CN109055213A - 一种简易微量细胞培养和计数的装置及该装置的制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简易微量细胞培养和计数的装置及其制作方法，该装置包括底板、基板；所述的基板设置在底板的上端，所述基板与底板紧密结合设置，所述底板为玻璃培养皿，所述基板由透明性高，生物相容性好的材料制成，所述基板上设有若干个上下贯通的通孔，所述通孔的孔径大小与显微镜中所需视野大小相匹配。相对于现有的细胞计数装置，本发明装置成本低、可重复多次使用；使用材料透气性好，生物相容性高，弹性强，对细胞无损伤；有利于细胞培养，可以集成细胞培养和细胞计数的功能；准确度高，适合微量细胞的计数；计数迅速，可同时在一块基板上进行多个样品的计数。

Description

一种简易微量细胞培养和计数的装置及该装置的制作方法
技术领域
本发明涉及技术领域，具体来说，涉及一种简易微量细胞培养和计数的装置及该装置的制作方法。
背景技术
在生物学研究中，有时需要对单位体积内的细胞数量进行测算，在现有计数中，此过程中一般采用细胞计数板对细胞数量进行测算，现有的用于细胞计数的装置通常用血球计数板、流式细胞术；血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具；专利CN206696154U公开了一种血球计数板，包括底板和盖片，底板上表面设有计数池，底板上设有可移动的隔液片，该血球计数板避免了计数池内样液的实际体积大于或者小于计数池体积的情况，提高了样液计数的精确，但血球计数板仅适用于大量细胞的细胞计数，且准确性、重复性较差，不适合用于微量细胞的计数；
流式细胞仪(Flow cytometer)是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来；专利CN 207051160 U公开了一种分选型流式细胞仪，包括液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统，该细胞仪提高前向散射光的检测灵敏度，且可以检测直径小于0.5μm小颗粒样本，并对20nm差异的样本进行区分和分选，因此扩大了流式细胞分选仪的应用领域。流式细胞仪可以精确到微量细胞的计数，但仪器成本较高，操作复杂，需要的样品体积较大。且现有的细胞计数装置通常只具备计数功能，功能比较单一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处，本发明提供一种简易微量细胞培养和计数的装置及该装置的制作方法，该装置在降低设备成本的前提下，提高细胞计数的准确性，提高样品分析的效率，降低样品的使用量。
为实现上述目的，所采取的技术方案：
一种简易微量细胞培养和计数的装置，包括底板、基板；所述的基板设置在底板的上端，所述基板与底板紧密结合设置，所述底板为玻璃培养皿，所述基板由透明性高，生物相容性好的材料制成，所述基板上设有若干个上下贯通的通孔，所述通孔的孔径大小与显微镜中所需视野大小相匹配。
本发明主要针对当细胞量很少，样品珍贵的情况下，能够快速、准确地进行细胞计数的简易装置。其主要材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的基板和普通载玻片键合而成，PDMS可由PMMA等生物相容性材料替代，本发明有利于细胞培养，可以集成细胞培养和细胞计数的功能；准确度高，适合微量细胞的计数；且计数迅速，可同时在一个基板上进行多个样品的计数。当需要进行贴壁细胞再培养时，仅需要在表面滴加0.1％多聚赖氨酸，室温放置2h后即可使用。
优选地，所述基板由PDMS或PMMA材料制成。
优选地，所述通孔的孔径大小为4mm。
优选地，所述通孔的孔径大小为5mm或2mm或0.5mm。
优选地，所述底板为载玻片。
优选地，所述基板的厚度为1～5mm。
优选地，所述基板与底板通过等离子体处理进行键合。
本发明还提供了一种所简易微量细胞培养和计数的装置的制作方法，包括以下步骤：
1)将底板的背面边缘粘一圈普通透明胶带，作为基板浇筑；
2)称取PDMS与预聚物，以10：1的比例混合均匀，或者称取PMMA，并将上述材料平铺于上述玻璃培养皿中，使其具有一定厚度；
3)将底板放置于真空干燥箱中进行脱气，待无气泡再将其固化，将PDMS或PMMA从底板中剥离下来，根据所需要的光学显微镜放大倍数相应的打孔器进行打孔；
4)将经过打孔后的基板，和底板的表面经过等离子体下处理1～2min，立即键合；再进行烘烤，即为本发明的细胞计数装置。
优选地，所述步骤4)中为在60～70℃烘烤2～5min。
优选地，所述步骤3)中待无气泡75～80℃放置1～2h，待其固化。
有益效果：
1、本发明装置成本低、可重复多次使用；
2、本发明的装置使用的材料透气性好，生物相容性高，弹性强，对细胞无损伤；
3、本发明的装置有利于细胞培养，可以集成细胞培养和细胞计数的功能；
4、本发明的装置准确度高，适合微量细胞的计数；
5、本发明的装置计数迅速，可同时在一块基板上进行多个样品的计数。
附图说明
图1为本发明装置的结构图；
图2为利用本发明装置对1mL全血中的循环肿瘤细胞计数的结果图；
图3为利用本发明装置对CCRF-CEM细胞的精确计数的结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。故凡依本发明专利申请范围所述的方法具体如下：以下实施例所涉及各原料如无特别说明，均为市售通用产品。
本发明公开了一种简易微量细胞培养和计数的装置，本发明的装置包括底板1、基板2；所述的基板设置在底板1的上端，底板1为普通的载玻片，利于装载和培养细胞；基板2由透明性高，生物相容性好的材料制成的，如PDMS、PMMA，基板2的厚度根据需要设置，优选地，其厚度为1～5mm，基板2上设有若干个上下贯通的通孔21，通孔21内可装载细胞培养基，通孔21的孔径大小与显微镜中所需视野大小相匹配。一般情况下，10倍目镜的视野数是20，那么4倍物镜的视野大小是20/4＝5mm，10倍是2mm，40倍是0.5mm，以此类推，即采用此直径大小的打孔器进行打孔。本发明的基板2与底板1通过等离子体清洗仪处理后，70～80℃10min进行键合。
本发明还提供了上述装置的制作方法，包括以下步骤：
1)将底板2(玻璃培养皿)的背面边缘粘一圈普通透明胶带，作为基板2浇筑；
2)称取PDMS与预聚物，以10：1的比例混合均匀，平铺于上述玻璃培养皿中，使其具有一定厚度，此厚度决定了装载细胞培养基的体积，如PDMS的厚度为2mm时，可装载20μL的培养基；
3)将底板1放置于真空干燥箱中进行脱气，待无气泡后75～80℃放置1～2h，使其固化，将PDMS从底板1中剥离下来，根据所需要的光学显微镜放大倍数相应的打孔器进行打孔。一般情况下，10倍目镜的视野数是20，那么4倍物镜的视野大小是20/4＝5mm，10倍是2mm，40倍是0.5mm，以此类推，即采用此直径大小的打孔器进行打孔。
4)将经过打孔后的PDMS基板2，和底板1的表面经过等离子体下处理1～2min，立即键合；60～70℃烘烤2～5min，即为本发明的细胞计数装置。
实施例1乳腺癌患者全血中循环肿瘤细胞的计数
由于实体瘤患者中循环肿瘤细胞的数量非常少，1mL全血中可能仅仅只有几个肿瘤细胞，对于捕获后的肿瘤细胞如何准确地进行计数是亟待解决的问题之一。
本发明设计了一个可以对微量细胞进行准确计数的装置，其结构如附图1所示，本发明的装置包括底板1、基板2；所述的基板设置在底板1的上端，底板1为普通的载玻片，利于装载和培养细胞；基板2由PDMS材料制成，基板2设有若干个上下贯通的通孔21，通孔的孔径大小为4mm,与显微镜上5×的物镜相匹配。
该装置的制作方法如下：
1)将底板2(玻璃培养皿)的背面边缘粘一圈普通透明胶带，作为基板2的浇筑模板；
2)称取PDMS与预聚物，以10：1的比例混合均匀，平铺于上述玻璃培养皿中，使其厚度为2mm；
3)将底板2放置于真空干燥箱中进行脱气，待无气泡后80℃放置2h，使其固化，将PDMS基板从玻璃片中剥离下来，利用4mm外径的打孔器进行打孔；
4)将经过打孔后的PDMS基板2，和底板1的表面经过等离子体下处理1min，立即键合；60℃烘烤5min，即为本发明的细胞计数装置。
利用免疫磁珠在1mL全血中捕获得到的肿瘤细胞，利用DIO溶液在37℃孵育10min，使细胞在488nm激发下，具有绿色荧光。将细胞重新分散于20μLPBS中，滴加在装置中其中一孔，利用荧光显微镜(5×物镜)可直接对其进行准确计数，其结果如图2所示，其乳腺癌患者的1mL全血中含有5个肿瘤细胞。
实施例2CCRF-CEM细胞的精确计数
采用本发明细胞计数装置，也能够对较大量的细胞进行精确计数，并具有成本低，操作简便，准确性高等优势。本实施的细胞计数装置结构和制作方法与实施案例1相同，不同之处在于，其中基板2由PMMA材料制成。将培养皿中的CCRF-CEM细胞，利用DIO溶液在37℃孵育10min,使细胞在488nm激发下，具有绿色荧光。将细胞重新分散于20μL PBS中，浓度范围为1-1000个/mL(超过此浓度范围，则细胞容易叠加形成两层，此时不能进行细胞的准确计数)，滴加于发明装置的其中一个孔中，静置5min，利用荧光显微镜(5×物镜)拍照，获取的照片利用ImageJ软件进行处理，利用analyze-analyze particles计算得到的颗粒数即是细胞量的精确数值，如图3所示，此时计算得到的细胞数量为288。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，包括底板、基板；所述的基板设置在底板的上端，所述基板与底板紧密结合设置，所述底板为玻璃培养皿，所述基板由透明性高，生物相容性好的材料制成，所述基板上设有若干个上下贯通的通孔，所述通孔的孔径大小与显微镜中所需视野大小相匹配。
2.根据权利要求1所述的简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，所述基板由PDMS或PMMA材料制成。
3.根据权利要求1所述的简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，所述通孔的孔径大小为4mm。
4.根据权利要求1所述的简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，所述通孔的孔径大小为5mm或2mm或0.5mm。
5.根据权利要求1所述的简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，所述底板为载玻片。
6.根据权利要求1所述的简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，所述基板的厚度为1～5mm。
7.根据权利要求1所述的简易微量细胞培养和计数的装置，其特征在于，所述基板与底板通过等离子体清洗仪处理后，70～80℃10min进行键合。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的简易微量细胞培养和计数的装置的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将底板的背面边缘粘一圈普通透明胶带，作为基板浇筑；
2)称取PDMS与预聚物，以10：1的比例混合均匀，或者称取PMMA，并将上述材料平铺于上述底板中，使其具有一定厚度；
3)将底板放置于真空干燥箱中进行脱气，待无气泡再将其固化，将PDMS或PMMA从底板中剥离下来，根据所需要的光学显微镜放大倍数相应的打孔器进行打孔；
4)将经过打孔后的基板，和底板的表面经过等离子体下处理1～2min，立即键合；再进行烘烤，即为本发明的细胞计数装置。
9.根据权利要求8所述的简易微量细胞培养和计数的装置的制作方法，其特征在于，所述步骤4)中为在60～70℃烘烤2～5min。
10.根据权利要求8所述的简易微量细胞培养和计数的装置的制作方法，其特征在于，所述步骤3)中待无气泡75～80℃放置1～2h，待其固化。
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