CN103667057A - 基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法 - Google Patents

基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括基材以及形成于所述基材内的沟道，所述沟道包括培养主通道，该培养主通道的一端设有至少两个进样口，另一端连通一出样口。本发明还公开了一种微流控的制作方法，以及基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法。该微流控芯片在控制进样口和出样口液面压差产生的重力驱动下，利用微流体之间的层流现象实现细胞植入和伤口制备，在显微镜下可直观地观察细胞受创后细胞迁移的生物学行为，为研究细胞伤口愈合的细胞生物学奠定基础。该微流控芯片可同时实现细胞无创伤口制备，便于实时不间断地观察细胞迁移的生物学行为，可运用于各类细胞迁移研究中。

Description

基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法
技术领域
本申请涉及一种微流控芯片、微流控芯片的制作方法、以及基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法。
背景技术
细胞迁移是一个受大量化学和物理信号指导的动态的复杂过程，在众多生理与病理过程中扮演着重要的角色。细胞迁移需要内外因素的配合，外部因素指细胞外的信号分子，内部因素则指细胞的信号传导系统和执行运动的细胞骨架和分子马达，还有参与粘着斑形成的各种分子。在细胞迁移生物学行为研究中，传统方法如细胞伤口愈合、诱导扩散法、Boyden小室/Transwell小室等常规细胞迁移模型已在细胞迁移生物学行为研究中取得显著成果，然而，由于其难以突破真实地模拟体内微环境（如血流剪切力）及浓度梯度不稳定等诸多问题，使细胞迁移过程遗留下很多未解之谜。因自身的局限性，传统技术无法满足复杂的生命过程及众多的未知领域所需要的高数量级实验次数与庞大的数据分析，使细胞迁移生物学研究呈现瓶颈状态。
有创口类细胞迁移，也称为细胞伤口愈合类细胞迁移运动，培养单层细胞并产生伤口区域，然后研究该伤口受创处周围细胞迁移的现象。该方法是最简单，廉价和高重复性的基础细胞生物学方法，同时也是最早在体外直接研究细胞迁移速率、持续性及极化等特性的方法之一。现有宏观技术中，为了获得细胞伤口，通常采用物理划痕方式，其缺点在于：所获得的伤口毛糙，伤口边缘细胞会损伤，影响细胞活性，残留细胞碎片多，不便于动态观察研究，重现性不高。
自20世纪90年代以来，自然科学与工程技术发展的一个重要趋势是向微型化迈进。微流控芯片技术是由瑞士科学家Manz等提出，该技术是以微加工微基础、微流体驱动/控制为核心技术、现代分析检测技术为手段的分析检测平台。微流控芯片技术完全有别于传统意义上的宏观技术理念，它缩小了装置的体积，提高了分析效率，减少了试剂的的消耗量，避免了环境污染，以微型化、集成化、高通量、高精度的特征在众多科学领域如医学、化学、生命科学、环境等获得了广泛应用，显示出巨大的发展潜力和应用价值。近年来，由于微流控芯片技术具有网格式二维或三维通道结构及微米级的通道尺寸，可同时在时间和空间上控制流体等特点及优势，利用微流控芯片技术来研究细胞迁移生物学行为受到许多研究者的关注。
发明内容
本发明的目的提供一种微流控芯片及其制作方法，以及基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，克服现有物理划痕方式所产生细胞伤口毛糙、存在边缘效应的缺点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，所述微流控芯片包括基材以及形成于所述基材内的沟道，所述沟道包括培养主通道，该培养主通道的一端设有至少两个进样口，另一端连通一出样口。
优选的，在上述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片中，所述培养主通道于水平面内延伸，所述进样口沿竖直方向延伸。
优选的，在上述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片中，所述出样口沿竖直方向延伸。
优选的，在上述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片中，所述每个进样口和培养主通道之间还连通有一缓冲通道，所述缓冲通道与所述培养主通道位于同一水平面内。
优选的，在上述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片中，所有的所述缓冲通道具有相同的口径。
优选的，在上述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片中，所述基材包括上下层叠设置的第一基材和第二基材，所述主通道和缓冲通道开设于所述第二基材的上表面，所述进样口和出样口贯穿所述第一基材或第二基材的上下表面。
优选的，在上述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片中，所述培养主通道的一端设有三个进样口。
相应的，本发明还公开了一种研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片的制作方法，包括：
S1、通过微加工技术在第二基材的上表面制作培养主通道和缓冲通道；
S2、在第一基材或第二基材上制作进样口和出样口；
S3、将第一基材和第二基材上下对齐进行封合，获得研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片。
本发明还公开了一种基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，包括：
a）提供权利要求1所述的微流控芯片，从进样口加入细胞溶液并控制细胞溶液的流速，将细胞缓慢地植入培养主通道中，然后进行细胞培养，在培养主通道的内壁上形成细胞层；
b）在其中一进样口加入胰蛋白酶，同时在其相邻的进样口中加入细胞保护试剂，通过胰蛋白酶对细胞的消化作用，细胞层在胰蛋白酶和细胞保护试剂的接合处形成细胞伤口；
c）细胞伤口形成稳定后，在显微镜下观察细胞迁移的生物学行为。
优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法中，所述培养主通道于水平面内延伸，所述进样口沿竖直方向延伸，所述出样口沿竖直方向延伸，所述步骤a）中 ，通过控制进样口和出样口细胞溶液的液差高度，进而控制细胞溶液的流速。
优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法中，所述培养主通道于水平面内延伸，所述进样口沿竖直方向延伸，所述出样口沿竖直方向延伸，所述步骤b）中 ，通过控制进样口和出样口的液差高度，进而控制胰蛋白酶和细胞保护试剂的流速。
优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法中，所述细胞保护试剂为PBS缓冲液。
优选的，在上述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法中，所述培养主通道的一端设有三个进样口，所述步骤b）中，位于中间的进样口加入细胞保护试剂，位于其两侧的进样口均加入胰蛋白酶。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提出的一种基于微流控芯片研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的方法，便于观察、设备简单、直接采样、样品和试剂用量小，样品无需转移、样品交叉污染几率小，能更真实地研究细胞迁移生物学行为，在细胞生物学、遗传学和药物筛选等相关领域具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为本发明具体实施例中微流控芯片的结构示意图；
图2所示为图1中沿虚线的剖视图；
图3所示为本发明具体实施例中培养主通道形成细胞单层后的示意图；
图4所示为本发明具体实施例中细胞单层被消化形成伤口的示意图;
图5所示为本发明第二实施例中微流控芯片的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
图1所示为本发明实施例中微流控芯片的结构示意图。图2所示为沿图1中虚线的剖视图。
参图1和图2所示，微流控芯片包括基材1以及形成于基材1内的沟道2。
基材1包括上下层叠设置的第一基材11和第二基材12，基材1的材质选自PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）、PC（聚碳酸酯）、COC树脂、ABS（丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物）、玻璃、石英或铜，优选为PMMA，第一基材11和第二基材12的材质可以相同，也可以不同。
沟道2为形成于第二基材12上表面上的沟槽，包括培养主通道21以及连通于培养主通道21一端的三条缓冲通道22。培养主通道21和三条缓冲通道22位于同一平面内。培养主通道21以及缓冲通道22的截面优选为矩形，三条缓冲通道22的长度以及口径均相同。另外，培养主通道21的口径优选为单个缓冲通道22口径的三倍，这样，溶液从三条缓冲通道22进入培养主通道21时，不会因为口径突然变大或变小而改变原来的运动状态，同时溶液的界面处保持为直线。
第一基材11上贯穿设有三个进样口111以及一个出样口112，三个进样口111分别连通于三条缓冲通道22的入口且沿垂直方向延伸，出样口112连通于培养主通道21的出口且沿垂直方向延伸。
在其他实施例中，基材也可以仅仅为一块平板，进样口和出样口设置于平板的侧面；缓冲通道22可以仅设置有两个或大于三个，对应进料口也设置为两个或大于三个。
上述微流控芯片的制作方法如下：
（1）用计算机辅助设计软件（CAD）设计微流控芯片的微通道与微结构；
（2）通过激光刻蚀、热压法、模塑法、数控微加工或软刻蚀技术在PMMA基材表面制备培养主通道、缓冲通道、进样口和出样口；
（3）将制备有培养主通道和缓冲通道的微流控芯片基材切割成4x4cm的尺寸（作第二基材），再将制备有进样口和出样口的基材切割成4x4cm的尺寸（作第一基材），将加工过的基材分别用自来水、蒸馏水清洗，并用乙醇擦拭基材表面残留的指纹、油渍等污渍，自然晾干； 
（4）通过热压封合技术或通过双层粘性薄膜粘性胶，将第一基材和第二基材在显微镜下对齐，进行封合，制成用于研究细胞迁移生物学行为的微流控芯片。
利用上述微流控芯片研究细胞受创后细胞迁移生物学行为，方法如下：
将四个适合的圆锥口径的枪头插入芯片的进出口处，从三个进样口加入细胞溶液，控制三个进样口与出样口之间的液差高度，使细胞溶液缓慢流经细胞培养主通道，细胞在缓慢通过培养主通道过程中，吸附停留在封合的细胞培养通道的内壁（通道的底壁或通道的四周内壁上），当吸附的细胞数量占到培养主通道的十分之一时，完成细胞的植入，将微流控芯片放入细胞培养箱进行培养。
用显微镜观察，当培养主通道形成细胞单层后（参图3所示），从左侧进样口、中间进样口和右侧进样口分别加入含胰蛋白酶（10%）、PBS缓冲液、胰蛋白酶（10%）的细胞培养液，控制三个进样口与出样口的液差高度，从而控制层流速度，使胰蛋白酶快速流经培养主通道的细胞单层，被胰蛋白酶溶液流过的细胞因此被消化，随流体流出微通道，完成细胞伤口的无创制备（参图4所示）。此外还可控制左右侧进样口胰蛋白酶（10%）与中间进样口PBS缓冲液的液差高度来形成不同宽度的中间细胞层伤口，便于研究细胞间相互作用对伤口的影响。最后用PBS溶液缓慢冲洗残留的胰蛋白酶，细胞伤口形成稳定后，在显微镜可以实时不间断地观察细胞受创后伤口处细胞迁移的生物学行为，细胞伤口处的细胞均是活性的，可真实观察生物细胞伤口形成后的细胞迁移现象。
上述方法中，也可以在左右两侧的进样口中通入PBS缓冲液，同时中间的进样口通入胰蛋白酶（10%）。胰蛋白酶目的在于使细胞间的蛋白质水解从而使细胞解散，其同样可以由EDTA或胶原酶进行替代。PBS缓冲液可用Hanks液、D-Hanks液、Dulbecco等常用的细胞平衡盐溶液代替。
参图5所示，在本发明第二实施例中，培养主通道、缓冲通道、进样口和出样口均形成于第一基材上，第二基材为一块空白平板。
综上所述，本发明通过在控制进样口和出样口液面压差产生重力驱动下，不同进料口的液体之间形成层流现象，利用微流体之间的层流现象，在胰蛋白酶对细胞粘附层的消化作用下，实现细胞的植入和细胞伤口的无创形成，在显微镜下可直观地研究细胞受创后细胞迁移的生物学行为，为研究伤口愈合及细胞迁移生物学奠定基础。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (13)

1.一种研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括基材以及形成于所述基材内的沟道，所述沟道包括培养主通道，该培养主通道的一端设有至少两个进样口，另一端连通一出样口。
2.根据权利要求1所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所述培养主通道于水平面内延伸，所述进样口沿竖直方向延伸。
3.根据权利要求1或2所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所述出样口沿竖直方向延伸。
4.根据权利要求1或2所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所述每个进样口和培养主通道之间还连通有一缓冲通道，所述缓冲通道与所述培养主通道位于同一水平面内。
5.根据权利要求4所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所有的所述缓冲通道具有相同的口径。
6.根据权利要求4所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所述基材包括上下层叠设置的第一基材和第二基材，所述培养主通道和缓冲通道开设于所述第二基材的上表面，所述进样口和出样口贯穿所述第一基材或第二基材的上下表面。
7.根据权利要求1所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片，其特征在于：所述培养主通道的一端设有三个进样口。
8.权利要求7所述的研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片的制作方法，其特征在于，包括：
S1、通过微加工技术在第二基材的上表面制作培养主通道和缓冲通道；
S2、在第一基材或第二基材上制作进样口和出样口；
S3、将第一基材和第二基材上下对齐进行封合，获得研究细胞受创后细胞迁移生物学行为的微流控芯片。
9.一种基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，其特征在于，包括：
a）提供权利要求1所述的微流控芯片，从进样口加入细胞溶液并控制细胞溶液的流速，将细胞缓慢地植入培养主通道中，然后进行细胞培养，在培养主通道的内壁上形成细胞层；
b）在其中一进样口加入胰蛋白酶，同时在其相邻的进样口中加入细胞保护试剂，通过胰蛋白酶对细胞的消化作用，细胞层在胰蛋白酶和细胞保护试剂的接合处形成细胞伤口；
c）细胞伤口形成稳定后，在显微镜下观察细胞迁移的生物学行为。
10.根据权利要求9所述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，其特征在于：所述培养主通道于水平面内延伸，所述进样口沿竖直方向延伸，所述出样口沿竖直方向延伸，所述步骤a）中 ，通过控制进样口和出样口细胞溶液的液差高度，进而控制细胞溶液的流速。
11.根据权利要求9所述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，其特征在于：所述培养主通道于水平面内延伸，所述进样口沿竖直方向延伸，所述出样口沿竖直方向延伸，所述步骤b）中 ，通过控制进样口和出样口的液差高度，进而控制胰蛋白酶和细胞保护试剂的流速。
12.根据权利要求9所述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，其特征在于：所述细胞保护试剂为PBS缓冲液。
13.根据权利要求9所述的基于微流控芯片的细胞受创后细胞迁移生物学行为的监控方法，其特征在于：所述培养主通道的一端设有三个进样口，所述步骤b）中，位于中间的进样口加入细胞保护试剂，位于其两侧的进样口均加入胰蛋白酶。
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