培养主要采用灌注式培养，即通过外围流体灌注设备使细胞培养液持续在微通道内流动，从而为细胞提供营养物质并将细胞代谢废物移除。然而，培养液流动产生流体剪切力将对细胞造成一定的损伤，同时微流控芯片与外围液路的接口问题使细胞培养操作变得复杂。静态培养是细胞培养最常使用的方式，该方法虽不对细胞造成损伤，但将静态培养技术应用在空间受限的微通道内，仅通过扩散作用细胞常常不能获得足够的营养物质。本发明中采用了间歇性细胞动态培养技术，该技术是利用微通道两侧储液池间建立的液体静水压驱动培养液流过细胞培养微通道，从而为细胞生长提供足够的营养物质。细胞培养过程中每间隔一段时间(如8-12h)移除微通道两端储液池中的旧培养液，同时在微通道一侧储液池中加入新鲜培养液。通过该方法，不但能够为细胞提供足够营养物质，避免损伤生长中的细胞，而且仅仅通过对储液池的液体更换就能够完成微流体操作和细胞培养，降低了实验难度。
(2)不同浓度重楼皂苷I对微通道内A549细胞形态学改变分析
微通道内培养不同时间的A549细胞形态学通过倒置光学显微镜明场观察，培养的细胞活性通过Calcein-AM荧光染色分析。待微通道内A549细胞融合度达到90％以上(48h)，吸出两端储液池中的细胞培养液，将50μl含不同重楼皂苷I浓度的细胞培养液(浓度分别是0、2、4、6、8、10mg/ml)加入不同微通道一侧的储液池，放入细胞培养箱中孵育8h后，倒置显微镜观察分析A549细胞在不同浓度重楼皂苷I作用后形态学改变。
对微通道内A549细胞进行药物作用采用上述的依赖静水压力驱动的方法，即在微通道一侧储液池加入含不同浓度的重楼皂苷I细胞培养液，在静水压力作用下流过微通道内A549细胞并对A549细胞进行刺激。图8为不同浓度重楼皂苷I作用微通道内A549细胞8h后细胞的形态图。从图8可见，A549细胞在重楼皂苷I作用后，细胞质收缩变园，细胞从基底脱离，呈凋亡的形态学。随着重楼皂苷I浓度的上升，细胞收缩变圆数量比例增加，重楼皂苷I浓度达到10μg/ml时，变圆细胞比例接近100％。在未经重楼皂苷I作用的微通道内，A549细胞呈梭形，量化铺展，呈正常生长状态。因此，通过对微通道内细胞形态学的分析能够初步验证重楼皂苷I体外促A549细胞凋亡的效应。
(3)微通道内A549细胞存活/死亡荧光染色分析
为进一步量化重楼皂苷I浓度与A549细胞凋亡强度的关系，对微通道内A549细胞进行荧光染色分析。分析时，将含2μMCalceinAM和4μMethidiumhomodier-1(EthD-1)的荧光染料混合液注入储液池中。其中，CalceinAM能够对活细胞进行荧光标记，呈绿色荧光；EthD-1能够特异标记死亡细胞，呈红色荧光。
具体操作为：微通道内A549细胞经过步骤(2)不同浓度重楼皂苷I处理后，吸出微通道两端储液池中细胞培养液，在一端储液池中加入PBS冲洗2次，吸除PBS。在微通道一侧储液池加入50μl含2μMCalceinAM和4μMethidiumhomodier-1(EthD-1)的细胞存活/死亡荧光染料，室温下孵育30min，吸除荧光染料，PBS冲洗2次。通过倒置荧光显微镜下对微通道内细胞荧光图像进行观察，拍照，用图像分析软件ImageProPlus6.0(mediacybernetic)对图像进行分析。
不同浓度重楼皂苷I作用微通道内A549细胞8h后细胞荧光染色结果如图9所示。结果显示随着重楼皂苷I浓度增加，微通道内存活细胞(绿色)数量降低，该结果与形态学观察结果相似。以未经重楼皂苷I处理的微通道活细胞数量为对照，重楼皂苷I浓度与微通道内活细胞残留率间的关系如图10所示。值得注意的是，在对重楼皂苷I处理组的微通道内A549细胞进行荧光观察时，实验未见微通道内红色荧光标记的死细胞，其原因在于荧光染色分析过程中死细胞从微通道内被冲洗掉。
(4)微通道内A549细胞毒性分析
微通道内A549细胞毒性分析采用乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)释放实验进行评估。LDH释放是细胞膜完整性的重要指标，当细胞凋亡或坏死造成细胞膜结构破坏导致细胞浆中的LDH释放到培养液中，通过检测培养液中LDH的活性从而实现细胞毒性的定量分析。
分析流程如下：实验分为无细胞的空白对照微通道，未经重楼皂苷I作用的样品对照微通道和最大酶活性微通道，不同浓度重楼皂苷I作用的样品处理微通道。重楼皂苷I作用7h时，在最大酶活性微通道储液池中加入5μlLDH释放试剂，放入细胞培养箱中孵育1h。随后从所有微通道储液池中吸出培养液，离心后将50μl上清液加入96孔板中，随着在每孔中加入25μlLDH检测工作液，室温避光孵育30min，多功能酶标仪测量490nm处吸光度，测量采用620nm波长作为参考波长。每孔的吸光度减去空白对照的吸光度后，细胞毒性(％)＝(样品处理吸光度-样品对照组吸光度)/(细胞最大酶活性吸光度-样品对照孔吸光度)×100。
不同浓度重楼皂苷I与A549细胞毒性的关系曲线如图11所示。结果显示，随着重楼皂苷I浓度增殖，A549细胞LDH释放率增强，细胞毒性越大，该结果与细胞形态学和细胞存活率分析结果相似。
为进一步验证微流控芯片进行细胞毒性分析方法的可靠性，本发明还通过与传统96孔板平台上进行的LDH释放实验结果进行了比较。结果如图11所示，结果显示两种不同平台获得的不同浓度重楼皂苷I对A549细胞毒性具有相同的趋势。此外，相比96孔板实验平台，微流控芯片上测量的重楼皂苷I的细胞毒性值更高，特别在2μg/ml和4μg/ml低浓度情况下。推测其原因与微流控芯片上的流动环境和空间受限条件下细胞与药物作用更充分有关。
综上，本发明的微流控芯片简单，该微流控芯片易于在普通生物医学实验室开展微流控芯片细胞分析。本发明通过重楼皂苷I促人肺癌细胞A549凋亡的分析为例对本发明的微流控芯片进行了验证。微流控芯片上细胞培养采用一种间歇式细胞动态培养技术，该技术能为空间受限微通道内的细胞培养提供足够营养物质，且易于操作；微流控芯片上细胞对重楼皂苷I的响应分析采用了形态学、细胞存活/死亡荧光染色分析及基于LDH释放的细胞毒性分析三种策略，能够从定性到定量的不同层次获得细胞响应信息。因此，本发明的微流控芯片及细胞分析方法操作简单，未来可在普通生物医学实验室中推广并应用于各类体外细胞药物筛选分析。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种简易微流控芯片，其特征在于，包括基底层(1)和位于所述基底层(1)上的细胞培养层(2)，所述细胞培养层(2)上设置有位于同一平面的储液池(3)，所述细胞培养层(2)上还设置有微通道(4)，至少两个储液池(3)的底部由微通道(4)连通。
2.根据权利要求1所述的一种简易微流控芯片，其特征在于，所述微通道(4)为直微通道。
3.根据权利要求1所述的一种简易微流控芯片，其特征在于，由微通道(4)连通的储液池(3)大小相同。
4.根据权利要求1所述的一种简易微流控芯片，其特征在于，所述微通道(4)的宽度最低为30μm，深度为30μm-200μm。
5.根据权利要求1所述的一种简易微流控芯片，其特征在于，所述基底层(1)为玻璃，所述细胞培养层(2)为PDMS材质。
6.根据权利要求5所述的一种简易微流控芯片，其特征在于，所述储液池(3)与基底层(1)连通。
7.权利要求1-6任一项所述的一种简易微流控芯片在细胞学分析中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞学分析包括细胞形态分析、细胞存活分析、细胞毒性分析、细胞药物筛选。
9.基于权利要求1-6任一项所述的一种简易微流控芯片进行间歇性细胞动态培养分析方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：
(1)将简易微流控芯片进行消毒，然后采用人层粘连蛋白溶液对微通道进行修饰；
(2)将细胞悬液滴加至微通道(4)的入口处，在毛细管作用力下细胞进入微通道(4)内，然后在微通道(4)一侧的储液池(3)中注满细胞培养液，细胞培养液在重力作用下持续进入微通道(4)并流向另一侧的储液池(3)中，每隔一定时间将微通道(4)两侧的储液池(3)中的细胞培养液更换一次，即实现间歇性细胞动态培养；然后对微通道(4)内培养的细胞进行细胞学分析。
10.根据权利要求9所述的间歇性细胞动态培养分析方法，其特征在于，所述消毒为：紫外灯近距离照射，然后70％乙醇冲洗微通道，最后PBS溶液冲洗微通道。
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