CN110713923B - 微流控芯片装置及其在癌细胞迁移分析中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微流控技术领域，具体提供一种微流控芯片装置及其在癌细胞迁移分析中的应用。该微流控芯片装置开设有若干进样口、第一汇流腔室、若干细胞捕获室、若干并排的迁移直线通道、第二汇流腔室、若干出样口；每个进样口均与第一汇流腔室连通；第一汇流腔室上开设有若干与细胞捕获室相对应连通的捕获室进口；每个细胞捕获室底部开设有能使细胞进入迁移直线通道前端的贯通口；每条迁移直线通道的末端均与第二汇流腔室连通，同时每个出样口均与所述第二汇流腔室连通。本发明的微流控芯片装置具有通量高、捕获准确、追踪效果好等特点。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术领域，具体涉及一种微流控芯片装置及其在癌细胞迁移分析中的应用。
背景技术
肿瘤转移已经成为癌症治疗失败和患者死亡的主要原因，恶性肿瘤细胞的转移是其区别于正常细胞的特征之一，不同肿瘤细胞转移能力不同，而同一种肿瘤细胞也存在具有不同转移潜能的亚群，同时还存在转移的器官特异性。由此可见，肿瘤转移是一个极其复杂的过程，涉及多步骤、多阶段、多基因等，不但包括肿瘤细胞本身的特征变化，还包括宿主环境的变化。肿瘤微环境是一个动态网络，它包括肿瘤细胞、细胞外基质和间质组织等，这些是影响肿瘤转移的关键因素。肿瘤转移不但涉及原发肿瘤部位微环境的改变，而且还包括肿瘤细胞对继发转移部位微环境的适应。
传统的细胞学研究依赖于大量细胞(103～104个)，将群体值作为反应结果，但相同状态下的细胞在表型和基因型方面也存在异质性。通过细胞群体分析获得的统计平均结果掩盖了单个细胞之间的差异。随着精准医疗发展和生命研究的微观化，细胞群体的研究方法已明显不适用于肿瘤异质性、早期胚胎发育等重要领域，为此单个细胞的研究呼之欲出，成为科学家的一致性诉求，原因如下：
(1)临床样本也存在很大的异质性，只有单细胞分析才能有效揭示这种异质性；
(2)很多临床样本量及其有限，极端情况下甚至只有一个细胞可供检测，单细胞检测是唯一可行的方法；
(3)临床样本都是来自人的样本，和实验动物不同，对于人所能用的研究方法受到很大限制，因此要求研究者在有限的样本中尽量多的获取数据，而多参数单细胞分析恰恰满足了这种需要。
由此引入单细胞分析(single cell analysis)概念，即对单个细胞进行较多参数的分析，来研究细胞异质性。近几年，随着相关领域的一系列技术突破，“单细胞分析”的概念才真正得以实现。两类技术在这过程中起到了先导作用，首先是测序技术的进步，以illumina为代表的第二代测序技术大大降低了测序成本，使在一个实验中对多个样本测序成为可能；其次，一些可以用于单细胞核酸样本的扩增技术(例如MDA扩增基因组，SMART、TargetAmp可以扩增转录组)的开发，解决了单细胞核酸样品量少的问题。后来，随着基于微流体芯片技术的广泛应用，微流控芯片具有高通量、低消耗、微型化、集成化和大规模平行处理等特点，可以通过重力、磁力、流体力等实现对单细胞的捕获，准确地操作分析微量样品，从而为单细胞的研究提供平台。单细胞分析开始向自动化、更多细胞通量的方向发展。
尽管单细胞分析研究已被认为是21世纪生命科学研究的重要突破口，但是将单个细胞作为分析对象时，检测平台的构建目前面临以下4方面的巨大挑战：
(1)由于单细胞体积小(微米级)，胞内分析物的尺寸更小(亚微米级甚至纳米级)且浓度极低，这就要求检测平台不但具有较强的分离与操控单个细胞的能力，而且应当具有较高的检测灵敏度；
(2)为了能够有效地分析单细胞间的异质性以及得到具有统计学意义的数据，往往需要检测平台能够同时分析大量单细胞，即具有高通量和快速检测的能力；
(3)在一些动态观察和分析单细胞的荧光、形态等研究需求中，检测平台应当具有实时显微观察的功能；
(4)因需要分析与检测的细胞数量通常很大，检测及分析技术的开发应以简单易行、经济实惠为前提，以提高其在应用时的普适性。
此外，单细胞分析具有学科交叉性强的特点，因此，在众多诸如生物学、物理学、材料学及计算机学等领域的科研工作者的共同努力下发展了很多单细胞分析技术，包括流式细胞仪、荧光显微成像技术和毛细管电泳技术等。这些技术的出现已经使单细胞研究进入到了分子结构的水平，但是这些方法均存在着一些不足，如：虽然流式细胞术是目前用于高通量表征单个细胞活动的最先进的技术，但它并不具有操控某个特定目标细胞或者是动态跟踪观察单个细胞的能力。而其他单细胞分析的方法，包括显微成像、毛细管电泳等，虽然可以精准分析单细胞的组分和结构，但是检测通量较低。
发明内容
针对目前单细胞分析无法同时兼顾捕获并动态跟踪单个细胞和高通量等问题，本发明提供一种微流控芯片装置及其在癌细胞迁移分析中的应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种微流控芯片装置，该微流控芯片装置为透明材质，开设有若干进样口、第一汇流腔室、若干细胞捕获室、若干并排的迁移直线通道、第二汇流腔室、若干出样口；
每个所述进样口均与所述第一汇流腔室连通，以实现将样品通入第一汇流腔室中待捕获；所述第一汇流腔室上开设有若干与所述细胞捕获室相对应连通的捕获室进口，以实现样品进入每个所述细胞捕获室中；
每个所述细胞捕获室底部开设有能使细胞进入所述迁移直线通道前端的贯通口；
每条所述迁移直线通道的末端均与所述第二汇流腔室连通，同时每个所述出样口均与所述第二汇流腔室连通以实现样品的排出。
相应地，如上所述的微流控芯片装置在癌细胞迁移分析中的应用。
本发明的技术效果为：
相对于现有技术，本发明上述提供的微流控芯片装置，可以通过多个细胞捕获室对癌细胞进行同时捕获，被捕获的癌细胞通过迁移直线通道时，可以由显微镜观察单个或多个细胞的迁移情况，该装置具有通量高、捕获准确、追踪效果好等特点。
本发明提供的微流控芯片装置在癌细胞迁移分析中的应用，可以实现高通量、精准捕获以及实时观察癌细胞迁移的特点，可以准确地获取癌细胞迁移数据以进行研究分析或者给出医疗建议。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的微流控芯片装置结构俯视示意图；
图2为本发明提供的微流控芯片装置结构前视示意图；
图3为沿图1中A-A剖面线剖切得到的剖视示意图；
图4为沿图2中B-B剖面线剖切得到的剖视示意图；
图5为沿图2中C-C剖面线剖切得到的剖视示意图；
其中，100-微流控芯片装置；
11-进样口，12-第一汇流腔室，13-捕获室进口，14-细胞捕获室，15-贯通口，16-迁移直线通道，17-第二汇流腔室，18-出样口；
W表示迁移直线宽度，H表示迁移直线高度，L表示迁移直线长度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1～5，本发明提供一种微流控芯片装置100。
本发明微流控芯片装置100采用透明材质制成，比如透明材质可以是聚二甲基硅氧烷。本发明微流控芯片装置100开设有若干进样口11、第一汇流腔室12、细胞捕获室14、若干并排的迁移直线通道16、第二汇流腔室17、若干出样口18。
具体来说，每个进样口11均与第一汇流腔室12连通，从而实现向微流控芯片装置100中注入样品，以便于对样品进行研究分析。
第一汇流腔室12上开设有若干捕获室进口13，每个捕获室进口13对应连通一个细胞捕获室14，每个微流控芯片装置100的若干捕获室进口13可以有不同的宽度，有的捕获室进口13只允许单个细胞进入，有的捕获室进口13允许多个细胞同时进入，捕获室进口13的大小根据允许进入的细胞的大小以及允许同时进入的细胞的数量而定，从而实现第一汇流腔室12中的样品进入细胞捕获室14。
在每个细胞捕获室14的底部均开设有贯通口15，每个贯通口15均与对应的迁移直线管道16的前端连通，从而实现细胞捕获室14捕获的细胞进入迁移直线通道16，从而实现对捕获的细胞的追踪观察研究分析。即细胞捕获室14与迁移直线通道16之间应当有落差，细胞捕获室14的底部即为迁移直线通道16的顶端，由此细胞捕获室14的细胞可以实现自由落入迁移直线通道16中。
为了便于说明本发明迁移直线通道16，将迁移直线通道16的两端分别定义为前端和末端，前端为与细胞捕获室14连通的一端，末端为与第二汇流腔室17连通的一端。每条迁移直线通道16具有长L、宽W、高H三个参数。
每个微流控芯片装置100的若干迁移直线通道16中，可以是限制通道，或者半限制通道，或者无限制通道。其中，限制通道的高度小于细胞粒径的一半，而半限制通道的高度小于细胞粒径，无限制通道的高度大于细胞粒径。
优选地，无论是限制通道还是半限制通道还是无限制通道，它们的长度L均不短于1000μm，宽度W均不窄于50μm，如果长度短于1000μm，则细胞迁移速度过快，来不及观察其运动状态，无法获得迁移能力等数据，就已经进入
第二汇流腔室17中。而如果迁移直线通道16的宽度窄于50μm，则不便于对细胞迁移的自然状态进行观察。
进一步优选地，所述迁移直线通道的长度为(1000～10000)μm，宽度为(50～200)μm，长度过长或者宽度过大，对于观察细胞迁移情况没有起到促进作用，还会导致材料的浪费和空间的浪费。
优选地，所述限制通道的高度为(5～10)μm，所述半限制通道的高度为(10～20)μm，所述无限制通道的高度为(23～30)μm。
进一步优选地，所述限制通道的高度为6μm，所述半限制通道的高度为13μm，所述无限制通道的高度为24μm。
优选地，每个所述微流控芯片装置100中的迁移直线通道16可以是限制通道，或者半限制通道，或者无限制通道，同一块微流控芯片100上只包含一种迁移直线通道。每条迁移直线通道16的末端与第二汇流腔室17连通，从而实现各条迁移直线通道16排出的细胞以及液体汇合并经出样口18排出。
本发明的微流控芯片装置100的各个部件之间为一体成型结构，即进样口11设置在微流控芯片装置100的表面，进样口11、第一汇流腔室12、捕获室进口13、细胞捕获室14、贯通口15、迁移直线通道16、第二汇流腔室17、出样口18一体化成型连通。
本发明微流控芯片装置100上多个细胞捕获室14能对癌(肿瘤)细胞进行同时捕获，根据细胞捕获进口13的宽度大小，有些细胞捕获室14能捕获单个细胞，有些细胞捕获室14能捕获多个细胞，癌(肿瘤)细胞总的捕获率超过75％，其中细胞捕获室14捕获单个细胞的捕获率接近40％。部分癌(肿瘤)细胞能通过贯通口15进入迁移直线通道16。由于细胞捕获室14和迁移直线通道16的细微尺寸，单个微流控芯片100上能兼容多个细胞捕获室14和多条迁移直线通道16，加入细胞液后，多个细胞捕获室14能同时对细胞进行捕获，进而同时观察多个细胞的迁移情况，具有高通量的特点。同时，由于细胞捕获室14和捕获进口13的结构设计，能对单个细胞的迁移情况进行研究，具有单细胞分析的特点。
而迁移直线通道16的不同高度设计，为癌(肿瘤)细胞迁移提供了多种不同的物理迁移环境，能够研究癌(肿瘤)细胞迁移的异质性，在细胞捕获室14捕获的单个癌(肿瘤)细胞中，有7％～16％往限制性通道迁移，有7％～14％往半限制性通道迁移，有6％～13％往无限制通道迁移。另外，由于微流控芯片装置100的结构特点，能用显微镜进行实时观察记录，从而能够分析细胞在不同时间段的迁移情况，实验过程中，随着时间推移，往迁移通道迁移的癌(肿瘤)细胞数量呈现上升趋势，这表明随着时间推移，癌(肿瘤)细胞能克服物理性障碍，获得迁移能力。
因此，本发明的微流控芯片装置100可以应用于在癌细胞迁移分析中。
具体来说，将本发明的微流控芯片装置100用在癌细胞迁移分析中时，包括以下步骤：
利用培养基对待分析的细胞进行培养；
采用注射泵将经过培养的所述细胞由所述微流控芯片装置100的若干进样口11注入所述微流控芯片装置100中，并将所述微流控芯片装置100置于显微镜下进行观察，获取细胞迁移数据。
上述待分析的细胞可以是各种类型的肿瘤细胞，如A549、H1975、H1299等。通过分析肿瘤细胞的迁移数据，可以获得肿瘤细胞转移的情况，分析不同表型的肿瘤细胞的迁移特点，并进而判断患者的癌变情况。
为更好的说明本发明的技术方案，下面通过例子做进一步的说明。
实施例1
一种利用图1～5所示的微流控芯片装置进行癌细胞迁移分析的实验，包括以下步骤：
使用体积分数为10％的胎牛血清(FBS)和体积分数为1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM作为培养基，对肿瘤细胞A549进行培养。
随后将培养得到的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况；
按照上述培养条件重复上述细胞培养，并将培养后的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为半限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况；
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具体观察结果如下：40％的细胞能被细胞捕获室捕获；被捕获的细胞中，16％的细胞会往限制性通道迁移，14％的细胞会往半限制性通道迁移，13％的细胞会往无限制通道迁移。在实时观察中发现，大约6小时后，细胞才会开始往迁移通道移动，往限制性通道迁移的细胞中，有20％的细胞会适应不了限制性通道的环境而往回迁移。
实施例2
一种利用图1～5所示的微流控芯片装置进行癌细胞迁移分析的实验，包括以下步骤：
使用体积分数为10％的胎牛血清(FBS)和体积分数为1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM作为培养基，对肿瘤细胞H1975进行培养。
随后将培养得到的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况；
按照上述培养条件重复上述细胞培养，并将培养后的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为半限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况；
按照上述培养条件重复上述细胞培养，并将培养后的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为无限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况。
具体观察结果如下：约40％的细胞能被细胞捕获室捕获；被捕获的细胞中，7％的细胞会往限制性通道迁移，7％的细胞会往半限制性通道迁移，7％的细胞会往无限制通道迁移。在实时观察中发现，大约6小时后，细胞才会开始往迁移通道移动，往限制性通道迁移的细胞中，有15％的细胞会适应不了限制性通道的环境而往回迁移。
实施例3
一种利用图1～5所示的微流控芯片装置进行癌细胞迁移分析的实验，包括以下步骤：
使用体积分数为10％的胎牛血清(FBS)和体积分数为1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM作为培养基，对肿瘤细胞H1299进行培养。
随后将培养得到的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况；
按照上述培养条件重复上述细胞培养，并将培养后的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为半限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况；
按照上述培养条件重复上述细胞培养，并将培养后的细胞连同培养液，自微流控芯片装置100(迁移直线通道为无限制性通道)的进样口11注入微流控芯片装置100中，并将该微流控芯片装置100置于显微镜中进行观察，观察捕获的单细胞的迁移情况。
具体观察结果如下：40％的细胞能被细胞捕获室捕获；被捕获的细胞中，10％的细胞会往限制性通道迁移，8％的细胞会往半限制性通道迁移，6％的细胞会往无限制通道迁移。在实时观察中发现，大约6小时后，细胞才会开始往迁移通道移动，往限制性通道迁移的细胞中，有18％的细胞会适应不了限制性通道的环境而往回迁移。
通过上述实施例1～3可知，通过本发明具有不同迁移直线通道的微流控芯片装置100，可以使得40％的细胞能被细胞捕获室捕获；而被捕获的细胞中，7％～16％的细胞会往限制性通道迁移，7％～14％的细胞会往半限制性通道迁移，6％～13％的细胞会往无限制通道迁移。在实时观察中发现，大约6小时后，细胞才会开始往迁移通道移动。往限制性通道迁移的细胞中，有15％～20％的细胞会适应不了限制性通道的环境而往回迁移。进入限制性通道的细胞比其他通道的细胞具有更快的迁移速度和更远的迁移距离。进入限制性通道的细胞比其他通道的细胞具有更好的柔性。限制性通道中的细胞表面形变长度是无限制通道中细胞的15倍。限制性通道中的细胞表面形变区域面积的最小值高于无限制通道中细胞表面形变区域面积的最高值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种微流控芯片装置，其特征在于，该微流控芯片装置由透明材质制成，开设有若干进样口、第一汇流腔室、若干细胞捕获室、若干并排的迁移直线通道、第二汇流腔室、若干出样口；
每个所述进样口均与所述第一汇流腔室连通，以实现将样品通入第一汇流腔室中待捕获；所述第一汇流腔室上开设有若干与所述细胞捕获室相对应连通的捕获室进口，以实现样品进入每个所述细胞捕获室中；
每个所述细胞捕获室底部开设有能使细胞进入所述迁移直线通道前端的贯通口，所述细胞捕获室与所述迁移直线通道之间有落差；
每条所述迁移直线通道的末端均与所述第二汇流腔室连通，同时每个所述出样口均与所述第二汇流腔室连通以实现样品的排出；
若干并排的所述迁移直线通道为限制通道或者半限制通道；
所述限制通道的高度为5～10μm；所述半限制通道的高度为10～20μm；
若干所述迁移直线通道的长度为1000～10000μm，宽度为50～200μm。
2.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述限制通道的高度为6μm；所述半限制通道的高度为13μm。
3.如权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述微流控芯片装置的材质为聚二甲基硅氧烷。
4.如权利要求1～3任一项所述的微流控芯片装置在癌细胞迁移分析中的应用。
5.如权利要求4所述的微流控芯片装置在癌细胞迁移分析中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
利用培养基对待分析的细胞进行培养；
将经过培养的所述细胞由所述微流控芯片装置的若干进样口注入所述微流控芯片装置中，并将所述微流控芯片装置置于显微镜下进行观察，获取细胞迁移数据。
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