CN113019485B - 微流控芯片、循环肿瘤细胞自动化分离检测系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片、循环肿瘤细胞自动化分离检测系统及方法。微流控芯片包括密度梯度离心组件、细胞捕获组件以及试剂存储组件；所述密度梯度离心组件用于对全血样本进行密度梯度离心以实现分离得到血浆层、单核细胞层、Ficoll液层、红细胞和粒细胞层，所述细胞捕获组件包括捕获通道以及连通所述捕获通道的捕获入口、捕获出口，所述捕获通道的内壁上设置具有多个捕获孔以及多个负压捕获腔室，各个所述捕获孔对应连通一个所述负压捕获腔室，所述试剂存储组件与所述捕获入口连通以用于存储染色液以及洗涤液。本发明在微流控芯片能够对外周血循环肿瘤细胞快速检测，有效降低了手工操作误差，降低试剂消耗，高通量完成样本检测。

Description

微流控芯片、循环肿瘤细胞自动化分离检测系统及方法
技术领域
本发明涉及细胞检测领域，特别是涉及一种微流控芯片、循环肿瘤细胞自动化分离检测系统及方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。大量研究资料证实血液中循环肿瘤细胞的快速检测，对肿瘤的检测、个体化治疗、疗效评估及预后监测等具有重要应用价值。相对于传统的影像学和病理学的肿瘤诊断方法，循环肿瘤细胞检测具有独特优势。首先，采用循环肿瘤细胞检测法能一次性同时筛查肺癌、胃癌、肝癌等大部分多种实体肿瘤，具有更大的检测范围。同时，只需验血，避免了类似穿刺活检的操作导致转移风险。另外特别地，在评估肿瘤治疗效果时，传统影像学手段一般需要几个月的时间，而循环肿瘤细胞可以快速评估治疗效果，在评估肿瘤治疗效果、调整治疗方案和监测肿瘤复发转移中，具有重大现实意义。目前临床公认的人外周血循环肿瘤细胞检测已被公认为最好检测手段之一。
膜滤法分离肿瘤细胞技术：原理是基于细胞大小，通过8μm孔径滤过膜过滤，使较小的淋巴细胞和中性粒细胞通过，将体积较大的CTC细胞阻留在膜上，从而保持了细胞的活性和完整性，以利于后续的检测技术。依据孔径大小进行区分，异常单核细胞及较小的循环肿瘤细胞都会影响最终的检测结果，同时孔径容易被细胞团堵塞。
密度梯度离心法：原理是利用配置的分离液密度将不同密度的细胞区分在不同区域。将外周血平铺于分离介质上层，离心作用加速度密度大于分离液的细胞沉降，而密度小于分离液的细胞则聚集于分离液上层，从而达到分离效果。常用的分离介质密度小于红细胞、粒细胞，离心后会沉降于管底；淋巴细胞和单核细胞密度小于或等于分离介质，离心后会漂浮于分离介质上层或悬浮于介质中，肿瘤细胞也是留存于单核细胞富集层。肿瘤细胞存在于单核细胞层，在提取进行分离时会有大量单核细胞干扰检测，同时提取的量相对较少，因此CTC的富集及鉴别都相对困难。
免疫捕获及检测法：原理是将特异性抗原或抗体包被在固相载体中，包括磁珠，微球，微柱等，当外周血经过表面时，会特异性捕获循环肿瘤细胞，达到CTC的特异性分离及富集，随后通过特性的标记抗体或抗原对捕获的细胞进行检测。由于肿瘤细胞的起始也是人体中的某一类细胞，因此会受到正常细胞的干扰，同时制备的特异性抗体较昂贵，种类稀少，只能对特定的CTC进行捕获，具有很大的局限性。
免疫荧光检测技术：原理是对分离富集的特异性循环肿瘤细胞进行荧光免疫标记进行鉴别检测。由于肿瘤细胞的起始也是人体中的某一类细胞，因此会受到正常细胞的干扰，同时制备的特异性抗体较昂贵，种类稀少，只能对特定的CTC进行捕获，具有很大的局限性。
随着芯片技术的发展，循环肿瘤细胞的筛选、富集、检测的方式都越来越多，但是基本上都只能通过特异性的免疫标记信号进行检测，这种缺陷在于抗体的成本高，抗体种类有限，只能对应检测一种或一类的循环肿瘤细胞，同时会受到正常细胞表达蛋白的影响；另外基于芯片的主要技术是依靠肿瘤细胞尺寸比正常细胞较大进行的分离及富集，这种技术的缺陷在于分离富集的细胞种类无法确认，只能鉴别说有或者无，同时癌症患者体内的免疫细胞本身存在一定的异常，而且容易伴随细菌或病毒感染，异常的单核细胞会影响分离富集的准确性。
发明内容
基于此，有必要提供一种微流控芯片、循环肿瘤细胞自动化分离检测系统及方法。本发明的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统能够提高外周血循环肿瘤细胞的检测效率及准确性。
一种微流控芯片，包括密度梯度离心组件、细胞捕获组件以及试剂存储组件；所述密度梯度离心组件用于对全血样本进行密度梯度离心以实现分离得到血浆层、单核细胞层、Ficoll液层、红细胞和粒细胞层，所述细胞捕获组件包括捕获通道以及连通所述捕获通道的捕获入口、捕获出口，所述捕获通道的内壁上设置具有多个捕获孔以及多个负压捕获腔室，各个所述捕获孔对应连通一个所述负压捕获腔室，所述捕获入口与所述密度梯度离心组件连通以用于获取单核细胞层，所述捕获出口用于连通负压源，所述负压捕获腔室的尺寸大于一个外周血循环肿瘤细胞的尺寸且小于两个外周血循环肿瘤细胞的尺寸，所述试剂存储组件与所述捕获入口连通以用于存储染色液以及洗涤液。
在其中一个实施例中，所述捕获通道的内壁上沿着所述捕获入口至所述捕获出口方向依次顺序设置具有多个所述捕获孔以及多个所述负压捕获腔室。
在其中一个实施例中，所述捕获通道沿着所述微流控芯片使用状态时的竖直方向迂回状分布。
在其中一个实施例中，所述捕获孔位于所述捕获通道的下壁。
在其中一个实施例中，所述捕获孔的朝向所述捕获通道的开口的径向尺寸小于所述捕获孔内部的径向尺寸。
在其中一个实施例中，所述试剂存储组件包括与所述捕获入口连通的多个染色液存储室以及多个洗涤液存储室。
在其中一个实施例中，所述微流控芯片还包括废液室，所述废液室与所述捕获出口连通，所述废液室设置有用于连通负压源的负压孔。
一种外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统，包括细胞检测仪以及所述的微流控芯片，所述细胞检测仪用于检测所述微流控芯片中的所述负压捕获腔室内的外周血循环肿瘤细胞的数量。
一种使用所述的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测方法，包括如下步骤：
向细胞检测仪的加样口内先后加入Ficoll分离液以及全血样本，Ficoll分离液以及全血样本进入先后进入微流控芯片的密度梯度离心组件中，对所述密度梯度离心组件进行密度梯度离心分层得到血浆层、单核细胞层、Ficoll液层、红细胞和粒细胞层，通过捕获出口对捕获通道施加负压，使得单核细胞层内的单核细胞及外周血循环肿瘤细胞进入捕获通道中，并通过捕获孔进入负压捕获腔室内；
通过试剂存储组件向捕获入口内加入第一染色液，固定细胞预定时间，加入第一洗涤液以洗涤第一染色液，加入第二染色液，染色预定时间，加入第二洗涤液，清洗多余的第二染色液；
通过细胞检测仪获取所述微流控芯片上的单个或者多个负压捕获腔室的图像，进行细胞形态学鉴定。
在其中一个实施例中，固定细胞1-2min，和/或，染色3-5min。
本发明在微流控芯片内集成循环肿瘤细胞密度梯度离心技术、自动化细胞染色技术及高通量阵列细胞成像技术于一体，设计制备出对外周血循环肿瘤细胞快速检测的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统，有效降低了手工操作误差，降低试剂消耗，高通量完成样本检测，并可以同时得出循环肿瘤细胞的来源及在外周血单核细胞中所占的比例，这对肿瘤发生发展的监测及及时治疗都至关重要。
本发明将外周血循环肿瘤细胞的分离、富集及检测集成在单个微流控芯片内，每个负压捕获腔室含有单个细胞，采用细胞形态特征对细胞进行分析，大大提高分析检测的准确性，最后通过细胞检测仪进行成像自动化分析，提高了分析效率。本发明在微流控芯片内完成全血中循坏肿瘤细胞分析检测的全过程，极大地简化了操作过程，缩短了检测时间，同时由于微流控芯片的微型化特征，大大降低了试剂的消耗。本发明的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统可以大大降低循环肿瘤细胞的检测成本，并使整个检测具较高的准确性。
附图说明
图1为本发明一实施例所述的微流控芯片示意图；
图2为本发明一实施例所述的微流控芯片部分结构示意图；
图3为本发明一实施例所述的微流控芯片的捕获通道的部分结构示意图。
附图标记说明
10、微流控芯片；100、密度梯度离心组件；200、细胞捕获组件；210、捕获通道；220、捕获入口；230、捕获出口；240、捕获孔；250、负压捕获腔室；300、试剂存储组件；310、染色液存储室；320、洗涤液存储室；400、废液室；410、负压孔；21、血浆层；22、单核细胞层；23、Ficoll液层；24、红细胞和粒细胞层。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请参阅图1所示，本发明一实施例提供了一种微流控芯片10。
一种微流控芯片10，包括密度梯度离心组件100、细胞捕获组件200以及试剂存储组件300。
密度梯度离心组件100用于对全血样本进行密度梯度离心以实现分离得到血浆层21、单核细胞层22、Ficoll液层23、红细胞和粒细胞层24。
请参阅图1所示，细胞捕获组件200包括捕获通道210以及连通捕获通道210的捕获入口220、捕获出口230。捕获通道210的内壁上设置具有多个捕获孔240以及多个负压捕获腔室250，各个捕获孔240对应连通一个负压捕获腔室250。捕获入口220与密度梯度离心组件100连通以用于获取单核细胞层22。捕获出口230用于连通负压源。负压捕获腔室250的尺寸大于一个外周血循环肿瘤细胞的尺寸且小于两个外周血循环肿瘤细胞的尺寸。
试剂存储组件300与捕获入口220连通以用于存储染色液以及洗涤液。
在一个具体示例中，捕获通道210的内壁上沿着捕获入口220至捕获出口230方向依次顺序设置具有多个捕获孔240以及多个负压捕获腔室250。
在一个具体示例中，请参阅图1所示，捕获通道210呈迂回状分布。
在一个具体示例中，捕获通道210沿着微流控芯片10使用状态时的竖直方向迂回状分布。
在一个具体示例中，请参阅图2所示，捕获孔240位于捕获通道210的下壁。
在一个具体示例中，捕获孔240的朝向捕获通道210的开口的径向尺寸小于捕获孔240内部的径向尺寸。捕获通道210的开口的径向尺寸小于一个外周血循环肿瘤细胞的尺寸，参见图3所示，捕获孔240的开口为花瓶口型的开口形状，同时在每个捕获孔240的底部配套连接有相应的负压捕获腔室250，通过负压为细胞突破捕获孔240的开口“瓶颈”处提供动力，当外周血循环肿瘤细胞进入捕获孔240后，由于捕获孔240的开口较小，而使外周血循环肿瘤细胞不易从捕获孔240中溢出，当一个外周血循环肿瘤细胞进入捕获孔240之后，会使负压对捕获通道210中的其他外周血循环肿瘤细胞的吸力极大降低，而不足以让第二个外周血循环肿瘤细胞再进去该捕获孔240，如此实现一个捕获孔240以及一个负压捕获腔室250内只有一个外周血循环肿瘤细胞。
在一个具体示例中，请参阅图1所示，试剂存储组件300包括与捕获入口220连通的多个染色液存储室310以及多个洗涤液存储室320。染色液存储室310的数量以及洗涤液存储室320的数量可以根据实际需要进行设置。例如，参见图1所示，染色液存储室310的数量为两个，洗涤液存储室320的数量为两个。两个染色液存储室310域两个洗涤液存储室320分别通过连接管道与捕获入口220连通。
在一个具体示例中，请参阅图1所示，微流控芯片10还包括废液室400。废液室400与捕获出口230连通，废液室400设置有用于连通负压源的负压孔410。
本发明一实施例还提供了一种外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统。
一种外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统，包括细胞检测仪以及上述的微流控芯片10。细胞检测仪在附图1-3中未示出。细胞检测仪用于检测微流控芯片10中的负压捕获腔室250内的外周血循环肿瘤细胞的数量。
本发明一实施例还提供了外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测方法。
一种使用上述的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测方法，包括如下步骤：
向细胞检测仪的加样口内先后加入Ficoll分离液以及全血样本，Ficoll分离液以及全血样本进入先后进入微流控芯片10的密度梯度离心组件100中，对密度梯度离心组件100进行密度梯度离心分层得到血浆层21、单核细胞层22、Ficoll液层23、红细胞和粒细胞层24，通过捕获出口230对捕获通道210施加负压，使得单核细胞层内的单核细胞及外周血循环肿瘤细胞进入捕获通道210中，并通过捕获孔240进入负压捕获腔室250内。
通过试剂存储组件300向捕获入口220内加入第一染色液(如甲醇)，固定细胞预定时间如1-2min，加入第一洗涤液(如空气)以洗涤第一染色液，此时空气使得甲醇挥发，加入第二染色液(瑞士染液)，染色预定时间如3-5min，加入第二洗涤液(缓冲溶液)，清洗多余的第二染色液。
通过细胞检测仪获取微流控芯片10上的单个或者多个负压捕获腔室250的图像，进行细胞形态学鉴定。
本发明在微流控芯片10内集成循环肿瘤细胞密度梯度离心技术、自动化细胞染色技术及高通量阵列细胞成像技术于一体，设计制备出对外周血循环肿瘤细胞快速检测的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统，有效降低了手工操作误差，降低试剂消耗，高通量完成样本检测，并可以同时得出循环肿瘤细胞的来源及在外周血单核细胞中所占的比例，这对肿瘤发生发展的监测及及时治疗都至关重要。
本发明将外周血循环肿瘤细胞的分离、富集及检测集成在单个微流控芯片10内，每个负压捕获腔室250含有单个细胞，采用细胞形态特征对细胞进行分析，大大提高分析检测的准确性，最后通过细胞检测仪进行成像自动化分析，提高了分析效率。本发明在微流控芯片10内完成全血中循坏肿瘤细胞分析检测的全过程，极大地简化了操作过程，缩短了检测时间，同时由于微流控芯片10的微型化特征，大大降低了试剂的消耗。本发明的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统可以大大降低循环肿瘤细胞的检测成本，并使整个检测具较高的准确性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括密度梯度离心组件、细胞捕获组件以及试剂存储组件；所述密度梯度离心组件用于对全血样本进行密度梯度离心以实现分离得到血浆层、单核细胞层、Ficoll液层、红细胞和粒细胞层，所述细胞捕获组件包括捕获通道以及连通所述捕获通道的捕获入口、捕获出口，所述捕获通道的内壁上沿着所述捕获入口至所述捕获出口方向依次顺序设置具有多个捕获孔以及多个负压捕获腔室，各个所述捕获孔对应连通一个所述负压捕获腔室，所述捕获孔的开口为花瓶口型的开口形状，所述捕获孔的朝向所述捕获通道的开口的径向尺寸小于所述捕获孔内部的径向尺寸，所述捕获入口与所述密度梯度离心组件连通以用于获取单核细胞层，所述捕获出口用于连通负压源，所述负压捕获腔室的尺寸大于一个外周血循环肿瘤细胞的尺寸且小于两个外周血循环肿瘤细胞的尺寸，所述试剂存储组件与所述捕获入口连通以用于存储染色液以及洗涤液。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述捕获通道沿着所述微流控芯片使用状态时的竖直方向迂回状分布。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述捕获孔位于所述捕获通道的下壁。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述试剂存储组件包括与所述捕获入口连通的多个染色液存储室以及多个洗涤液存储室。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片还包括废液室，所述废液室与所述捕获出口连通，所述废液室设置有用于连通负压源的负压孔。
6.一种外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统，其特征在于，包括细胞检测仪以及权利要求1-5任意一项所述的微流控芯片，所述细胞检测仪用于检测所述微流控芯片中的所述负压捕获腔室内的外周血循环肿瘤细胞的数量。
7.一种使用权利要求6所述的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测系统的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
向细胞检测仪的加样口内先后加入Ficoll分离液以及全血样本，Ficoll分离液以及全血样本进入先后进入微流控芯片的密度梯度离心组件中，对所述密度梯度离心组件进行密度梯度离心分层得到血浆层、单核细胞层、Ficoll液层、红细胞和粒细胞层，通过捕获出口对捕获通道施加负压，使得单核细胞层内的单核细胞及外周血循环肿瘤细胞进入捕获通道中，并通过捕获孔进入负压捕获腔室内；
通过试剂存储组件向捕获入口内加入第一染色液，固定细胞预定时间，加入第一洗涤液以洗涤第一染色液，加入第二染色液，染色预定时间，加入第二洗涤液，清洗多余的第二染色液；
通过细胞检测仪获取所述微流控芯片上的单个或者多个负压捕获腔室的图像，进行细胞形态学鉴定。
8.根据权利要求7所述的外周血循环肿瘤细胞自动化分离检测方法，其特征在于，固定细胞1-2min，和/或，染色3-5min。
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