CN113189181A - 一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，包括以下步骤：1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。本发明的有益效果为：本发明的蛋白质电泳技术、SERS和有序结构光子晶体膜相结合，构建一种新的单细胞蛋白质定量分析方法，能够同时满足高灵敏和宽线性定量检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞蛋白组学技术领域，尤其涉及一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法。
背景技术
随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究进入了后基因组时代。功能基因组学成为生命科学研究的焦点，其主要包括结构基因组研究和蛋白质组研究。尽管基因组学在基因活性和疾病相关方面提供了有力而直接的依据，但基因的表达方式错综复杂。在不同的条件或不同的时期下，同一个基因经过复制、转录和翻译之后，可能会表达出功能完全不同的蛋白质。因此，研究生命现象，仅仅了解掌握基因组的结构是远远不够的，还需对生命活动的直接执行者——蛋白质进行更深入的研究。
一直以来，生命科学的研究主要基于群体细胞水平的分析。而细胞作为生物体基本的结构和功能单位，分析单细胞水平的蛋白表达对解析生命体的活动规律具有重大的意义。但是对单细胞的分析是一个极具挑战性的问题，原因在于单细胞的尺寸在几个微米到几百个微米，且内部结构十分精密；同时，单细胞研究也被列为Science杂志2013年六大重点科学研究之首。近几年涌现的单细胞组学技术主要针对的是细胞DNA或RNA的测序；同时面临着测试成本高和精度低困境。现有的单细胞蛋白分析研究方法主要包括质谱、流式细胞仪和免疫组化。其中质谱是蛋白质定量分析比较常见且最精准的方法。但其通常需要对样品进行较复杂的前处理过程，且不能对蛋白质组进行成像。此外，质谱仪比较昂贵，并不利于推广使用。流式细胞仪和免疫组化一般需要对蛋白进行放射性同位素或者荧光标记，在应用上也有一定的局限性。
目前，Western Blotting(WB)一般需要将分离的蛋白质组分转印到硝酸纤维素膜上，然后进行化学发光或者荧光显色检测。现有的商品化单细胞WB分析仪器Milo系统采用的是底物荧光显色。荧光显色的缺点主要在于荧光分子的光化学稳定性比较差，荧光信号容易漂白和淬灭，难以保证检测结果的准确性；此外，荧光检测的灵敏度并不是很高；另外一方面，由于硝酸纤维素膜微观结构为无序多孔结构，孔的大小在微米左右，因此,膜对光的散射较强，整个膜呈现出白色，光的透过率较差，散射性较强，对光学检测灵敏度造成一定影响，在一定程度上也限制了灵敏度的提高。
近年来，等离激元光子学和纳米技术发展迅速，它们在生物学、物理学、医疗诊断、环境监测、食品安全等方面崭露头角。尤其是通过合理设计表面增强拉曼散射的增强基底，可以实现单分子检测。光子晶体是由不同折射率的介质周期性排列而成的有序人工微结构，具有光子带隙特性以及光子局域特性，可以控制特定频率的光在其中的传播，从而增强光与物质的相互作用。将SERS与有序微纳结构相结合具有以下三点优势：一、有序结构的光子晶体膜可以避免现有商品化NC膜的光散射而带来的膜泛白影响；二、SERS纳米标签与有序结构的光子晶体膜结合，可以进一步增强标签的信号强度，从而降低检测限，这对于低丰度的蛋白检测是具有重大的意义；三、有序结构的光子晶体膜具有较大的比表面积，可以有效地拓宽线性检测范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，该方法使用SERS纳米标签作为显影剂，实现蛋白质的成像和定量检测，同时使用有序结构的光子晶体膜作为转印膜，可以增强纳米标签的拉曼信号，进一步提高检测的灵敏度，实现单细胞痕量蛋白质的检测，该电泳技术属于单细胞蛋白组学领域，其为高灵敏度和宽线性定量范围的单细胞WB提供了新的解决方案。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；
4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤1)中的微孔阵列芯片的制备步骤如下：
①光刻胶均匀地旋涂于硅片或铜片或钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过光刻刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板；
③在模板上覆盖玻璃片或塑料片，使用注射器或滴管或移液器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤②中所使用的光刻可以是紫外光刻、电子束光刻、离子束光刻、X射线光刻、纳米压印光刻或激光刻蚀的一种。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤②中的微柱阵列的圆柱的高度为1μm～120μm，直径为1μm～100μm；模板的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤③中所使用的玻璃片是石英玻璃片、钢化玻璃片或硼酸盐玻璃片的一种。塑料片是聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料的一种。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤2)中的反蛋白石结构光子晶体膜的制备步骤如下：
I)将单分散胶体粒子通过垂直沉积或静电自组装的方式在硅片或玻璃片上形成光子晶体薄膜，并将此薄膜作为反蛋白石结构光子晶体膜的制作模板；
II)将硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液灌注到模板中，并加热固化；
III)通过氢氟酸、二甲基甲酰胺或四氢呋喃的浸泡，或加热的方式，将模板粒子去除，得到反蛋白石结构光子晶体膜。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤I)中的单分散胶体粒子为聚苯乙烯、多孔硅、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚乙烯、二氧化硅或二氧化钛的一种；
所述步骤I)中的单分散胶体粒子直径为50nm～10μm，所述的单分散胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的浓度为10wt％～90wt％。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤II)中的硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液的浓度为3％～50％；固化的温度范围在40℃～80℃。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤III)中的反蛋白石结构光子晶体膜的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。
作为本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法进一步优化方案，所述步骤3)中的SERS纳米标签显影剂有三部分组成；第一部分是信号标签；第二部分是增强信号标签的纳米材料；第三部分是检测抗体。
步骤3)所述的SERS纳米标签显影剂,其信号标签为具有拉曼活性的分子，如耐尔兰A、结晶紫、罗丹明6G、亚甲基蓝、对氨基苯硫酚、水溶性3H-吲哚菁型生物荧光标示染料、甲基蓝、4,4’-联吡啶、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-巯基吡啶、对氟苯硫酚、对巯基苯胺、对氨基苯硫酚、对巯基苯硫酚、甲苯胺蓝、1,4-苯二硫醇、4-巯基苯甲酸、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、2-萘硫酚、3-氨基苯硫酚、罗丹明B异硫氰酸酯、4-氨基苯硫酚、4-氯苯硫酚、4-羟基苯硫酚、4-巯基苯甲腈或4-硝基苯硫醇。
所述增强信号标签的纳米材料包括两类：第一类是单金属纳米粒子，如金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子或铜纳米粒子，其粒径分布范围为1～300nm；第二类是核壳纳米粒子，如银核金壳纳米粒子、银核银壳纳米粒子、金核银壳纳米粒子、金核金壳纳米粒子、二氧化硅核金壳纳米粒子、金核二氧化硅壳纳米粒子、二氧化硅核银壳纳米粒子、银核二氧化硅壳纳米粒子、四氧化铁核金壳纳米粒子、四氧化三铁核银纳米粒子、金核聚苯乙烯壳纳米粒子、银核聚苯乙烯壳纳米粒子、纳米碳球核金壳纳米粒子、纳米碳球核银壳纳米粒子，其核的尺寸范围为1～200nm；壳的厚度范围为1～100nm。
所述信号标签修饰到纳米材料是通过静电吸附或共价连接的方式将标签固定在纳米粒子的表面或核壳结构纳米粒子的核壳间隙处；检测抗体修饰到纳米材料表面是通过静电吸附或共价连接的方式固定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的蛋白质电泳技术、SERS和有序结构光子晶体膜相结合，构建一种新的单细胞蛋白质定量分析方法，能够同时满足高灵敏和宽线性定量检测要求，具有非常重要的意义。
2、本发明通过单细胞分离芯片的物理捕获方法分离单细胞，有效地提高了单细胞分离的效率与成功率，为后续的单细胞蛋白质电泳奠定了基础。
3、本发明选用SERS纳米标签作为显影剂，有效地提高了检测的灵敏度。
4、本发明采用具有较高比表面积的有序结构光子晶体膜作为转印膜，提高了信噪比，尤其是有序结构光子晶体膜对光有着重要的调制作用，能够给纳米标签提供额外的信号增益，从而更加有益于单细胞痕量蛋白质检测。
该单细胞蛋白质电泳技术所包含的部件分别为单细胞分离芯片、反蛋白石结构光子晶体转印膜和SERS纳米标签显影剂。
5、本发明所使用的单细胞分离芯片可以通过物理方式快速分离得到单细胞；反蛋白石结构光子晶体转印膜具有特殊的光学效应——禁带效应以及高的比表面积，能够减缓光在其中的传播速度以及拓宽检测的线性范围；SERS纳米标签具有高的检测灵敏度，能够精确定量检测单细胞中痕量的蛋白质。该单细胞蛋白质电泳技术具有线性检测范围宽和灵敏度高的特性，是单细胞蛋白组学中重要的技术手段，在异质性细胞群体精准分类方面将具有重要意义。
附图说明
图1为本发明基于反蛋白石光子晶体NC膜的单细胞WB流程示意图。
图2为本发明中单细胞分离芯片制备示意图。
图3为本发明中反蛋白石结构光子晶体膜的制备示意图。
其中，附图标记为：1、原位裂解和电泳；2、转膜；3、SERS纳米标签显影；4、SERS成像；5、拉曼光谱分析；6、细胞；7、单细胞分离芯片；8、PAGE胶块；9、分离的蛋白质；10、反蛋白石光子晶体膜；11、SERS纳米标签显影剂；
12、覆盖光刻胶；13、紫外固化；14、光刻；15、模板复制；16、剥离；17、芯片组装；18、硅片或铜片或钢片；19、微柱阵列模板；20、玻璃片或塑料片；21、聚丙烯酰胺凝胶；22、单细胞分离芯片；23、PAGE胶块；
24、光子晶体模板制备；25、硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液灌注；26、模板去除；27、单分散的胶体粒子；28、硅片或玻璃片；29、有序结构的光子晶体膜。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。当然，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法应用于循环肿瘤细胞鉴定分析，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到循环肿瘤细胞的单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离，其中，微孔阵列芯片的制备过程如下：
①光刻胶均匀地旋涂于硅片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过电子束刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板。微柱阵列的圆柱的高度为30μm，直径为20μm；模板的长度为1mm，宽度为500μm；
③在模板上覆盖普通玻璃片，使用注射器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上，其中，反蛋白石结构光子晶体膜的制备过程如下：
①反蛋白石结构光子晶体膜的模板制备：将单分散性的粒径为50nm的二氧化硅胶体粒子离心纯化，之后加入去离子水，配置成浓度为10wt％的胶体粒子溶液，使用垂直沉积法在硅片的衬底上形成均匀的光子晶体模板；
②反蛋白石结构光子晶体膜的制备：配置质量分数为3％的NC溶液，将其灌注于上述制作的模板中，并加热固化，固化的温度保持在40℃；随后加入30％的氢氟酸溶液，浸泡4h，去除二氧化硅纳米粒子，得到具有反蛋白石结构的光子晶体膜。反蛋白石结构的光子晶体膜的长度为1mm，宽度为500μm。
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上，其中，SERS纳米标签显影剂的制备如下：
①选用1nm的金纳米粒子作为SERS纳米标签显影剂信号增强的纳米材料，选用耐尔兰A作为信号标签，通过静电吸附的方式将信号标签连接到金纳米粒子的表面；
②将抗EpCAM、panCK和CK8的抗体通过静电吸附的方式连接于信号标签功能化的金纳米粒子的表面，形成SERS纳米标签显影剂。
4)采用拉曼光谱分析，根据标签的拉曼特征峰强度计算出EpCAM、panCK和CK8的浓度，并依据这些蛋白质的浓度对循环肿瘤细胞进行鉴定。
实施例2
本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法还应用于乳腺癌细胞分型分析，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到乳腺癌细胞的单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离，其中，微孔阵列芯片的制备如下：
①光刻胶均匀地旋涂于铜片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过离子束刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板。微柱阵列的圆柱的高度为50μm，直径为40μm；模板的长度为5cm，宽度为4.5cm；
③在模板上覆盖石英玻璃片，使用滴管导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上，其中，反蛋白石结构光子晶体膜的制备过程如下：
①反蛋白石结构光子晶体膜的模板制备：将单分散性的粒径为200nm的聚苯乙烯胶体粒子离心纯化，之后加入去离子水，配置成浓度为30wt％的胶体粒子溶液，使用静电自组装法在玻璃片的衬底上形成均匀的光子晶体模板；
②反蛋白石结构光子晶体膜的制备：配置质量分数为10％的聚偏二氟乙烯溶液，将其灌注于上述制作的模板中，并加热固化，固化的温度保持在60℃；随后加入四氢呋喃溶液，浸泡4h，去除聚苯乙烯纳米粒子，得到具有反蛋白石结构的光子晶体膜。反蛋白石结构的光子晶体膜的长度为5cm，宽度为4.5cm。
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上，其中，SERS纳米标签显影剂的制备过程如下：
①选用金核银壳纳米粒子作为SERS纳米标签显影剂信号增强的纳米材料，其中金核的尺寸为60nm，银壳的厚度为5nm。选用亚甲基蓝作为信号标签，通过静电吸附的方式将信号标签连接到金核的表面；
②将抗ER、HER2和EGFR的抗体通过静电吸附的方式连接于信号标签功能化的金核银壳纳米粒子的表面，形成SERS纳米标签显影剂。
4)采用拉曼光谱分析，根据标签的拉曼特征峰强度计算出ER、HER2和EGFR的浓度，并依据这些物质的浓度判断乳腺癌患者的预后。
实施例3
本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法又应用于卵母细胞蛋白质分析，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到循环肿瘤细胞的单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离，其中，微孔阵列芯片的制备如下：
①光刻胶均匀地旋涂于钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过X射线刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板。微柱阵列的圆柱的高度为120μm，直径为100μm；模板的长度为5cm，宽度为4.5cm；
③在模板上覆盖聚乙烯塑料片，使用移液器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上，其中，反蛋白石结构光子晶体膜的制备过程如下：
①反蛋白石结构光子晶体膜的模板制备：将单分散性的粒径为10μm的二氧化硅胶体粒子离心纯化，之后加入去离子水，配置成浓度为90wt％的胶体粒子溶液，使用垂直沉积法在硅片的衬底上形成均匀的光子晶体模板；
②反蛋白石结构光子晶体膜的制备：配置质量分数为50％的硝酸纤维素溶液，将其灌注于上述制作的模板中，并加热固化，固化的温度保持在80℃；随后加入30％氢氟酸溶液，浸泡4h，去除二氧化硅胶体粒子，得到具有反蛋白石结构的光子晶体膜。反蛋白石结构的光子晶体膜的长度为5cm，宽度为4.5cm。
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上，其中，SERS纳米标签显影剂的制备过程如下：
①选用金核二氧化硅壳纳米粒子作为SERS纳米标签显影剂信号增强的纳米材料，其中金核的尺寸为200nm，二氧化硅壳的厚度为100nm。选用4-巯基苯甲酸作为信号标签，通过共价结合的方式将信号标签连接到金核的表面；
②将抗WDR5、stella和α-tubulin的抗体通过共价连接的方式修饰到信号标签功能化的金核二氧化硅壳纳米粒子的表面，形成SERS纳米标签显影剂。
4)采用拉曼光谱分析，根据标签的拉曼特征峰强度计算出WDR5、stella和α-tubulin的浓度，并依据这些蛋白靶标的浓度对卵母细胞进行分析。
实施例4
本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法还应用于神经干细胞蛋白质分析，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到神经干细胞的单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离，其中，微孔阵列芯片的制备过程如下：
①光刻胶均匀地旋涂于钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过纳米压印光刻刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板。微柱阵列的圆柱的高度为30μm，直径为20μm；模板的长度为3.5cm，宽度为2cm；
③在模板上覆盖聚丙烯塑料片，使用注射器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上，其中，反蛋白石结构光子晶体膜的制备过程如下：
①反蛋白石结构光子晶体膜的模板制备：将单分散性的粒径为500nm的多孔硅胶体粒子离心纯化，之后加入去离子水，配置成浓度为50wt％的胶体粒子溶液，使用静电自组装法在硅片的衬底上形成均匀的光子晶体模板；
②反蛋白石结构光子晶体膜的制备：配置质量分数为20％的硝酸纤维素溶液，将其灌注于上述制作的模板中，并加热固化，固化的温度保持在50℃；随后加入30％氢氟酸溶液，浸泡4h，去除多孔硅纳米粒子，得到具有反蛋白石结构的光子晶体膜。反蛋白石结构的光子晶体膜的长度为3.5cm，宽度为2cm。
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上，其中，SERS纳米标签显影剂的制备过程如下：
①选用粒径为300nm的银纳米粒子作为SERS纳米标签显影剂信号增强的纳米材料。选用对巯基苯硫酚作为信号标签，通过共价结合的方式将信号标签连接到银纳米粒子的表面；
②将抗EGFP和βTUB的抗体通过静电吸附的方式修饰到信号标签功能化的银纳米粒子的表面，形成SERS纳米标签显影剂。
4)采用拉曼光谱分析，根据标签的拉曼特征峰强度计算出EGFP和βTUB的浓度，并依据这些蛋白靶标的浓度对神经干细胞进行鉴定。
实施例5
本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法又应用于三阴性乳腺癌细胞分析，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到三阴性乳腺癌细胞的单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离，其中，微孔阵列芯片的制备过程如下：
①光刻胶均匀地旋涂于铜片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过激光刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板。微柱阵列的圆柱的高度为60μm，直径为50μm；模板的长度为1.5cm，宽度为1cm；
③在模板上覆盖钢化玻璃片，使用滴管导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上，其中，反蛋白石结构光子晶体膜的制备过程如下：
①反蛋白石结构光子晶体膜的模板制备：将单分散性的粒径为700nm的聚甲基丙烯酸甲酯胶体粒子离心纯化，之后加入去离子水，配置成浓度为70wt％的胶体粒子溶液，使用垂直沉积法在玻璃片的衬底上形成均匀的光子晶体模板；
②反蛋白石结构光子晶体膜的制备：配置质量分数为30％的聚偏二氟乙烯溶液，将其灌注于上述制作的模板中，并加热固化，固化的温度保持在70℃；随后加入二甲基甲酰胺溶液，浸泡4h，去除聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒子，得到具有反蛋白石结构的光子晶体膜。反蛋白石结构的光子晶体膜的长度为1.5cm，宽度为1cm。
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石光子晶体结构转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上，其中，SERS纳米标签显影剂的制备过程如下：
①选用金核金壳纳米粒子作为SERS纳米标签显影剂信号增强的纳米材料，其中金核的尺寸为100nm，银壳的厚度为50nm。选用结晶紫作为信号标签，通过静电吸附的方式将信号标签连接到金核的表面；
②将抗PD-L1的抗体通过静电吸附的方式连接于信号标签功能化的金核金壳纳米粒子的表面，形成SERS纳米标签显影剂。
4)采用拉曼光谱分析，根据标签的拉曼特征峰强度计算出PD-L1的浓度，并依据PD-L1的浓度判断肿瘤的转移和免疫逃逸。
实施例6
本发明提供的一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法还应用于人类胶质母细胞瘤细胞鉴定分析，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到人类胶质母细胞瘤细胞的单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离，其中，微孔阵列芯片的制备过程如下：
①光刻胶均匀地旋涂于钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过紫外光刻的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板。微柱阵列的圆柱的高度为40μm，直径为32μm；模板的长度为4cm，宽度为3cm；
③在模板上覆盖聚苯乙烯塑料片，使用移液器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上，其中，反蛋白石结构光子晶体膜的制备过程如下：
①反蛋白石结构光子晶体膜的模板制备：将单分散性的粒径为1μm的二氧化硅胶体粒子离心纯化，之后加入去离子水，配置成浓度为60wt％的胶体粒子溶液，使用垂直沉积法在硅片的衬底上形成均匀的光子晶体模板；
②反蛋白石结构光子晶体膜的制备：配置质量分数为23％的硝酸纤维素溶液，将其灌注于上述制作的模板中，并加热固化，固化的温度保持在70℃；随后加入30％氢氟酸溶液，浸泡4h，去除二氧化硅胶体粒子，得到具有反蛋白石结构的光子晶体膜。反蛋白石结构的光子晶体膜的长度为4cm，宽度为3cm。
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石光子晶体结构转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上，其中，SERS纳米标签显影剂的制备过程如下：
①选用二氧化硅核金壳纳米粒子作为SERS纳米标签显影剂信号增强的纳米材料，其中二氧化硅核的尺寸为150nm，金壳的厚度为70nm。选用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)作为信号标签，通过共价结合的方式将信号标签连接到二氧化硅核的表面；
②将抗turboGFP、β-tubulin和PTBP1的抗体通过共价连接的方式修饰到信号标签功能化的二氧化硅核金壳纳米粒子的表面，形成SERS纳米标签显影剂。
4)采用拉曼光谱分析，根据标签的拉曼特征峰强度计算出turboGFP、β-tubulin和PTBP1的浓度，并依据这些蛋白靶标的浓度对人类胶质母细胞瘤细胞进行鉴定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，任何在此基础上，对其中配方和工艺的局部变动，都应在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过单细胞分离芯片组成的微孔阵列芯片，物理分离得到单细胞，并原位裂解单细胞进行蛋白质的电泳分离；
2)将经过电泳分离得到的蛋白质条带转印到反蛋白石结构光子晶体膜上；
3)SERS纳米标签显影剂与反蛋白石结构光子晶体转印膜孵育，通过SERS成像技术将蛋白质显影在条带上；
4)采用拉曼光谱分析，根据纳米标签的拉曼特征峰强度计算出每一种蛋白质的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤1)中的微孔阵列芯片的制备步骤如下：
①光刻胶均匀地旋涂于硅片或铜片或钢片上，并采用紫外光照射固化光刻胶；
②通过光刻刻蚀的方式形成光刻胶微柱阵列，并作为单细胞分离芯片的制备模板；
③在模板上覆盖玻璃片或塑料片，使用注射器或滴管或移液器导入丙烯酰胺水凝胶的前聚体溶液；
④固化后，将丙烯酰胺水凝胶胶块从模板上剥离下来，得到单细胞分离芯片；
⑤把单细胞分离芯片组装到聚丙烯酰胺配置胶块上，形成微孔阵列芯片。
3.根据权利要求2所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤②中所使用的光刻可以是紫外光刻、电子束光刻、离子束光刻、X射线光刻、纳米压印光刻或激光刻蚀的一种。
4.根据权利要求2所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤②中的微柱阵列的圆柱的高度为1μm～120μm，直径为1μm～100μm；模板的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。
5.根据权利要求2所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤③中所使用的玻璃片是石英玻璃片、钢化玻璃片或硼酸盐玻璃片的一种。塑料片是聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯塑料的一种。
6.根据权利要求1所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤2)中的反蛋白石结构光子晶体膜的制备步骤如下：
①将单分散胶体粒子通过垂直沉积或静电自组装的方式在硅片或玻璃片上形成光子晶体薄膜，并将此薄膜作为反蛋白石结构光子晶体膜的制作模板；
②将硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液灌注到模板中，并加热固化；
③通过氢氟酸、二甲基甲酰胺或四氢呋喃的浸泡，或加热的方式，将模板粒子去除，得到反蛋白石结构光子晶体膜。
7.根据权利要求6所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤①中的单分散胶体粒子为聚苯乙烯、多孔硅、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚乙烯、二氧化硅或二氧化钛的一种；
所述步骤①中的单分散胶体粒子直径为50nm～10μm，所述的单分散胶体纳米粒子溶液中胶体纳米粒子的浓度为10wt％～90wt％。
8.根据权利要求6所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤②中的硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯溶液的浓度为3％～50％；固化的温度范围在40℃～80℃。
9.根据权利要求6所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤③中的反蛋白石结构光子晶体膜的长度为1mm～5cm，宽度为500μm～4.5cm。
10.根据权利要求1所述的基于电泳技术的单细胞蛋白质定量分析方法，其特征在于，所述步骤3)中的SERS纳米标签显影剂有三部分组成；第一部分是信号标签；第二部分是增强信号标签的纳米材料；第三部分是检测抗体；
所述信号标签为具有拉曼活性的分子；
所述增强信号标签的纳米材料包括两类：第一类是单金属纳米粒子，其粒径分布范围为1～300nm；第二类是核壳纳米粒子，其核的尺寸范围为1～200nm；壳的厚度范围为1～100nm；
所述信号标签修饰到纳米材料是通过静电吸附或共价连接的方式将标签固定在纳米粒子的表面或核壳结构纳米粒子的核壳间隙处；检测抗体修饰到纳米材料表面是通过静电吸附或共价连接的方式固定。
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