CN103411947A

CN103411947A - 一种sers基底与蛋白质交替芯片的制备方法

Info

Publication number: CN103411947A
Application number: CN2013102542626A
Authority: CN
Inventors: 阮伟东; 王海阳; 赵冰; 王旭; 宋薇
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-11-27

Abstract

一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，属于SERS基底技术领域，具体涉及一种SERS基底与蛋白质交替的芯片制备方法。包括将玻璃片表面进行醛基化、自组装单层有序模板、修饰一层Au纳米粒子及BSA封闭、除去模板得到具有SERS基底的阵列结构、进行免疫反应等步骤，从而获得SERS基底与蛋白质交替的芯片结构。这种方法能够实现SERS光谱检测，维持了蛋白质样品原有的性质。固定在基片上的SERS基底可被封闭，从而减少对生物分子特异性识别的影响，为基于SERS检测的器件发展提供了一个新的思路。

Description

一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法

技术领域

本发明属于SERS基底技术领域，具体涉及一种SERS基底与蛋白质交替的芯片制备方法。

背景技术

蛋白质芯片，又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。蛋白质芯片技术目前已经被广泛的应用于多重组化免疫检测、细菌检测、神经细胞生长监控等等。

在检测手段上，荧光标记法是较常用的蛋白质检测技术。荧光标记法具有廉价、方便、肉眼可见的优点，但是，荧光光谱同时具有稳定性差、谱带重叠、易发生淬灭等缺点，限制了这种检测方法的应用。表面增强拉曼散射（SERS）光谱具有高灵敏度、高选择性、原位检测、痕量检测、不受溶剂水的影响和提供分子指纹信息等优点，使其成为蛋白质分子潜在的检测技术。

利用SERS光谱检测蛋白质分子的方法通常包含SERS基底材料，即金或银纳米粒子与蛋白质分子的直接结合，这样蛋白质样品表面大量分散SERS基底，SERS基底干扰生物分子的特异性识别。

发明内容

本发明的目的是提出一种SERS基底与蛋白质交替的芯片制备方法。其是先制备高SERS活性的基底阵列结构，然后将蛋白质嵌入其中，实现SERS基底和蛋白质分子的周期性复合，制备高度有序的蛋白质芯片。

本发明通过利用单层聚苯乙烯(PS)微球模板，发展了一种简洁、轻便、耐用的蛋白质阵列的制造技术。以SERS基底做为固载相，可以直接应用SERS方法进行检测。

本发明所述的一种SERS基底与蛋白质交替的芯片制备方法，其制备过程如下：（a）将玻璃片表面进行醛基化（蛋白质分子中的氨基能够同醛基形成共价键）；（b）在醛基化的玻璃片表面自组装单层有序的聚苯乙烯（PS）微球；（c）在聚苯乙烯（PS）微球表面修饰一层金纳米粒子，之后浸泡在封闭液（0.01M、pH7.2、BSA质量浓度1%的磷酸缓冲溶液，BSA：牛血清蛋白）中进行封闭；（d）洗去玻璃片表面的聚苯乙烯（PS）微球，得到中间是空洞（露出玻璃片表面）、周围是金纳米粒子的纳米井结构阵列；（e）进行免疫反应，将具有纳米井结构阵列的玻璃片在含有亲和素（浓度为10ng/mL～10ug/mL）的磷酸缓冲溶液（PBS：0.01M、pH7.2，其中Nacl质量浓度0.8%、KH₂PO₄质量浓度0.02%）中，37～40℃条件下浸泡1～3h，洗涤液（0.01M、pH7.2、Tween20质量浓度0.05%的磷酸缓冲溶液）冲洗，N₂吹干；然后在封闭液中，37～40℃条件下浸泡1～3h，洗涤液冲洗，N₂吹干；最后在含有Atto-610标记的生物素的磷酸缓冲溶液中（浓度为100pg/mL～1ug/mL），37～40℃条件下浸泡1～3h；将亲和素及Atto-610标记的生物素先后嵌入到纳米井结构中，从而得到SERS基底与蛋白质交替的芯片结构；（f）对所得芯片进行SERS检测。

上述方法中，玻璃片表面进行醛基化是将玻璃片浸入由体积比3：7的30％（V：V）H₂O₂和98％（g：g）H₂SO₄的混合溶液中煮沸至气泡消失，冷却后，将玻璃片用去离子水反复冲洗，氮气吹干；然后将玻璃片再浸泡在体积分数2％（V:V）（3-氨丙基）三甲氧基硅烷（APTMS）的无水乙醇溶液中30～60min，用无水乙醇冲洗，氮气吹干；最后，将玻璃片再浸入到体积分数2.5％（V:V）戊二醛的水溶液中2～3h，用去离子水冲洗3～5次，氮气吹干。

上述的聚苯乙烯(PS)微球直径为400nm～1um，可按文献（2007年吉林大学博士学位论文《两类有序薄膜的制备及其作为SERS基底的研究》第34～36页）乳胶制备的方法制备得到。

上述的在聚苯乙烯(PS)微球表面修饰一层金纳米粒子是将组装聚苯乙烯（PS）微球后的玻璃片在5～15mL的Au溶胶中浸泡12～20h。

上述的洗去聚苯乙烯（PS）微球是将玻璃片在磷酸缓冲溶液（PBS）中37℃超声清洗。

本发明的优点在于：

(1)这种方法可以作为表面固载SERS基底和蛋白质交替结构的方法。

(2)利用交替结构实现SERS光谱检测，避免在蛋白质样品表面大量分散SERS基底，从而维持了蛋白质样品原有的性质，避免了非特异性识别的干扰。

(3)完整无损的蛋白质点阵结构为与其它蛋白质芯片的检测技术的联用提供了可能。

附图说明

图1：本发明所述一种SERS基底与蛋白质交替的芯片制备方法过程示图，步骤（1）是得到表面醛基化的玻璃片；步骤（2）是在醛基化的玻璃片表面自组装单层有序的聚苯乙烯（PS）微球；步骤（3）是在聚苯乙烯（PS）微球表面修饰一层金纳米粒子，步骤（4）是用封闭液（0.01M，pH7.2的PBS缓冲溶液中包含质量浓度1%的BSA）封闭金纳米粒子；步骤（5）是洗去聚苯乙烯(PS)微球，得到SERS基底的阵列结构；步骤（6）是进行免疫反应，将亲和素和Atto-610标记的生物素先后嵌入到SERS基底的阵列结构中，从而得到SERS基底与蛋白质交替的芯片结构；

图2：本发明所述的聚苯乙烯（PS）微球模板的扫描电镜照片；

图3：本发明所述的聚苯乙烯（PS）微球模版修饰Au纳米粒子后的扫描电镜照片；

图4：本发明所述的洗去聚苯乙烯（PS）微球后的SERS基底扫描电镜照片；

图5：本发明所述的蛋白质芯片的SERS谱图。

具体实施方式

实施例1：

1.醛基化

将玻璃片浸入由体积比为3:7的30％（V:V）H₂O₂和98％（g:g）H₂SO₄溶液中煮沸至气泡消失。冷却后，玻璃片用去离子水反复冲洗，氮气吹干。

将上述玻璃片再浸泡在2％（V:V）（3-氨丙基）三甲氧基硅烷（APTMS,西格玛购买）的无水乙醇溶液中30min，无水乙醇冲洗，氮气吹干。

将上述玻璃片再浸入到2.5％（V:V）的戊二醛（北京化学试剂公司购买）水溶液中2h，去离子水冲洗，氮气吹干，得到醛基化玻璃片，如图1中步骤（1）所示。

组装聚苯乙烯PS微球

在醛基化玻璃片表面用Langmuir-Blodgett方法（将兼具亲水和疏水的两亲性分子，此处为聚苯乙烯微球分散在水面上，逐渐压缩其水面上的占有面积，使其排列成单分子层，再将其转移沉淀到固体基片上）自组装单层有序的聚苯乙烯（PS，自己合成）微球作为模板，如图1中步骤（2）所示。其扫描电镜照片如图2所示，从图中可以看出聚苯乙烯（PS）微球呈紧密的六方密堆积，尺寸为700nm；

3.修饰Au纳米粒子

取5mL金溶胶，金溶胶的制备方法如下：99mL去离子水中加入1mLHAucl₄mL(1%,w/v，北京化学试剂公司购买)，沸腾后加入4mL、1mg/mL的柠檬酸钠（北京化学试剂公司购买）待溶液变成酒红色，维持沸腾状态15min，停止反应，得到100mL酒红色的金溶胶。得到的金纳米粒子呈球形，平均粒径为20nm。将PS模板在浸泡金溶胶中16h，洗涤液冲洗，氮气吹干。如图1中步骤（3）所示。

将样品浸泡在封闭液（0.01M、pH7.2、BSA质量浓度1%的磷酸缓冲溶液，BSA从西格玛购买）中37℃下2h，对Au纳米粒子进行封闭。洗涤液（0.01M、pH7.2、Tween20质量浓度0.05%的磷酸缓冲溶液，Tween20北京化学试剂公司购买）冲洗，氮气吹干。如图1中步骤（4）所示。其扫描电镜照片如图3所示。从图中可以看出聚苯乙烯（PS）微球上均匀的长了一层Au纳米粒子。

将处理后的样品在磷酸缓冲溶液（PBS），37℃下超声，洗去PS微球模板，洗涤液冲洗，氮气吹干，得到图案化的阵列结构，如图1中步骤（5）所示。其扫描电镜照片如图4所示。图中圆形部分是原来聚苯乙烯微球（PS）占据的位置，同时可以看出孔洞周围Au纳米粒子均匀的长在玻璃片上。

4.免疫反应

（1）将上面得到的基片浸入到浓度为250ng/mL的亲和素（西格玛购买）的磷酸缓冲溶液（PBS）中，37℃下2h，使亲和素能够生长到SRES基底的阵列结构中。洗涤液（0.01M、pH7.2、Tween20质量浓度0.05%的磷酸缓冲溶液）冲洗3次，氮气吹干。

（2）将得到的样品浸泡在封闭液（0.01M、pH7.2、BSA质量浓度1%的磷酸缓冲溶液）中37℃下2h，对蛋白质进行封闭，以避免待测蛋白质的非特异性识别。洗涤液（0.01M，pH7.2的PBS缓冲溶液中包含质量浓度0.05%的Tween20）冲洗3次，氮气吹干。

（3）将此样品在不同浓度（10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1ug/mL）Atto-610标记的生物素（西格玛购买）的磷酸缓冲溶液（PBS）中进行免疫识别反应，Atto-610标记的生物素便可以与亲和素特异性识别。如图1中步骤（6）所示，

5.SERS光谱检测

我们对不同浓度Atto-610标记的生物素进行免疫识别反应后所得芯片进行SERS检测，获得SERS谱图，如图5所示，最低检测浓度为100pg/mL。如不是采用本发明所述的基底，SERS光谱检测Atto-610标记的生物素的最低检测浓度是1ug/mL。

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。

亲和素和Atto-610标记的生物素作为一组检测物，Atto-610标记的生物素与亲和素特异性识别，通过检测Atto-610标记的生物素的SERS信号，表明我们所制备的这种SERS基底与蛋白质交替的芯片有很好的SERS活性。

Claims

1.一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，其步骤如下：

1)将玻璃片表面进行醛基化；

2)在醛基化的玻璃片表面自组装单层有序的聚苯乙烯微球(ps)；

3)在聚苯乙烯微球表面修饰一层金纳米粒子，之后浸泡在封闭液中进行封闭，封闭液为0.01M、pH7.2、BSA质量浓度1%的磷酸缓冲溶液；

4)洗去玻璃片表面的聚苯乙烯微球，得到中间是露出玻璃片表面的空洞、周围是金纳米粒子的纳米井结构SERS阵列；

5)进行免疫反应，将具有纳米井结构SERS阵列的玻璃片在含有亲和素的磷酸缓冲溶液中，37～40℃条件下浸泡1～3h，洗涤液冲洗，N₂吹干；然后在封闭液中，37～40℃条件下浸泡1～3h，洗涤液冲洗，N₂吹干；最后在含有Atto-610标记的生物素的磷酸缓冲溶液中，37～40℃条件下浸泡1～3h；将亲和素及Atto-610标记的生物素先后嵌入到纳米井结构中，从而得到SERS基底与蛋白质交替的芯片结构；洗涤液为0.01M、pH7.2、Tween20质量浓度0.05%的磷酸缓冲溶液。

2.如权利要求1所述的一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，其特征在于：上述方法中，将玻璃片表面进行醛基化是将玻璃片浸入到H₂O₂和H₂SO₄的混合溶液中煮沸至气泡消失，冷却后，将玻璃片用去离子水反复冲洗，氮气吹干；然后将玻璃片再浸泡在体积分数2％的（3-氨丙基）三甲氧基硅烷的无水乙醇溶液中30～60min，用无水乙醇冲洗，氮气吹干；最后，将玻璃片再浸入到体积分数2.5％的戊二醛的水溶液中2～3h，用去离子水冲洗3～5次，氮气吹干。

3.如权利要求1所述的一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，其特征在于：聚苯乙烯微球的直径为400nm～1um。

4.如权利要求1所述的一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，其特征在于：在聚苯乙烯微球表面修饰一层金纳米粒子是将自组装有聚苯乙烯微球的玻璃片在5～15mL的Au溶胶中浸泡12～20h。

5.如权利要求1所述的一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，其特征在于：亲和素的浓度为10ng/mL～10ug/mL。

6.如权利要求1所述的一种SERS基底与蛋白质交替芯片的制备方法，其特征在于：Atto-610标记的生物素的浓度为100pg/mL～1ug/mL。