CN111733056A - 集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片，其特征在于，包括循环肿瘤细胞分选单元、单细胞捕获单元、光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，循环肿瘤细胞分选单元将循环肿瘤细胞分离分选出来，单细胞捕获单元将分选富集后的细胞实现单细胞的捕获并对细胞进行封闭裂解，光活性凝胶电泳分离单元将细胞裂解后的蛋白推进到芯片上的凝胶涂层区域，免疫印迹分析单元通过特异性的抗体孵育和洗脱，对靶蛋白分子进行荧光或发光基团标记并检测其信号。在微流控芯片上集成循环肿瘤细胞的细胞分选、纯化、单细胞捕获、凝胶电泳与免疫印迹分析等多种功能单元，极大提高对循环肿瘤细胞的分离速度、分析速度和自动化程度。

Description

集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片
技术领域
本发明涉及循环肿瘤细胞分离及蛋白质分析芯片领域，尤其涉及一种集成无标记高通量循环肿瘤细胞分离及单循环肿瘤细胞免疫印迹的微流控芯片。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)
随着人们生活质量的提高、寿命的延长，与癌症相关的死亡率在过去几十年稳步增加，癌症已成为人类的头号杀手。世界卫生组织进行的一项研究发现，如果癌症患者在转移性癌症发生前诊断并治疗，至少30％的死亡率是可以预防的，而导致肿瘤随着血液循环系统发生远位转移并导致患者死亡的主要罪魁祸首之一正是血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)(1)。CTC是指由自发或因诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，侵入血液循环的肿瘤细胞(2)。大部分CTC再进入外周血后发生凋亡或被吞噬。少数CTC能逃避机体免疫，在原发或远处脏器驻留，从而形成复发、转移病灶。循环肿瘤细胞是近30年来研究应用的仅有的几个新型肿瘤分子标志物之一。通过检测CTC数量和蛋白表达可对肿瘤进行确诊(3)、判断预后(4,5)、监控疗效(6)。例如，当CTC出现上皮间质转换(EMT)、过表达上皮细胞粘附分子往往提示肿瘤患者预后不佳；通过对比手术或放化疗前后血液中CTC数量，可以判断治疗是否有效，具有重要的临床研究及应用价值。
循环肿瘤细胞的异质性
细胞的异质性(heterogeneity)是一个普遍存在的生物学现象，在干细胞分化、胚胎发育、肿瘤形成、药物功效和免疫反应等细胞生理过程中常常被观察到(7)。即使表观看起来相同的细胞，也可能存在着显著的异质性。在循环肿瘤细胞的研究领域，科研人员也逐渐认识到解决细胞异质性的问题是研究成果临床转化研究的关键。循环肿瘤细胞和散播肿瘤细胞(DTCs)被认为是引起肿瘤远处转移的“种子”，对于CTCs与 DTCs异质性、EMT动态调控、高转移潜能亚群的研究是目前热点之一。
大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团。且肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生不同程度的上皮-间质转换(8)，故CTC存在不同的类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。2019年6月20日，Science Advances在线发表了上海市第一人民医院王红霞团队的研究成果“Epithelial-type systemic breast carcinoma cells with arestrictedmesenchymal transition are a major source of metastasis”。研究(9)表明肿瘤细胞EMT并非“全”或“无”的过程，更多肿瘤细胞处于EMT中间状态，呈现异质性特点；与间充质表型细胞(M，M/E)相比，以上皮细胞表型(E和E/M)为主细胞亚型具有更强的转移潜能；EPCAM+CTCs和DTCs与远处转移及预后差显著相关。研究从形态学、分子和表型分析揭示了CTCs的EMT异质性，证实了CTCs上皮和间充质特征共存的特点。除此以外，肿瘤细胞本身具有高度异质性。肿瘤异质性作为肿瘤特征之一，是肿瘤恶性生长、侵袭转移、药物敏感性、预后等差异的根源。
因此，癌症的靶向治疗需在单细胞分辨率水平上提供定量和高度特异性的靶蛋白检测。对细胞异质性的研究，可以为个体化的治疗提供丰富的，关键的遗传表达信息，为治疗方案的制定和靶向药物的选择和开发打下基础。
循环肿瘤细胞的分离
对CTC进行分析可以得到更多的诊断信息和治疗信息，可以更有效地帮助发现肿瘤早期转移、评估肿瘤患者预后以及判断个体化治疗疗效，实时动态的分析肿瘤患者的CTC的特性将为肿瘤患者真正的个体化治疗提供新的依据。CTC在外周血中的含量极少，每10ml血液中可能只含有1个到几十个CTC，但是同时有1亿个白细胞和 500亿个红细胞。所以，要对CTC进行分析，第一步必须先进行分离。
随着流式细胞技术、微流控技术、纳米技术的发展，CTC的分离技术逐渐出现融合的趋势，大大提升了CTC分离的灵敏度和特异性(10)。分离手段依据原理可分为两大类：免疫学法和物理学法。免疫学法利用CTC表面的分子标记物来将其进行区分，包括免疫磁珠法(11)、亲和配体法(12)等。但上述方法存在诸多问题。比如，并非所有肿瘤都来源于上皮细胞，甚至上皮来源的肿瘤也可能逐渐丧失上皮标记物，这一点我们从 CellSearch系统的应用局限就可以看出。物理学法根据CTC的细胞大小和密度与血液中其它细胞不同，包括基于惯性力的分选法(13)、过滤法(14)，声波分选法(15)、介电泳里分选法(16)、横向侧流分选法(17)等。
循环肿瘤细胞CTC的分析
CTC作为一种具有高度可行性和可重复性的非侵入性新型癌症监测技术，它能够真正全病程参与肿瘤的检测、用药指导、预后评估等，这必将极大的推动肿瘤的精准治疗。研究CTC的异质性属于单细胞分辨水平上的范畴，因单细胞间的异质性存在于 DNA，RNA，蛋白等各个层面。近年来，针对CTC的特征研究的技术手段主要集中在基因测序(18)、转录组测序(19)、多通量qPCR(20)，原位免疫荧光杂交(21)等。
然而，转录组学和蛋白组学相关研究结果表明，单细胞和细胞群体在RNA转录和蛋白表达量方面仍存在显著的差异(22)。蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。同时，乙酰化、泛素化、磷酸化等表观遗传修饰对蛋白质的功能起着至关重要的调控作用。基因组及转录组的研究并不能满足人类对疾病发生发展中存在的异质性探索的需求。
而现有的技术手段无法满足针对循环肿瘤细胞的蛋白质表达水平检测的需求。荧光流式细胞术及今日新发展的质谱流式细胞术广泛应用于细胞异质性的研究，然而其对样本量要求较大，无法检测循环肿瘤细胞这类微量细胞样本。IsoPlexis公司的 IsoLight单细胞功能信息多重检测系统(17)是目前在单细胞分析领域中最前沿且不可或缺的解决方案，能够在单细胞的分辨率与灵敏度下，提供完整的细胞功能响应分析。然而其只能检测细胞分泌蛋白，对细胞表面及细胞内部功能状态相关的特征无法监测(23)。蛋白质印迹术(Western Blot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到膜(硝酸纤维素或PVDF)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体探测来检测样品中的蛋白质。由于蛋白是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性。细胞免疫荧光技术也在CTC的特征异质性研究发挥着不可或缺的作用，然而也因其非特异性染色及抗体交叉反应性而备受科学家的质疑。
以上技术对于分离循环肿瘤细胞并分析其单细胞蛋白表达含量的显著性差异已被证明非常重要，但是均存在着缺点。
循环肿瘤细胞的分离与分析分离。仅停留在计数，或进行测序分析而无鲜有蛋白质水平分析。且分析往往依赖于大型设备仪器。
现有循环肿瘤细胞分离的技术，如免疫磁珠法等，需要对样品进行免疫磁珠孵育，周期长，且影响对细胞进行后期分析研究；
现有的肿瘤循环细胞分析技术，如cellResearch仅停留在计数水平。CTC数量少，无法使用荧光流式细胞术、质谱流式细胞术等。而细胞免疫荧光计数对抗体探针的质量和数量有较高的要求，有时可能无法找到靶标所对应的复合检测要求的抗体探针，这一点极大的限制了该方法的应用。单细胞分泌蛋白检测技术仅可检测分泌蛋白，无法检测细胞表面、跨膜蛋白、胞内及核内蛋白。
微流控技术具有样品试剂消耗少、结构功能多样化、集成化程度高等优点。但是，部分芯片制备工艺复杂，对单细胞分离检测难以控制。芯片制备所用材料生物相容性不够好，可能会引起细胞功能表征改变，使得测得结果并不能反映真实人体生命活动状态中的真实情况。
因此，为了充分理解复杂细胞群体中单个细胞的异质性行为，本领域的技术人员致力于开发一种新的针对循环肿瘤细胞的单细胞蛋白质表达分析技术。
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发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种快速、灵敏和稳定的微流控芯片单细胞蛋白质免疫印迹新技术，为单细胞的蛋白质定量分析、单细胞组学和细胞异质性研究提供新的手段和方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片，其特征在于，包括循环肿瘤细胞分选单元、单细胞捕获单元、光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，循环肿瘤细胞分选单元的末端与单细胞捕获单元的前端相通，单细胞捕获单元的末端设有光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元共有凝胶，循环肿瘤细胞分选单元被设置为将细胞样本中的循环肿瘤细胞分离分选出来，单细胞捕获单元被设置为将分选富集后的细胞实现单细胞的捕获，并在细胞捕获后对细胞进行封闭裂解，光活性凝胶电泳分离单元被设置为将细胞裂解后的蛋白推进到芯片上的凝胶涂层区域，通过施加电场使得蛋白根据分子量不同在凝胶中分离，免疫印迹分析单元被设置为通过特异性的抗体孵育和洗脱，对靶蛋白分子进行荧光或发光基团标记并检测其信号。
进一步地，循环肿瘤细胞分选单元包含微流控通道，微流控通道采用蛇形设计，微流控通道的输入管道的直径为0.15～0.3mm，外侧输出管道的直径为5～10mm。
进一步地，循环肿瘤细胞分选单元的末端设有过滤膜，过滤膜的孔径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。
进一步地，还包括细胞阱，细胞阱设置在单细胞捕获单元和光活性凝胶电泳分离单元之间，细胞阱的直径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。
本发明还提供一种利用微流控芯片进行循环肿瘤细胞的分离及单细胞免疫印迹的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将血液样本进行红细胞裂解的预处理，并离心后用大体积PBS或生理盐水稀释重悬，
(2)将经过预处理的细胞样本经由上述的微流控芯片上的微流控通道在循环肿瘤细胞分选单元中进行分选，
(3)纯化与浓缩循环肿瘤细胞，
(4)循环肿瘤细胞的单细胞捕获和裂解，细胞在分选后会被单细胞捕获单元引入细胞阱中，最终达成单个细胞均匀入阱和裂解，
(5)凝胶电泳，细胞在裂解后，在芯片两端施加电场，蛋白在电场的作用下进入芯片表面的凝胶涂层中开始电泳分离，
(6)蛋白质的光敏固定，凝胶电泳结束后，通过对凝胶表面进行激发光照射，使凝胶涂层蛋白条带中蛋白分子和凝胶单体分子原位聚合，而后进行免疫印迹蛋白分析，将固定好的蛋白分子用特异性的一抗及带有荧光或发光基团标记的二抗识别结合，
(7)在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目标蛋白分子的荧光信号强度。
进一步地，步骤(3)的纯化与浓缩是采用过滤膜，过滤膜孔径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。
进一步地，步骤(5)的电场为40V/cm，步骤(6)中的激发光的波长为320-360nm，凝胶电泳结束后，凝胶经激发光照射60s。
本发明还提供一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)分别称取聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂，聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂的质量比为10:1，并且混匀得到混合胶体，
(b)将混合胶体放到连接双级旋片式真空泵的真空干燥皿内，抽真空以确保混合胶体中没有气泡，
(c)把抽完真空的混合胶体导入到放置有目标图案的硅片的培养皿内，使混合胶体覆盖硅片表面，继续抽真空，使硅片与培养皿底部之间没有气泡，
(d)将步骤(c)中的培养皿放到电热恒温干燥箱内，烘干，
(e)将步骤(d)的培养皿从电热恒温干燥箱内取出来，分离聚二甲基硅氧烷和硅片，并且将聚二甲基硅氧烷的有图案的部分切成方形，用针头在入口和出口处打孔，
(f)用美工刀沿矩形槽的四边切割透，形成两面通透的矩形框，将泡过3％BSA 后烘干的滤膜贴在无通道那面的矩形框上，放入烘箱烘干胶，
(g)PDMS薄层间隔制备：用步骤(a)的方法配置PDMS，匀胶机转速设置为 300r/min，9s，利用匀胶机在75mm x 75mm玻璃上用PDMS一层，厚度为200μm，放入烘箱45min烘干，揭下PDMS后，按芯片尺寸在对应位置切割出矩形框，
(h)用透明胶清理PDMS薄层间隔，PDMS芯片和载玻片的表面，确保两者表面干净之后，先将PDMS薄层间隔和玻璃片一并放到等离子清洗机内PDMS有图案的面朝上，
(i)打开等离子清洗机，时间设为50s，并开始抽真空，观察等离子清洗机所显示的腔内压强值，当压强降到200pa左右时，停止继续抽真空，开辉光强度最高的开关，真空腔内出现偏紫色的辉光时，开始计时，取出PDMS和载玻片之后，将迅速将二者粘在一起，
(j)对贴好PDMS薄层间隔的玻璃片的矩形正方形槽进行硅烷化处理0.5h，
(k)将贴好PDMS薄层间隔并完成硅烷化的载玻片的矩形槽中加入丙烯酰胺成胶溶液，将制备的圆柱阵列硅片模具倒扣在矩形槽上，成胶后揭下模具，槽内形成点有微孔阵列的凝胶，
(l)再将贴好膜的PDMS芯片与上述制备好凝胶的基底通过Plasma粘合在一起，
(m)将外径为0.8mm的四氟乙烯管插入到入口和出口，为了避免在实验过程中入口和出口会有液体漏出的现象，用PDMS混合液对入口和出口处进行封口，再继续烘0.5h。
具体地，步骤(c)的抽真空时间为10～15min。
具体地，步骤(l)中在进行对二者的表面等离子体处理之前，需要在有水凝胶的槽内加上30μL的去离子水，以免水凝胶在大表面等离子体的过程中变干，为了进一步强化键合，可把芯片放到烘箱内，75℃下烘0.5h，过程中应注意给凝胶补充水分，避免胶干而翘起。
技术效果
与现有技术相比，本发明的设计只利用流体力学来实现循环肿瘤细胞与白细胞在蛇形通道的微流控芯片内无标记、高通量、高纯度分离。
样品不需要复杂处理，通量高、速度快、分离率高，不需要外加工作场。
分离后，细胞的活性不受影响，可以得到完整的细胞，为后期的研究提供有利的手段。
利用滤膜的设计来实现分离得到CTC的进一步纯化与浓缩，便于后续对收集到的CTC进行分析。
引入光敏原位固定的单细胞免疫印迹技术。将循环肿瘤细胞的分离与分析集成在一张芯片上，此为首创。
可定量分析得单个循环肿瘤细胞的某靶标蛋白的表达水平。
可同时对多个循环肿瘤细胞进行单细胞免疫印迹分析。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的微芯片的原理设计图；
图2是本发明的一个较佳实施例的微芯片的结构解剖图；
图3是本发明的一个较佳实施例的微芯片的制备流程图；
图4是本发明的一个较佳实施例的微芯片的实物图；
图5是本发明的一个较佳实施例的微芯片的分离通道的尺寸图；
图6是本发明的一个较佳实施例的微芯片的分离模块中，流速与通道内循环肿瘤细胞及白细胞平衡位置距离的关系图；
图7是本发明的一个较佳实施例的微芯片在分离细胞时的通道内细胞分布的视频截图；
图8是本发明的一个较佳实施例的微芯片分离CTC的分离效果图；
图9是本发明的一个较佳实施例的循环肿瘤细胞经滤膜过滤浓缩纯化后纯度效果图；
图10是本发明的一个较佳实施例的循环肿瘤细胞经细胞阱捕获，原位裂解后电泳，再经紫外光照射固定蛋白，一抗二抗识别后的荧光图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本文中提及的PDMS指聚二甲基硅氧烷。
本发明提出一种快速、灵敏和稳定的微流控芯片，以实现循环肿瘤细胞无标记高通量分离及单细胞免疫印迹新技术。将微流控芯片和Western Blot技术结合，通过全新的芯片功能单元设计和蛋白原位固定技术，从根本上解决循环肿瘤细胞微芯片分离及单细胞免疫印迹技术中存在的细胞数量限制、分析速度较慢、检测灵敏度低等问题，如图1所示。
如图2-4所示，该微芯片的主要功能单元有：(1)血液样品前处理循环肿瘤细胞分选单元，能将复杂细胞样本中的目标细胞肿瘤循环细胞迅速分离分选出来；(2)单细胞捕获单元，能将分选富集后的细胞实现单细胞的捕获，并在细胞捕获后对细胞进行封闭裂解；(3)光活性凝胶电泳(Photoactive polyacrylamide gel electrophoresis)分离单元，能将细胞裂解后蛋白推进到芯片上的凝胶涂层区域，通过施加电场使得蛋白根据分子量不同在凝胶中分离；(4)免疫印迹分析单元，通过特异性的抗体孵育和洗脱，对靶蛋白分子进行荧光或发光基团标记并检测其信号。
如图1和5所示，该微芯片的基本实验使用流程为：(1)将血液样本进行红细胞裂解的预处理，并离心后用大体积PBS或生理盐水稀释重悬。(2)将经过预处理的细胞样本通过微流控微通道引入到微芯片的循环肿瘤细胞分选单元，在此过程中完成目标细胞的分选和富集。分选单元的设计采用的蛇形通道，利用循环肿瘤细胞与白细胞尺寸大小不一样在微流控通道内受力不同的原理将两者分离(见附图6：芯片分离通道的尺寸信息)。(3)循环肿瘤细胞的进一步纯化与浓缩。引入过滤膜的设计，将小于过滤膜孔径的白细胞及多余的缓冲液滤除。(4)循环肿瘤细胞的单细胞捕获和裂解。细胞在分选后会被单细胞捕获单元引入经过特殊设计的细胞阱(microwell)中，最终达成单个细胞均匀入阱和裂解。(5)凝胶电泳。细胞在裂解后，在芯片两端施加电场，蛋白在电场的作用下进入芯片表面的凝胶涂层中开始电泳分离；(6)蛋白质的光敏固定。凝胶电泳结束后，通过对凝胶表面进行一定波长和强度的激发光照射，使凝胶涂层蛋白条带中蛋白分子和凝胶单体分子原位聚合。而后进行免疫印迹蛋白分析。将固定好的蛋白分子用特异性的一抗及带有荧光或发光基团标记的二抗识别结合。(7) 在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目标蛋白分子的荧光信号强度。
微流控芯片的循环肿瘤细胞分离模块：本发明中，利用了流体在微米尺度下的性质，依据循环肿瘤细胞与白细胞的大小不同，实现了二者的分离。在微米尺度下，在芯片的雷诺数小于2300时，微流控芯片内的流体形成层流，不同大小的颗粒在层流中因惯性升力和Dean拽力的平衡，占有各自不同的平衡位置。以分离乳腺癌细胞系MCF-7(直径尺寸约22-28μm)和白细胞(直径尺寸约8-18μm)为例，如图7所示，将流速设置为1.4mL/min时，两者可以得到最大分离距离。可根据不同尺寸的循环肿瘤细胞对流速进行调整优化。此发明中样品只需要进行常规的红细胞裂解处理，去除上清液。跟其他现有的技术相比，减少了用免疫磁珠孵育细胞的时间并降低了成本。通量高，样品的流速为1.4mL/min，分离耗时短。分离率大于68％，且整个分离的而过程中不需要借助外加在工作场(如电场，磁场)，不需要对细胞进行修饰(如孵育免疫磁珠)，流过芯片后的细胞活性不受影响，可以得到完整的细胞。
微流控芯片的滤膜过滤模块：滤膜孔径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。以分离乳腺癌循环肿瘤细胞为例(直径尺寸约22-28μm)，选择的滤膜孔径为20μm。由于在液体刚开始进入芯片时需要一定的时间来实现流体的稳定，因为会有一部分白细胞出现在循环肿瘤细胞的出口。因此利用在循环肿瘤细胞出口上粘贴上过滤膜，对循环肿瘤细胞进行进一步的纯化，来消除背景细胞的影响。
微流控芯片的免疫印迹模块：细胞阱的直径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。以分析乳腺癌循环肿瘤细胞为例(直径尺寸约22-28μm)，选择的细胞阱孔径为30μm，以保证单细胞入孔。细胞入孔后，加入预热至55℃的单细胞裂解电泳缓冲液，待细胞裂解后，启动电泳分离，通过微芯片上施加电场(40V/cm)，进行蛋白分子的凝胶电泳分离。电泳分离后，将整个芯片放入有紫外光照射的封闭装置(320-360nm，60s)，进行蛋白原位固定。蛋白固定后，对细胞内几种靶蛋白进行特异性抗体的结合、染色、洗脱，利用荧光扫描阵列系统测定不同蛋白的不同荧光强度。
实施例1：微芯片制备。
1.取出一个纸杯，放到天平，使天平清零，缓慢倒25g的聚二甲基硅氧烷(PDMS))到纸杯，再次使天平清零，用1mL的移液枪缓慢加2.5g的聚二甲基硅氧烷固化剂使聚二甲基硅氧烷原液和聚二甲基硅氧烷固化剂的比例为10:1。
2.用搅拌玻璃棒将聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)固化剂充分搅拌混匀，放到连接双级旋片式真空泵的真空干燥皿内，抽10min真空，确保混合胶体中没有气泡。在抽真空的过程中注意及时放气，以免混合物溢出来。
3.把抽完真空的混合胶体导入到放置有目标图案的硅片的培养皿内，使混合胶体覆盖硅片表面，继续抽10min真空，使硅片与培养皿底部之间没有气泡。
4.培养皿放到温度为75℃的电热恒温干燥箱内，烘45min。烘箱内的架子必须是水平的，否则烘干后的PDMS不平，一定程度上影响实验结果。
5.将培养皿取出来，用美工刀缓慢将PDMS从硅片表面撕下来，并把有图案的部分切成方形，用针头在入口和出口处打孔。此步骤需要注意三点，首先，在将PDMS 撕下来的过程中，手术刀不能碰到硅片，否则会导致硅片碰碎。其次，打孔时一定要对准通道的对应入口和出口，并保证打孔器垂直插到PDMS上。最后，打完孔，需要用细导线戳一戳入口和出口，确保没有多余的PDMS留在入口和出口处。
6.用美工刀沿矩形槽的四边切割透，形成两面通透的矩形框。将泡过3％BSA后烘干的滤膜贴在无通道那面的矩形框上。放入烘箱烘干胶。
7.PDMS薄层间隔制备：配置PDMS(同上)，匀胶机转速设置为300r/min，9s。利用匀胶机在75mm x 75mm玻璃上甩PDMS一层，厚度为200μm。放入烘箱45min 烘干。揭下PDMS后，按芯片尺寸在对应位置切割出矩形框。
8.用透明胶清理PDMS薄层间隔，PDMS芯片和载玻片的表面，确保两者表面干净之后，先将PDMS薄层间隔和玻璃片一并放到等离子清洗机内PDMS有图案的面朝上。
9.打开等离子清洗机，时间设为50s，并开始抽真空，观察等离子清洗机所显示的腔内压强值，当压强降到200pa左右时，停止继续抽真空，开辉光强度最高的开关，真空腔内出现偏紫色的辉光时，开始计时。取出PDMS和载玻片之后，将迅速将二者粘在一起。
10.对贴好PDMS薄层间隔的玻璃片的矩形正方形槽进行硅烷化处理0.5h，
11.将贴好PDMS薄层间隔并完成硅烷化的载玻片的矩形槽中加入丙烯酰胺成胶溶液，将制备的圆柱阵列硅片模具倒扣在矩形槽上。成胶后揭下模具，槽内形成点有微孔阵列的凝胶。
12.再将贴好膜的PDMS芯片与上述制备好凝胶的基底通过Plasma粘合在一起。在进行对二者的表面等离子体处理之前，需要在有水凝胶的槽内加上30μL的DI水，以免水凝胶在大表面等离子体的过程中变干。为了进一步强化键合，可把芯片放到烘箱内，可把芯片放到烘箱内，75℃下烘0.5h。过程中应注意给凝胶补充水分，避免胶干而翘起。
13.烘完之后将外径为0.8mm的四氟乙烯管插入到入口和出口，并用的四氟乙烯管插入到入口和出口，为了避免在实验过程中入口和出口会有液体漏出的现象，用 PDMS混合液对入口和出口处进行封口，再继续烘半个小时。
实施例2：
以乳腺癌细胞系MCF-7细胞模拟乳腺癌患者体内的循环肿瘤细胞，将MCF-7细胞掺入正常人血液中模拟从乳腺癌患者体内采集到的血液样本，来验证微芯片的各个功能模块。
如图7和8所示，MCF-7细胞经过微芯片的分选模块时，在分离通道内细胞分布的视频截图。MCF-7的分离效率为68％，纯度为96％。如图9所示，MCF-7细胞经过滤膜过滤浓缩纯化后纯度更高。如图10所示，循环肿瘤细胞经细胞阱捕获，原位裂解后电泳，再经紫外光照射固定蛋白，一抗二抗识别后的荧光图像及数据处理结果，说明可以对分离后的循环肿瘤细胞进行单细胞层面的蛋白分析。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片，其特征在于，包括循环肿瘤细胞分选单元、单细胞捕获单元、光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，所述循环肿瘤细胞分选单元的末端与所述单细胞捕获单元的前端相通，所述单细胞捕获单元的末端设有光活性凝胶电泳分离单元和免疫印迹分析单元，所述光活性凝胶电泳分离单元和所述免疫印迹分析单元共有凝胶，所述循环肿瘤细胞分选单元被设置为将细胞样本中的循环肿瘤细胞分离分选出来，所述单细胞捕获单元被设置为将分选富集后的细胞实现单细胞的捕获，并在细胞捕获后对细胞进行封闭裂解，所述光活性凝胶电泳分离单元被设置为将细胞裂解后的蛋白推进到芯片上的凝胶涂层区域，通过施加电场使得蛋白根据分子量不同在凝胶中分离，所述免疫印迹分析单元被设置为通过特异性的抗体孵育和洗脱，对靶蛋白分子进行荧光或发光基团标记并检测其信号。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述循环肿瘤细胞分选单元包含微流控通道，所述微流控通道采用蛇形设计，所述微流控通道的输入管道的直径为0.15～0.3mm，外侧输出管道的直径为5～10mm。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述循环肿瘤细胞分选单元的末端设有过滤膜，所述过滤膜的孔径尺寸根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。
4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括细胞阱，所述细胞阱设置在所述单细胞捕获单元和所述光活性凝胶电泳分离单元之间，所述细胞阱的直径尺寸根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。
5.一种利用微流控芯片进行循环肿瘤细胞的分离及单细胞免疫印迹的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将血液样本进行红细胞裂解的预处理，离心后用大体积PBS或生理盐水稀释重悬，
(2)将经过预处理的细胞样本经由如权利要求1所述的微流控芯片上的微流控通道在循环肿瘤细胞分选单元中进行分选，
(3)纯化与浓缩循环肿瘤细胞，
(4)循环肿瘤细胞的单细胞捕获和裂解，细胞在分选后会被单细胞捕获单元引入细胞阱中，最终达成单个细胞均匀入阱和裂解，
(5)凝胶电泳，细胞在裂解后，在芯片两端施加电场，蛋白在电场的作用下进入芯片表面的凝胶涂层中开始电泳分离，
(6)蛋白质的光敏固定，凝胶电泳结束后，通过对凝胶表面进行激发光照射，使凝胶涂层蛋白条带中蛋白分子和凝胶单体分子原位聚合，而后进行免疫印迹蛋白分析，将固定好的蛋白分子用特异性的一抗及带有荧光或发光基团标记的二抗识别结合，
(7)在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目标蛋白分子的荧光信号强度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)的纯化与浓缩是采用过滤膜，所述过滤膜的孔径尺寸可以根据待分离的循环肿瘤细胞的尺寸进行调整。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)的电场为40V/cm，步骤(6)中的激发光的波长为320-360nm，凝胶电泳结束后，所述凝胶经所述激发光照射60s。
8.一种集成循环肿瘤细胞分离及单细胞免疫印迹的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)分别称取聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂，所述聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂的质量比为10:1，并且混匀得到混合胶体，
(b)将所述混合胶体放到连接双级旋片式真空泵的真空干燥皿内，抽真空以确保混合胶体中没有气泡，
(c)把抽完真空的混合胶体导入到放置有目标图案的硅片的培养皿内，使混合胶体覆盖硅片表面，继续抽真空，使硅片与培养皿底部之间没有气泡，
(d)将步骤(c)中的培养皿放到电热恒温干燥箱内，烘干，
(e)将步骤(d)的培养皿从电热恒温干燥箱内取出来，分离聚二甲基硅氧烷和硅片，并且将聚二甲基硅氧烷的有图案的部分切成方形，用针头在入口和出口处打孔，
(f)用美工刀沿矩形槽的四边切割透，形成两面通透的正方形框，将泡过3％BSA后烘干的滤膜贴在无通道那面的矩形框上，放入烘箱烘干胶，
(g)PDMS薄层间隔制备：用步骤(a)的方法配置PDMS，匀胶机转速设置为300r/min，9s，利用匀胶机在75mm x 75mm玻璃上甩PDMS一层，厚度为200μm，放入烘箱45min烘干，揭下PDMS后，按芯片尺寸在对应位置切割出矩形框，
(h)用透明胶清理PDMS薄层间隔，PDMS芯片和载玻片的表面，确保两者表面干净之后，先将PDMS薄层间隔和玻璃片一并放到等离子清洗机内PDMS有图案的面朝上，
(i)打开等离子清洗机，时间设为50s，并开始抽真空，观察等离子清洗机所显示的腔内压强值，当压强降到200pa时，停止继续抽真空，开辉光强度最高的开关，真空腔内出现偏紫色的辉光时，开始计时，取出PDMS和载玻片之后，将迅速将二者粘在一起，
(j)对贴好PDMS薄层间隔的玻璃片的矩形正方形槽进行硅烷化处理0.5h，
(k)将贴好PDMS薄层间隔并完成硅烷化的载玻片的矩形槽中加入丙烯酰胺成胶溶液，将制备的圆柱阵列硅片模具倒扣在矩形槽上，成胶后揭下模具，槽内形成点有微孔阵列的凝胶，
(l)再将贴好膜的PDMS芯片与上述制备好凝胶的基底通过Plasma粘合在一起，
(m)将外径为0.8mm的四氟乙烯管插入到入口和出口，并用的四氟乙烯管插入到入口和出口，为了避免在实验过程中入口和出口会有液体漏出的现象，用PDMS混合液对入口和出口处进行封口，再继续烘0.5h。
9.权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)的抽真空时间为10～15min。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(l)中在进行对二者的表面等离子体处理之前，在有水凝胶的槽内加上30μL的去离子水，为了进一步强化键合，把芯片放到烘箱内，75℃下烘0.5h。
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