CN105176817B - 一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法 - Google Patents

一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法和使用方法，本发明涉及一种自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法。本发明的目的是为了解决传统生物技术的细胞培养和微流控芯片技术相结合制备的细胞生物反应器存在加工和控制困难且不耐用的问题。本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器包括氧化铟锡导电玻璃(ITO)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)层。制备方法：一、氧化铟锡导电玻璃的电极刻蚀；二、浇铸聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道；三、聚二甲基硅氧烷(PDMS)层与氧化铟锡导电玻璃的键合。本发明设计的基于交流电热的流体自循环芯片有效的填补了微流控芯片集成微型泵的技术难题，开发了一款结构简单、寿命长、控制方便的芯片集成微型泵。

Description

一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器及其制备方法和 使用方法
技术领域：
本发明涉及一种自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法。
背景技术：
目前，一种新药物从开发到成功问世，需要耗时15年、耗资8亿美元。药物的成功开发，一方面需要对患者的病情进行针对性的治疗，另一方面还要承担副作用的风险。首先，由科研小组研究病情并作生物化学分析等实验，确定药物成分。接着，用饱受伦理争议的活体动物进行药物实验。如果成功，将进行临床测试。人类与动物的生理差异很难保证动物测试的结果与临床结果相吻合。如果临床实验失败，一方面推翻原有的实验结论，要重新进行研发、测试，另一方面，临床测试往往对临床试验者带来一定的危险性。
微流控芯片利用对微尺度下流体的控制，把传统的生物、医学、化学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，可以实现对微观流体、细胞、蛋白质、核酸及其他微纳粒子的操控和高效分析，具有消耗样品少、分析速度快、自动化程度高等优点，非常适合用于细胞分析、疾病的快速诊断等领域。随着微机电加工技术的迅猛发展，微纳尺度电极和通道的加工已经比较成熟。在微纳尺度下，分子扩散的距离大大缩短，能将传统需要一天多时间的生物化学反应缩短到几十分钟，用于药物测试及疾病诊断的微流控芯片也应运而生，极大程度地减少了药物开发的时间与成本。传统的药物开发具有投资大、过程长等特点。
流体的交流电动技术主要包括交流电渗技术与交流电热技术。其中，交流电渗技术主要适用于电导率较低(即溶液离子浓度低)的流体；交流电热技术是靠电场与温度梯度相互作用而驱动流体，适用于电导率较高的流体，如生物流体等。
近几年，随着微流控芯片技术的发展，基于生物科学和生物技术的细胞培养已经和微流控芯片技术相结合，从而提出了“器官芯片”及“人体芯片”等概念并进行相应研究。然而，对于复杂的“人体芯片”流体自循环系统，其动力来源一直是困扰各国学者的主要难题。就现有文献而言，利用PDMS薄膜制成的微型蠕动泵是其运转的主要方式，但这种泵加工及控制困难，且使用寿命只有几天，甚至几小时。
发明内容：
本发明的目的是为了解决传统生物技术的细胞培养和微流控芯片技术相结合制备的细胞生物反应器存在加工和控制困难且不耐用的问题，提供了一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器及其制备方法和使用方法。
本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器包括氧化铟锡导电玻璃和聚二甲基硅氧烷层，所述聚二甲基硅氧烷层的下表面键合在氧化铟锡导电玻璃的上表面上；
所述氧化铟锡导电玻璃上表面的一半面分布有外侧通电电极、内侧通电电极、三组宽电极和三组窄电极；所述外侧通电电极位于氧化铟锡导电玻璃的一个角上，通过一根导线连接交流电给有刻蚀电极的方环形流体通道外侧区域加电；所述内侧通电电极位于三组宽电极和三组窄电极的中间，每组宽电极都与一组窄电极夹杂在一起形成每个宽电极与一个窄电极成对间隔排列，三组宽电极和三组窄电极沿环形排列且按照顺时针方向每对宽电极与窄电极之间排列的次序是相同的，外侧通电电极与每个宽电极相连接，内侧通电电极与每个窄电极相连接；三组宽电极和三组窄电极沿环形排列且按照顺时针方向每对宽电极与窄电极之间排列的次序是相同的可使液体成一个方向循环流动；
所述聚二甲基硅氧烷层下表面开有一个方环形流体通道，三组宽电极和三组窄电极分别位于方环形流体通道的相邻三个边的下方；在与氧化铟锡导电玻璃的接触面上没有刻蚀电极的方环形流体通道的一条边上设置有细胞培养室，用来培养细胞；在与氧化铟锡导电玻璃的接触面上有刻蚀电极的方环形流体通道的一条边上设置有细胞培养液注入室，用来加入细胞培养液；所述的细胞培养室是一个圆柱形通孔且上面有一个盖子，防止培养液过量蒸发；所述的细胞培养液注入室是一个圆柱形通孔。
本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法按以下步骤进行制备：
一、氧化铟锡导电玻璃的电极刻蚀
首先，将负性光刻胶干膜利用照片塑封机压紧于镀有100nm～300nm厚氧化铟锡电极层的氧化铟锡导电玻璃上，再把经AutoCAD软件辅助设计并打印好的掩膜贴在负性光刻胶干膜上，然后将贴好的负性光刻胶干膜的氧化铟锡导电玻璃放入紫外曝光机内进行选择性曝光25s～40s；曝光后将氧化铟锡导电玻璃放入质量分数为4％～5％的Na2CO3水溶液中显影2min～4min，洗去未曝光的部分；显影后，将氧化铟锡导电玻璃浸泡在质量分数为15～25％的浓盐酸中30min～45min，腐蚀裸露在外面的氧化铟锡电极层；腐蚀完后，用丙酮溶液浸泡氧化铟锡导电玻璃，去除作为保护层的负性光刻胶干膜，可得到镀有相应电极形状的氧化铟锡导电玻璃(ITO)；
二、浇铸聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道
将1mm～2mm厚聚甲基丙烯酸甲酯薄板经激光雕刻机刻制成相应通道形状，并用胶水粘在玻璃片上，再将固化剂与聚二甲基硅氧烷(PDMS)的预聚物充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯薄板模具上，真空干燥箱脱气15min～30min，至没有气泡产生后，放置在80℃～90℃的恒温箱中固化1h～2h；然后取出聚二甲基硅氧烷(PDMS)层，利用打孔器对聚二甲基硅氧烷(PDMS)层打两个孔，其中一个孔为细胞培养室，另一个孔为细胞培养液注入室；另制备一块边长为12mm～15mm的正方形，厚度为2mm～3mm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片盖在细胞培养室上，目的是防止培养液过量的蒸发；
三、聚二甲基硅氧烷(PDMS)层与氧化铟锡导电玻璃的键合
将步骤二制备好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层的方环形流体通道与空气接触的一侧放置在氧化铟锡导电玻璃上，经等离子机处理后，键合成一体，形成完整的生物反应器。
本发明的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的使用方法按以下步骤进行：
一、将整个细胞生物反应器放入质量分数为60％～80％的酒精浸泡1h～1.5h，然后用磷酸盐溶液清洗2次～5次，再将整个细胞生物反应器和培养皿置于细胞培养无菌操作台中经紫外消毒1h～1.5h；
二、将细胞生物反应器置于培养皿内，向细胞生物反应器中的细胞培养室内加入细胞并向细胞培养液注入室添加细胞培养液；
三、通过两根导线将细胞生物反应器中的内侧通电电极和外侧通电电极连接至正弦交流信号发生器上，调节信号发生器输出电压振幅1V～5V，频率500KHz～10MHz，即可完成驱动；将细胞生物反应器放入二氧化碳孵化箱中，36℃～38℃培养，CO2的浓度为4％～6％。
本发明的原理：当对溶液中施加交流电场时，电场作用于高电导率的流体而产生焦耳热，在焦耳热的作用下，溶液产生不均匀的温升，形成了温度梯度，从而产生了电导率梯度与介电梯度，并产生自由电荷。自由电荷在非均匀电场的作用下生成流体驱动的体积力，诱导出电热流。根据这一操控手段，在芯片上适当的位置布置相应的微尺度电极，使成对的电极按一个方向排列，对电极施加相应的电信号，可驱动流体定向流动，达到泵送效果。
本发明相对于现有技术其优点在于：
1.本发明设计的基于交流电热的流体自循环芯片有效的填补了微流控芯片集成微型泵的技术难题，开发了一款结构简单、寿命长、控制方便的芯片集成微型泵。
2.本发明制备的细胞生物反应器实现了细胞自动连续的培养，节省了人力。本发明的细胞生物反应器制备方法简单且操作简便，更利于其在工业及实验室上应用。
3.本发明将细胞培养室远离细胞泵送区域，减小或避免了交流电热升温对细胞带来的伤害。
附图说明：
图1为本发明制备的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的俯视图。
图2为为本发明制备的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的侧视图。
图3为本发明制备的基于交流电热的自循环细胞生物反应器中的氧化铟锡导电玻璃(ITO)电极的局部放大图。
图4为本发明制备的氧化铟锡导电玻璃的电极刻蚀示意图。
具体实施方式：
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的基于交流电热的自循环细胞生物反应器，其特征在于：该自循环细胞生物反应器包括氧化铟锡导电玻璃1和聚二甲基硅氧烷层2，所述聚二甲基硅氧烷层2的下表面键合在氧化铟锡导电玻璃1的上表面上；
所述氧化铟锡导电玻璃1上表面的一半面分布有外侧通电电极1-1、内侧通电电极1-2、三组宽电极和三组窄电极；所述外侧通电电极1-1位于氧化铟锡导电玻璃1的一个角上，通过一根导线连接交流电给有刻蚀电极的方环形流体通道2-1外侧区域加电；所述内侧通电电极1-2位于三组宽电极和三组窄电极的中间，通过一根导线连接交流电给有刻蚀电极的方环形流体通道2-1内侧区域加电；每组宽电极都与一组窄电极夹杂在一起形成每个宽电极1-3与一个窄电极1-4成对间隔排列，三组宽电极和三组窄电极沿环形排列且按照顺时针方向每对宽电极与窄电极之间排列的次序是相同的，外侧通电电极1-1与每个宽电极1-3相连接，内侧通电电极1-2与每个窄电极1-4相连接；
所述聚二甲基硅氧烷层2下表面开有一个方环形流体通道2-1，三组宽电极和三组窄电极分别位于方环形流体通道2-1的相邻三个边的下方；在与氧化铟锡导电玻璃1的接触面上没有刻蚀电极的方环形流体通道2-1的一条边上设置有细胞培养室2-2，用来培养细胞；在与氧化铟锡导电玻璃1的接触面上有刻蚀电极的方环形流体通道2-1的一条边上设置有细胞培养液注入室2-3，用来加入细胞培养液；所述的细胞培养室2-2是一个圆柱形通孔且上面有一个盖子3，防止培养液过量蒸发；所述的细胞培养液注入室2-3是一个圆柱形通孔。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的氧化铟锡导电玻璃(ITO)1的厚度为0.4mm～1.2mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的宽电极1-3与窄电极1-4总对数为30～50对，每对宽度分别为50um～120um和250um～600um，两个电极的间隙为50um～120um。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的方环形流体通道2-1的厚度为3mm～8mm、宽度为2mm～3mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的细胞培养室2-2的直径为8mm～12mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述的细胞培养液注入室2-3的直径为3mm～8mm。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是，细胞培养液注入室2-3中的细胞培养液为8％～10％的牛胚胎血清(FBS)和0.8％～1.2％的青霉素-链霉素。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法，其特征在于：该自循环细胞生物反应器的制备方法按以下步骤制备:
一、氧化铟锡导电玻璃的电极刻蚀
首先，将负性光刻胶干膜6利用照片塑封机压紧于镀有100nm～300nm厚氧化铟锡电极层5的氧化铟锡导电玻璃1上，再把经AutoCAD软件辅助设计并打印好的掩膜7贴在负性光刻胶干膜6上，然后将贴好的负性光刻胶干膜6的氧化铟锡导电玻璃1放入紫外曝光机内进行选择性曝光25s～40s；曝光后将氧化铟锡导电玻璃1放入质量分数为4％～5％的Na2CO3水溶液中显影2min～4min，洗去未曝光的部分；显影后，将氧化铟锡导电玻璃1浸泡在质量分数为15～25％的浓盐酸中30min～45min，腐蚀裸露在外面的氧化铟锡电极层5；腐蚀完后，用丙酮溶液浸泡氧化铟锡导电玻璃1，去除作为保护层的负性光刻胶干膜6，可得到镀有相应电极形状的氧化铟锡导电玻璃(ITO)1；
二、浇铸聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道
将1mm～2mm厚聚甲基丙烯酸甲酯薄板经激光雕刻机刻制成相应通道形状，并用胶水粘在玻璃片上，再将固化剂与聚二甲基硅氧烷(PDMS)的预聚物充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯薄板模具上，真空干燥箱脱气15min～30min，至没有气泡产生后，放置在80℃～90℃的恒温箱中固化1h～2h；然后取出聚二甲基硅氧烷(PDMS)层，利用打孔器对聚二甲基硅氧烷(PDMS)层打两个圆柱形孔，其中一个孔为细胞培养室2-2另一个孔为细胞培养液注入室2-3；另制备一块边长为12～15mm的正方形，厚度为2～3mm的盖子3聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片盖在细胞培养室2-2上，目的是防止培养液过量的蒸发；
三、聚二甲基硅氧烷(PDMS)层与氧化铟锡导电玻璃的键合
将步骤二制备好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层2的方环形流体通道2-1与空气接触的一侧放置在氧化铟锡导电玻璃1上，经等离子机处理后，键合成一体，形成完整的生物反应器。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤一中所述Na2CO3的质量分数为4.5％。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤一中所述显影的时间为3min。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤一中浓盐酸的质量分数为20％，浸泡的时间为40min。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中所述的固化剂和PDMS的预聚物为灌封胶(DC184)。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中所述的固化剂与PDMS的预聚物按质量比为1：(9～11)混合。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中所述的真空干燥箱脱气的时间为25min。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中所述的恒温箱中固化的温度为80℃，时间为1.5h。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中细胞培养室2-2的直径为8mm～12mm。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中所述的细胞培养液存储室2-3的直径为3～8mm。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中所述的盖子3为聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄片。其他步骤与参数与具体实施方式八相同。
具体实施方式十九：本实施方式的基于交流电热的自循环细胞生物反应器的使用方法，其特征在于：该自循环细胞生物反应器的使用方法按以下步骤进行:
一、将整个细胞生物反应器放入质量分数为60％～80％的酒精浸泡1h～1.5h，然后用磷酸盐溶液清洗2次～5次，再将整个细胞生物反应器和培养皿置于细胞培养无菌操作台中经紫外消毒1h～1.5h；
二、将细胞生物反应器置于培养皿内，向细胞生物反应器中的细胞培养室2-2内加入细胞并向细胞培养液注入室2-3添加培养液；
三、通过两根导线将细胞生物反应器中的内侧通电电极1-2和外侧通电电极1-1连接至正弦交流信号发生器上，调节信号发生器输出电压振幅1V～5V，频率500KHz～10MHz，即可完成驱动；将细胞生物反应器放入二氧化碳孵化箱中，36℃～38℃培养，CO2的浓度为4％～6％。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十九不同的是，步骤一中酒精的质量分数为75％。其他步骤与参数与具体实施方式十九相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十九不同的是，步骤二中向细胞培养液存储室添加培养液，其中培养液为8％～10％的牛胚胎血清(FBS)和0.8％～1.2％的青霉素-链霉素。其他步骤与参数与具体实施方式十九相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式十九不同的是，步骤三中将细胞生物反应器放入二氧化碳孵化箱中，培养的温度为37℃，CO2的浓度为5％。其他步骤与参数与具体实施方式十九相同。
实施例1：检验芯片的驱动属性
根据交流电热理论，电热流速度，不仅与施加交流电的电压与频率有关，而且与溶液自身的电导率有关。用电导率仪测量多种培养液的电导率。结果显示，细胞培养液的电导率为1.5S/m～2.0S/m。为研究芯片的驱动属性，实验调配了电导率为1.5S/m、1.7S/m及2.0S/m三种KCl水溶液作为驱动流体。为计算流体速度，将大量直径0.5μm的荧光微球(69A1-2，Molecular Probes公司，美国)混入溶液，对芯片施加峰值为2.5～5V，频率为1MHz的正弦交流电，用荧光显微镜及高清摄影机拍摄荧光微球的运动情况。对视频进行按帧打散计算出荧光微球的运动速率，来估算流体的驱动速率。
实验结果表明：
1.随着电导率的升高，流体的驱动速度略有升高；
2.随着施加电压的升高，流体的驱动速度有显著的升高；
3.电导率为2.0S/m的KCl溶液在5V的电压驱动下，流体驱动速率可达20±1.7μm/s，通道的宽度和高度为毫米级别，故流体的流量满足基本灌注培养的要求。
实施例2：检验热效应是否对细胞产生伤害
将用去离子水配制好的电导率为2.0S/m的KCl水溶液(性质与细胞培养液类似)取400μl注入生物反应器，将双通道的商业热电偶温度传感器的2个电极分别放入细胞培养室与培养液存储室中，确保电极工作端浸没入液体中。将芯片放入37摄氏度的二氧化碳孵化箱中，静止45min～1h后，对芯片施加幅值为2.5V，频率为1MHz的正弦交流电，静止45min～1h后读出温度传感器双通道的温度实数并记录数据，每5分钟后读一次，共10次，计算平均值。接着，将电压幅值分别调制3V、3.5V、4V、4.5V及5V，分别重复上述实验过程，并记录实验数据。
实验结果表明，2.5V～5V电压下细胞培养室的温度为36.8～37.1℃，而2.5V～5V电压下培养液存储室内的温度从37.1±0.1℃逐渐上升至39.5±0.2℃。结果一方面揭示了，电热流产生的热效应，会使周围溶液产生温升；另一方面，经过对芯片的设计与电极的合理布局，5V电压以下的细胞培养室温度不会对细胞产生伤害。
实施例3：细胞培养的性质
实验选用人类肾脏胚胎细胞HEK293T与人类结肠癌细胞SW620分别放入芯片中培养。两种细胞分别为人类正常功能的细胞与人类该细胞的代表。细胞培养液选用美国LifeTechnologies公司生产的DMEM培养液。培养液中配入体积比10％的牛胚胎血清(FBS)提供营养及1％的青霉素-链霉素避免染菌。接种细胞时，首先将400μl配置好的培养液注入生物反应器内。将高浓度混合有细胞的培养液(100,000个细胞在10μl培养液中)小心滴入细胞培养室，并用移液器头轻轻搅拌，目的是防止过多细胞因为流体流动接种到通道中。接着，将芯片放入美国康能公司生产的4英寸培养皿中，提供无菌环境，并放入二氧化碳孵化箱中，4～6h待细胞铁壁生长后，施加幅值3V，频率1MHz的交流电驱动培养液流动。在美国Corning公司生产的48孔板中接种同样浓度的细胞作为对照组实验。实验组与对照组每24h更换一次培养液，并对细胞拍照进行数量统计。经过72h的培养，实验组的细胞与对照组的细胞生长形态一致，均生长良好，表明了交流电热自循环芯片对细胞没有伤害作用。HEK293T细胞实验组与对照组的72h的细胞增值率分别为332±9.7％与327±12.1％；SW620实验组与对照组的72h的细胞增值率分别为386±16.3％与384±14.2％。结果表明，细胞经静态培养与流体培养均生长良好，生产率略高。由于细胞有一定适应环境的能力，所以微弱的改变流体环境对生长率影响不十分明显。但是，本芯片为细胞的流体养殖提供了一种新型的驱动方式，为实现复杂的微流控器官芯片实验室或人体芯片实验室提供了一项重要的技术支持。

Claims (5)

1.一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法，其特征在于：所述的一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法按以下步骤制备：一、氧化铟锡导电玻璃的电极刻蚀
首先，将负性光刻胶干膜(6)利用照片塑封机压紧于镀有100nm～300nm厚氧化铟锡电极层(5)的氧化铟锡导电玻璃(1)上，再把经AutoCAD软件辅助设计并打印好的掩膜(7)贴在负性光刻胶干膜(6)上，然后将贴好的负性光刻胶干膜(6)的氧化铟锡导电玻璃(1)放入紫外曝光机内进行选择性曝光25s～40s；曝光后将氧化铟锡导电玻璃(1)放入质量分数为4％～5％的Na2CO3水溶液中显影2min～4min，洗去未曝光的部分；显影后，将氧化铟锡导电玻璃(1)浸泡在质量分数为15～25％的浓盐酸中30min～45min，腐蚀裸露在外面的氧化铟锡电极层(5)；腐蚀完后，用丙酮溶液浸泡氧化铟锡导电玻璃(1)，去除作为保护层的负性光刻胶干膜(6)，可得到镀有相应电极形状的氧化铟锡导电玻璃(1)；
二、浇铸聚二甲基硅氧烷通道
将1mm～2mm厚聚甲基丙烯酸甲酯薄板经激光雕刻机刻制成相应通道形状，并用胶水粘在玻璃片上，再将固化剂与聚二甲基硅氧烷的预聚物充分混合后浇灌于聚甲基丙烯酸甲酯薄板模具上，真空干燥箱脱气15min～30min，至没有气泡产生，然后放置在80℃～90℃的恒温箱中固化1h～2h；然后取出聚二甲基硅氧烷层，利用打孔器对聚二甲基硅氧烷层打两个圆柱形孔，其中一个孔为细胞培养室(2-2)另一个孔为细胞培养液注入室(2-3)；另制备一块边长为12mm～15mm的正方形，厚度为2mm～3mm的盖子(3)盖在细胞培养室(2-2)上；
三、聚二甲基硅氧烷层与氧化铟锡导电玻璃的键合
将步骤二制备好的聚二甲基硅氧烷层(2)的方环形流体通道(2-1)与空气接触的一侧放置在氧化铟锡导电玻璃(1)上，经等离子机处理后，键合成一体，形成完整的生物反应器；
所述的基于交流电热的自循环细胞生物反应器包括氧化铟锡导电玻璃(1)和聚二甲基硅氧烷层(2)，所述聚二甲基硅氧烷层(2)的下表面键合在氧化铟锡导电玻璃(1)的上表面上；
所述氧化铟锡导电玻璃(1)上表面的一半面分布有外侧通电电极(1-1)、内侧通电电极(1-2)、三组宽电极和三组窄电极；所述外侧通电电极(1-1)位于氧化铟锡导电玻璃(1)的一个角上；所述内侧通电电极(1-2)位于三组宽电极和三组窄电极的中间；每组宽电极都与一组窄电极夹杂在一起形成每个宽电极(1-3)与一个窄电极(1-4)成对间隔排列，三组宽电极和三组窄电极沿环形排列且按照顺时针方向每对宽电极与窄电极之间排列的次序是相同的，外侧通电电极(1-1)与每个宽电极(1-3)相连接，内侧通电电极(1-2)与每个窄电极(1-4)相连接；
所述聚二甲基硅氧烷层(2)下表面开有一个方环形流体通道(2-1)，三组宽电极和三组窄电极分别位于方环形流体通道(2-1)的相邻三个边的下方；在与氧化铟锡导电玻璃(1)的接触面上没有刻蚀电极的方环形流体通道(2-1)的一条边上设置有细胞培养室(2-2)，在与氧化铟锡导电玻璃(1)的接触面上有刻蚀电极的方环形流体通道(2-1)的一条边上设置有细胞培养液注入室(2-3)，所述的细胞培养室(2-2)是一个圆柱形通孔且上面有一个盖子(3)；所述的细胞培养液注入室(2-3)是一个圆柱形通孔；
所述的宽电极(1-3)与窄电极(1-4)总对数为30～50对，每对宽度分别为50μm～120μm和250μm～600μm，两个电极的间隙为50μm～120μm；
所述的方环形流体通道(2-1)的厚度为3mm～8mm、宽度为2mm～3mm；
所述的细胞培养室(2-2)的直径为8mm～12mm；
所述的细胞培养液注入室(2-3)的直径为3～8mm。
2.根据权利要求1所述的一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法，其特征在于：步骤二中所述的固化剂和聚二甲基硅氧烷的预聚物为灌封胶。
3.根据权利要求1所述的一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的制备方法，其特征在于：步骤二中所述的盖子(3)为聚二甲基硅氧烷薄片。
4.如权利要求1所述的一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的使用方法，其特征在于：所述的一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的使用方法按以下步骤进行：
一、将整个细胞生物反应器放入质量分数为60％～80％的酒精浸泡1h～1.5h，然后用磷酸盐溶液清洗2次～5次，再将整个细胞生物反应器和培养皿置于细胞培养无菌操作台中经紫外消毒1h～1.5h；
二、将细胞生物反应器置于培养皿内，向细胞生物反应器中的细胞培养室(2-2)内加入细胞并向细胞培养液注入室(2-3)添加细胞培养液；
三、通过两根导线将细胞生物反应器中的内侧通电电极(1-2)和外侧通电电极(1-1)连接至正弦交流信号发生器上，调节信号发生器输出电压振幅1V～5V，频率500KHz～10MHz，即可完成驱动；将细胞生物反应器放入二氧化碳孵化箱中，36℃～38℃培养，CO2的浓度为4％～6％。
5.根据权利要求4所述的一种基于交流电热的自循环细胞生物反应器的使用方法，其特征在于：步骤二中向细胞培养液注入室(2-3)添加细胞培养液，其中细胞培养液为8％～10％的牛胚胎血清和0.8％～1.2％的青霉素-链霉素的混合物。
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