CN111774110A - 一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流控芯片、细胞操作、生物分析领域，特别涉及一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片。包括生物分析基底和微孔阵列芯片，微孔阵列芯片包括基底和基底上由若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔的微孔开口的内径小于微孔孔腔的内径。本发明的微孔结构，微孔开口直径略大于细胞直径，可实现单细胞捕获，且细胞进入微孔孔腔后，不易流失，可用于同个细胞多时间点检测，其微孔孔腔可为各种细胞的长时间培养提供充足空间和培养液。本发明的生物分析芯片可用于细胞多指标生物分子分析、细胞多指标多时间点动态生物分子分析、单细胞多指标多时间点的生物分子分析，如分泌蛋白谱分析、外泌体分析。

Description

一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片
技术领域
本发明涉及微流控芯片、细胞操作、生物分析领域，特别涉及一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片。
背景技术
单细胞分析最具挑战性的部分就是单细胞捕获，在微流控芯片上的单细胞捕获程序应操作简单高效，并能维持单细胞活性。目前现有的单细胞捕获技术大致分为两种：一种不通过外力施加，通过芯片上的微结构捕获细胞悬液中的细胞，如流体动力学法和微流控法；一种通过施加外力如光、声、电、磁等驱动细胞移动进行捕获，如介电电泳法。现有的单细胞捕获技术，很难在保证细胞的活性前提下，对其进行长时间的培养与动态检测。
细胞分泌物，包括细胞因子，趋化因子等，是关键的可溶性生物信号分子，由不同类型的细胞产生，以在一系列生物学和临床环境中介导细胞间的通讯。例如，先天性免疫细胞将产生一系列细胞因子，以提供第一道保护作用，抵抗细菌感染或组织损伤，从而保护人类健康。嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的多功能分布，表征了每个细胞共同分泌的蛋白质数量，与免疫疗法临床试验中患者的客观反应密切相关。因此，在单个细胞水平上多重检测这些分泌的效应蛋白对于为免疫学，癌症研究等基础研究和治疗干预提供关键的深入信息非常重要。由于常规单细胞分析的局限性，在进行单细胞蛋白分析的过程中，细胞损失严重，很难连续对同一细胞进行多次分泌检测操作。
为解决以上问题，本发明所运用流体动力学捕获方法，方法操作简单，不需要特殊的缓冲液，通过合理设计芯片中与捕获细胞大小相当的微孔结构，和下层微孔阵列结构的基底，可以实现高通量单细胞捕获以及捕获后的长期培养。该结构将单细胞固定在捕获位点，方便单细胞的实时观察，可连续对阵列中大量单细胞的多时间点进行细胞分泌物跟踪检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种可实现细胞捕获与固定生物分析的芯片，可为高通量剖析单细胞细胞分泌因子提供动态信息，以更好地了解各个免疫细胞如何随时间对病原体挑战做出反应，来调节人类健康和疾病。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
本发明第一方面提供了一种可实现细胞捕获与固定的芯片，包括微孔阵列芯片，微孔阵列芯片包括基底和基底上由若干微孔构成的微孔阵列，所述微孔包括微孔开口和微孔孔腔，所述微孔的微孔开口的内径小于微孔孔腔的内径。
上述技术方案中，进一步地，所述微孔开口的形状为正多边形、矩形或圆形，微孔开口内径为1μm～1cm，微孔开口的高度为1μm～1mm；所述微孔孔腔的形状为正多边形、矩形或圆形，微孔孔腔内径为10μm～10cm，微孔孔腔高度为1μm-1cm。
上述技术方案中，进一步地，所述微孔阵列芯片的微孔数目为1～1000000个/cm2，相邻两个微孔中心之间的距离为21μm～21cm，所述微孔阵列芯片厚度为0.5mm～5cm。
上述技术方案中，进一步地，所述微孔阵列芯片由弹性材料制成，所述弹性材料包括PDMS及做亲水处理后的的PDMS、POE、EVA、EPDM等。
本发明第二方面提供了一种可实现细胞捕获与固定的芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过将PDMS预聚物以一定速度旋转到用光刻法制得的模具上来制造微孔开口；
(2)将PDMS预聚物倾倒在用光刻法制得的模具上加热固化，得到微孔孔腔；
(3)将微孔开口与微孔孔腔两者对齐，加热键合，得到完整芯片；
所述模具在使用前用三甲基氯硅烷处理过夜，以促进PDMS释放。
本发明第三方面提供了一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片，包括生物分析基底和前述的可实现细胞捕获与固定的芯片。
上述技术方案中，进一步地，所述生物分析基底包括玻片、硅片、云母片、硝酸纤维素膜或包被了试剂的载玻片，所述生物分析基底上包被有蛋白阵列、抗体阵列、DNA阵列、蛋白、抗体或DNA中的一种或多种；所述试剂为多聚赖氨酸。
本发明第四方面提供了前述可实现细胞捕获与固定的芯片在多种细胞分析、多种细胞的单细胞分析、多种细胞的多重生物分子分析或多种细胞的单细胞多重生物分子分析中的应用。
上述技术方案中，进一步地，所述多种细胞包括哺乳动物细胞。
上述技术方案中，进一步地，所述多重生物分子分析包括分泌蛋白、细胞因子、多肽、肽段、核酸、细胞表面蛋白、细胞表面受体、激素、抗原、生长因子或外泌体的分析，所述多重分析包括1到100个指标的分析。
本发明第五方面提供了前述可实现细胞捕获与固定的芯片在细胞的多时间点动态检测中的应用，所述多时间点为0～24h，动态检测次数为0～100次。
上述技术方案中，进一步地，用于分泌蛋白检测分析时，将细胞接种在微孔阵列芯片上，在微孔阵列芯片上盖上生物分析基底，置培养箱中培养，显微镜拍照，采用夹心免疫法进行分泌蛋白检测；所述细胞接种数目为100～200000。
与现有技术相比，本发明有益效果：
(1)本发明的微孔结构，微孔开口直径略大于细胞直径，可实现单细胞捕获，且细胞进入微孔空腔后，不易流失，可用于同个细胞多时间点检测；
(2)本发明的微孔孔腔可为各种细胞的长时间培养提供充足空间和培养液；
(3)本发明的生物分析芯片可用于细胞多指标生物分子分析，分析检测这些生物分子，不仅在基础生物学中具有很重要的价值，还可以应用到疾病诊断和治疗监测；
(4)本发明的生物分析芯片可用于细胞多指标多时间点动态生物分子分析，更贴近细胞在人体中真实生存环境，可进行药物代谢检测；
(5)本发明的生物分析芯片可用于单细胞多指标多时间点的生物分子分析，如分泌蛋白谱分析、外泌体分析，单细胞具有多功能性，因此在单细胞水平上测量一组生物分子具有生物学意义。
附图说明
图1为本发明所述实现细胞捕获与多时间点动态检测的生物分析的芯片结构示意图；
图2为本发明所述芯片应用于分泌蛋白检测时的芯片示意图；
图3为本发明所述芯片应用于分泌蛋白检测时的芯片俯视图；
图4为生物分析芯片的制备方法示意图；
图5为生物分析芯片的硅模板的制备方法示意图；
图6为动态检测实验流程图；
图7为生物分析芯片的扫描电镜图；a.正面扫描电镜图，b.正面放大扫描电镜图，c.芯片侧面扫描电镜图；
图8为生物分析芯片实物扫描图及依次放大倍数扫描图；
图9为生物分析多次揭盖玻片贴壁细胞荧光图；
图10为生物分析多次揭盖玻片贴壁细胞细胞留存率；
图11为生物分析芯片多次揭盖玻片悬浮细胞荧光图；
图12为生物分析芯片多次揭盖玻片悬浮细胞细胞留存率；
图13为生物分析芯片的微孔单细胞分布结果图，其中横坐标为孔内细胞个数，纵坐标为与之相对应的微孔数目占总微孔数目的比例；
图14为生物分析芯片动态检测中U937单细胞各种分泌蛋白实验结果图；
图15为生物分析芯片动态检测中不同微孔内细胞生长情况随时间变化图；
图16为实施例4信号强度统计散点图；
图17为每个孔内的细胞分布情况(图中数字标注的为孔内细胞数目)与之相对应分泌物的信号和细胞裂解后检测到的裂解物信号；
图18为实施例5信号强度统计散点图；
图19为生物分析芯片立体结构示意图；
图中，1.生物分析基底，2.微孔阵列芯片，3.微孔开口，4.微孔孔腔，5.夹具，6.微孔开口阵列硅模板，7.微孔孔腔阵列硅模板，8.硅片，9.光刻胶，10.掩膜。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步解释说明，但并不限于将发明限制在所述的实施例中。
实施例1
一种可实现细胞捕获与固定的生物分析的芯片，如图1～图3所示。该芯片包括二层结构，依次为生物分析基底1，微孔阵列芯片2，微孔阵列芯片2的微孔开口3和微孔孔腔4分别制作完成，通过热键合使其结合，得到完整的微孔阵列芯片2。
所述微孔阵列芯片2为PDMS微孔阵列芯片。
本实施例中PDMS微孔阵列芯片，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，如图4、图5所示，具体包括以下步骤：
步骤一：按质量比10:1混合PDMS(A胶和B胶(PDMS交联剂)搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤二：将PDMS倒在微孔开口3硅模板6上，用匀胶机进行甩胶，甩胶条件为：500rpm18s+1600rpm 60s；所述硅模板6包含4×11个正方形单元，每个正方形单元由10×10的圆柱形微柱组成，微柱直径为30μm，高度约为130μm，每两个相邻的微柱中心的距离450μm，每两个相邻的正方形单元中心的距离为5.5mm；将混合好PDMS倒在圆形阵列硅模板硅模板5上，高度约为4mm；
所述微孔开口3硅模板6与微孔孔腔4硅模板7上的微米图型结构由光刻制得，具体工艺参数为：硅片8预烘105℃10min；O2 plasma仪器处理3min；甩光刻胶(SU-8)10500rpm18s+1000rpm 60s；前烘95℃15min；二次甩光刻胶500rpm 18s+1000rpm 60s；二次前烘95℃30min；测量光刻强度为9.8mW/cm2，将掩膜10置于光刻胶9上，分三次曝光(12s+12s+12s)；后烘95℃1min；乳酸乙酯显影后坚模165℃0.5h；熏三甲基氯硅烷过夜(12h)。
步骤三：将浇注了PDMS的硅模板6与7置于热板上80℃加热30min，使PDMS发生交联而固化；
步骤四：将冷却后硅模板7上的微孔阵列基底3切割下来，与硅模板6上的小孔结构一一对齐后，放入烘箱80℃加热2h后，得到所述PDMS微孔阵列芯片。
实施例2
本实施例中的芯片通过使用U937(人组织细胞淋巴瘤细胞，ATCC-CRL-1593.2)悬浮细胞与scc6(口腔鳞癌细胞)贴壁细胞来验证实施例1的微孔阵列芯片在多时间点检测时，细胞存留状况。本实施例实验流程如图6所示，包括以下步骤：
步骤一：准备多块干净玻片，细胞用钙黄绿素染色；
步骤二：将PDMS微孔阵列芯片打PLASMA亲水处理；
步骤三：将以上两种细胞以1×105cells/ml，400μl/chip分别接种在PDMS微孔阵列芯片上；
步骤四：盖上一块干净玻片，用夹具将芯片固定；
步骤五：显微镜明场、荧光拍照；
步骤六：卸下夹具，将芯片放入培养箱内培养2h后，重新盖上一块干净玻片，用夹具将芯片固定
步骤七：重复操作以上步骤三次。
本实施例结果见图7～12。图7为生物分析芯片扫描电镜图，从图中可以看出所成功制作出微孔阵列与下层微孔阵列基底相融合的芯片；图8为生物分析芯片实物大图扫描图；图9为贴壁细胞经过四次揭盖玻片后，同一位置留存细胞的荧光图，其中圆圈标注为存在细胞的微孔，可知经过四次操作，细胞仍然在孔内；图10为贴壁细胞留存率结果图，四次实验之后的留存率为98.4％；图11为悬浮细胞四次揭盖玻片后，同一位置留存细胞的荧光图，其中圆圈标注为存在细胞的微孔，可知经过四次操作，细胞仍然在孔内；图12为悬浮细胞留存率结果图，四次实验之后的留存率为92％；验证了通过生物分析芯片进行动态检测的可行性，为接下来的分泌蛋白检测提供可靠依据。
实施例3
一种可实现细胞捕获与固定的生物分析的芯片，如图1～图3所示。该芯片包括二层结构，依次为生物分析基底1，窄口宽底微孔阵列芯片，其中窄口微孔与宽底微孔分别制作完成，通过热键合使其结合，得到完整的窄口宽底微孔阵列芯片4。
所述生物分析芯片4为PDMS微孔阵列芯片。
所述生物分析基底为包被了抗体阵列的多聚赖氨酸玻片。
本实施例中PDMS微孔阵列芯片，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，如图4、图5所示，具体步骤如实例1：
本实施例中的芯片用于U937单细胞多种分泌蛋白分析，实验流程如图6所示，包括以下步骤：
步骤一：在多聚赖氨酸玻片(生物分析基底)上包被上IL-8、TNF-a、IL-6捕获抗体；
步骤二：以1×105cells/ml，400μl/chip分别将U937单细胞接种在生物分析芯片上；
步骤三：盖上步骤一获得的生物分析基底，用夹具将芯片固定，置37℃培养箱培养4h；
步骤四：显微镜明场、荧光拍照；
步骤五：卸下夹具，多聚赖氨酸玻片进行后续ELISA检测，芯片扫描仪扫描。
步骤六：重复操作步骤一、三、四、五，盖上步骤一获得的生物分析基底，用夹具将芯片固定，置37℃培养箱培养4h，一天检测两个时间点，每四小时检测一次；连续检测三天。
本实施例结果见图13、14。图13为u937单细胞细胞数目分布结果图，从图中可以看出本发明的生物分析芯片，可高通量的捕获单细胞，为后续的单细胞实验结果分析，提高大量可靠的样本数据。图14为芯片中U937单细胞各个蛋白随检测时间点荧光信号变化趋势图，从图中可以看单个细胞在分泌蛋白时，不是持续分泌，而是存在一种“开关”状态，说明了同种细胞在效应反应时一种高度动态的过程，成功的构建了单细胞动态检测平台。
实施例4
本实施例将人口腔鳞状细胞癌SCC25再次应用于上述芯片，进行单细胞分泌EVs动态检测，以及EVs和蛋白同时动态检测。动态检测时长为3天，每天检测两个时间点。
为了观察细胞在芯片上的生长情况，我们将细胞用cell tracker染色后滴加到芯片上，每间隔一段时间利用显微镜给芯片大图扫描。EVs动态检测的对象是CD9+EVs和CD63+EVs,EVs和蛋白同时动态检测对象是CD81+EVs和IL-8，即在玻璃片上同时包被CD81和IL-8两种抗体来捕获。下面以CD9+EVs动态检测为例进行具体说明，具体包括以下步骤：
步骤一：分别在六块多聚赖氨酸黏附玻璃片上包被捕获抗体CD9；
步骤二：将SCC25细胞从培养瓶中消化下来，并用钙黄绿素给细胞染色，最后将细胞密度稀释为1×105cells/mL；
步骤三：将芯片Plasma亲水处理，把稀释好的细胞悬液400μL均匀滴加到芯片上，静置10分钟后，用培养液把芯片上多余的细胞冲走；
步骤四：在芯片上方盖第一块包被有捕获抗体的玻片，用夹具将玻片和芯片二者夹紧；
步骤五：把上述装置放进37℃，5％CO2培养箱中培养30min后，利用荧光显微镜给芯片大图扫描，以记录细胞在芯片上的分布情况；
步骤六：继续将上述装置放进培养箱培养到4h，揭下第一片玻片对4h捕获到的CD9+EVs检测。同时将第二块玻片盖到芯片上，用夹具夹紧，放进培养箱培养到8h，揭下第二片玻片对4-8h捕获到的CD9+EVs检测。
步骤七：芯片放进培养箱过夜孵育。
步骤八：同步骤六，检测24h-28h以及28h-32h捕获到的CD9+EVs.
步骤九：芯片放进培养箱过夜孵育。
步骤十：同步骤六，检测48h-52h以及52h-56h捕获到的CD9+EVs.
本实施例结果见图15，16，图15所示为部分微孔里细胞78h内的生长情况，可见细胞在微孔里增值，生长状况良好，并有成球趋势。图16为同个单细胞所对应的外泌体以及分泌蛋白，随着检测时间点而变化的趋势图，可有得出本生物芯片不仅可以检测分泌蛋白，还可以检测外泌体。
实施例5
本实施例将人口腔鳞状细胞癌细胞SCC25应用于上述芯片，进行单细胞分泌物(Extracellular Vesicles,EVs)检测和细胞裂解物检测。具体包括以下步骤：
步骤一：分别在两块多聚赖氨酸黏附玻璃片上包被捕获抗体CD9；
步骤二：将SCC25细胞从培养瓶中消化下来，并用钙黄绿素给细胞染色，最后将细胞密度稀释为1×105cells/mL；
步骤三：将芯片Plasma亲水处理，把稀释好的细胞悬液400μL均匀滴加到芯片上，静置10分钟后，用培养液把芯片上多余的细胞冲走；
步骤四：在芯片上方盖上一块包被有捕获抗体的玻片，用夹具将玻片和芯片二者夹紧；
步骤五：把上述装置放进37℃，5％CO2培养箱中培养30min后，利用荧光显微镜给芯片大图扫描，以记录细胞在芯片上的分布情况；
步骤六：继续将上述装置放进培养箱培养到18h；
步骤七：拆开夹具，在玻片上依次滴加生物素化的抗体(biotin-CD9)和荧光标记的链霉亲合素(streptavidin-APC)进行单细胞分泌物(EVs)检测。
步骤八：芯片上滴加细胞裂解液，在芯片上方盖另外一块抗体玻片，仍然用夹具将二者夹紧。先在冰上振荡反应15min,使细胞裂解。然后在室温反应2h,使捕获抗体捕获细胞裂解物。
步骤九：拆开夹具，在玻片上依次滴加生物素化的抗体(biotin-CD9)和荧光标记的链霉亲合素(streptividin-APC)进行单细胞裂解物检测。
步骤十：使用四色激光玻片扫描仪扫描玻片。
本实施例结果见图17，18。其中图17为部分实验结果图，清晰展示了细胞在芯片上的分布情况，以及每个孔相对应的细胞分泌物(EVs)的信号和细胞裂解后检测到的裂解物信号。图18为信号强度统计散点图，展示了随着细胞数目的变化，细胞分泌EVs的百分比，以及裂解蛋白的百分比。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种可实现细胞捕获与固定的芯片，包括微孔阵列芯片(2)，微孔阵列芯片(2)包括基底和基底上由若干微孔构成的微孔阵列，其特征在于，所述微孔包括微孔开口(3)和微孔孔腔(4)，所述微孔的微孔开口(3)的内径小于微孔孔腔(4)的内径。
2.根据权利要求1所述的一种可实现细胞捕获与固定的芯片，其特征在于，所述微孔开口(3)的形状为正多边形、矩形或圆形，微孔开口(3)内径为1μm～1cm，微孔开口(3)的高度为1μm～1mm；所述微孔孔腔(4)的形状为正多边形、矩形或圆形，微孔孔腔(4)内径为10μm～10cm，微孔孔腔(4)高度为1μm-1cm。
3.根据权利要求1所述的一种可实现细胞捕获与固定的芯片，其特征在于，所述微孔阵列芯片(2)的微孔数目为1～1000000个/cm2，相邻两个微孔中心之间的距离为21μm～21cm，所述微孔阵列芯片(2)厚度为0.5mm～5cm。
4.根据权利要求1所述的一种可实现细胞捕获与固定的芯片，其特征在于，所述微孔阵列芯片由弹性材料制成，所述弹性材料包括PDMS及做亲水处理后的PDMS、POE、EVA、EPDM等。
5.一种可实现细胞捕获与固定的芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过将PDMS预聚物以一定速度旋转到用光刻法制得的模具上来制造微孔开口；
(2)将PDMS预聚物倾倒在用光刻法制得的模具上加热固化，得到微孔孔腔；
(3)将微孔开口与微孔孔腔两者对齐，加热键合，得到完整芯片。
6.一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片，其特征在于，包括生物分析基底(1)和权利要求1～4任一项所述的芯片。
7.根据权利要求6所述的一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片，其特征在于，所述生物分析基底包括玻片、硅片、云母片、硝酸纤维素膜或包被了试剂的载玻片，所述生物分析基底上包被有蛋白阵列、抗体阵列、DNA阵列、蛋白、抗体或DNA中的一种或多种；所述试剂为多聚赖氨酸。
8.权利要求1所述的可实现细胞捕获与固定的芯片在多种细胞分析、多种细胞的单细胞分析、多种细胞的多重生物分子分析或多种细胞的单细胞多重生物分子分析中的应用；优选地，所述多种细胞包括哺乳动物细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多重生物分子分析包括分泌蛋白、细胞因子、多肽、肽段、核酸、细胞表面蛋白、细胞表面受体、激素、抗原、生长因子或外泌体的分析，所述多重分析包括1到100个指标的分析。
10.权利要求1所述的可实现细胞捕获与固定的芯片在细胞的多时间点动态检测中的应用，所述多时间点为0～24h，动态检测次数为0～100次。
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