CN106153891A - 三维生物标志物检测装置、制备方法及检测生物标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维生物标志物检测装置、制备方法及检测生物标志物的方法。三维生物标志物检测装置，包括：三维多孔支架芯片和载样板；其中，所述三维多孔支架芯片包括：基板以及多个三维多孔支架，所述多个三维多孔支架形成在所述基板的上表面；所述载样板包括：基底、多个亲水区域以及多个疏水区域，所述多个亲水区域形成在所述基底的上表面，所述多个疏水区域形成在所述基底的上表面，所述多个亲水区域与所述多个疏水区域间隔设置，并且所述多个亲水区域与所述多个三维多孔支架相对应。利用该三维生物标志物检测装置能够有效地检测生物标志物。

Description

三维生物标志物检测装置、制备方法及检测生物标志物的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种三维生物标志物检测装置、该三维生物标志物检测装置的制备方法及利用该三维生物标志物检测装置检测生物标志物的方法。

背景技术

传统的生物标记物检测法——96孔板的酶联免疫吸附实验，因其繁琐的实验步骤和大体积的样品量(50-100微升/孔)而难以实现方便、低成本、高通量、高信息量的检测。目前提高信息量的酶联免疫吸附实验是将多个捕获抗体分别定点固定在同一个96孔里，同一个样品加入一个孔里便能同时检测多种生物标志物，而结合上的酶标二抗催化底物原位产生发光产物，再通过捕捉图片分析其亮度而同时定量一个样品里多个标志物的含量。此方法并没有脱离原96孔板的酶联免疫吸附实验的操作手法和样品体积用量，因此也难以实现方便的高通量检测。而384孔及更高通量的酶联免疫吸附实验要求反应总体积小、加样体积准确，因而需要依靠昂贵的自动化设备，使大多数普通实验室望而却步，只能依赖人工操作进行96孔板的酶联免疫吸附实验。

如上所述，生物标记物检测的微小化是高通量检测的一个要求。最简单的微小化便是将96孔板的二维平面酶联免疫吸附实验的操作方法直接挪用至384孔板或更多孔的孔板。许多文献中也利用微流道达到纳升甚至皮升量级的反应体系，但是需要借助微流泵等复杂仪器，且无法实现高通量检测。另一种微小化便是将二维平面的微小酶联免疫吸附实验提升至三维反应空间。三维酶联免疫吸附实验相对二维的优点在于其能提供更多的位点固定捕获抗体以提高捕获效率，进而增强信号及灵敏度。常用的三维基底是聚乙二醇水凝胶，其含水量高，使捕获抗体能更好的保持活性。然而，由于物质扩散在水凝胶中比较慢，顾虑到检测时间，这些微小水凝胶的直径一般仅为几百微米，而高度仅不到10微米，使人工加样十分困难，需依赖自动化设备。而且，水凝胶需保持半湿的状态以防干瘪而影响抗体的活性。另外，由于水凝胶含水量高，样品滴加在水凝胶上会被稀释，不仅降低检测的灵敏度，亦可能造成检测结果的不可靠性。

因此，一种可供人工简便操作、便于储存、低成本、高通量或高信息含量的三维生物标志物检测装置有待开发。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种人工简便操作、便于储存、低成本或高通量的三维生物标志物检测装置。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种三维生物标志物检测装置，根据本发明的实施例，该三维生物标志物检测装置包括：三维多孔支架芯片，和载样板；其中，所述三维多孔支架芯片包括：基板，以及多个三维多孔支架，所述多个三维多孔支架形成在所述基板的上表面；所述载样板包括：基底，多个亲水区域，所述多个亲水区域形成在所述基底的上表面，以及多个疏水区域，所述多个疏水区域形成在所述基底的上表面；所述多个亲水区域与所述多个疏水区域间隔设置，并且所述多个亲水区域与所述多个三维多孔支架相对应。

根据本发明的实施例，利用该三维生物标志物检测装置能够有效地检测生物标志物。根据本发明的实施例，本发明提供的三维生物标志物检测装置不仅方便储存，还可以实现微小化的生物标志物检测。此外，具有的亲疏水区域的载样板可以实现人工的高通量加样，由此，操作人员可将5微升以上的液体直接滴加至与多个三维多孔支架对应的亲水区域，不仅减少了操作人员滴加样品的次数，更无需滴加1微升以下的样品，可以有效减少操作压力和操作导致的误差。

根据本发明的实施例，所述三维多孔支架是经过干燥处理的；任选地，所述三维多孔支架是经过冷冻干燥处理的；任选地，所述三维多孔支架携带有亲和分子，所述亲和分子特异性结合所述生物标志物。发明人发现，将三维多孔支架阵列芯片进行冷冻干燥后，形成干的三维多孔支架，孔径变大，不仅利于吸收液体便于检测，还方便储存。并且结合在支架上的亲和分子如捕获抗体/抗原亦可以通过冷冻干燥保持其活性，便于长期储存。

根据本发明的实施例，所述三维多孔支架被设置为阵列式排布。根据本发明的实施例，所述三维多孔支架呈圆柱状。根据本发明的实施例，所述三维多孔支架的底部直径为1-2mm，高300-350微米。由此，三维多孔支架吸水性更强，便于人工加样，实现高通量、微小化的生物标志物检测

根据本发明的实施例，所述基底的至少上表面是由亲水材料形成的。根据本发明的实施例所述多个亲水区域的至少一部分设置为阵列排布；或者，所述多个亲水区域的至少一部分被设置为条状。由此利于一种生物标志物的检测，并且人工加样方便快捷。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备上述三维生物标志物检测装置的方法，包括以下步骤：提供基板，并在所述基板的上表面形成多个三维多孔支架，以便获得三维多孔支架芯片；以及提供基底，并在所述基底的上表面形成多个亲水区域和多个疏水区域，以便获得载样板；其中，所述多个亲水区域与所述多个疏水区域间隔设置，并且所述多个亲水区域与所述多个三维多孔支架相对应。

通过本发明的方法制备的三维生物标志物检测装置不仅方便储存，还可以实现微小化的生物标志物检测；此外，具有的亲疏水区域的载样板可以实现人工的高通量加样，操作简便的同时可以有效减少误差。

根据本发明的实施例，所述三维多孔支架是在-12摄氏度至-20摄氏度下形成，或者在常温下形成所述三维多孔支架后，将所述三维多孔支架进行冷冻干燥。

根据本发明的实施例，在形成所述三维多孔支架时加入甘油。由此可以提高支架在冷冻干燥后的透光性，从而降低三维多孔支架的光学干扰，提高信号传输的质量。

根据本发明的实施例，在形成所述三维多孔支架后，在所述三维多孔支架上添加亲和分子，并对所述三维多孔支架进行封闭处理。由此利于捕获待检测的生物标志物样品，并对并对三维多孔支架进行封闭处理以对亲和分子进行保护。

根据本发明的实施例，所述基底的至少上表面是由亲水材料形成的，并且所述多个疏水区域的至少一部分是通过在所述基底的上表面施加疏水材料而形成，或者所述多个疏水区域的至少一部分是通过在所述基底的上表面形成纳米级的粗糙表面而形成。由此，利于含水样品在亲水区聚集，加样简便快捷。

根据本发明的实施例，所述疏水材料包括选自SU-8(环氧基紫外负型光刻胶)、如CHF₃、十八烷基三氯硅烷(OTS)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化铝/二氧化硅混合涂层和氧化钛的至少一种。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种利用上述三维生物标志物检测装置检测生物标志物的方法，包括：将含有生物标志物的含水样品加载至所述载样板；使所述载样板的亲水区域与所述三维多孔支架芯片的所述三维多孔支架接触；以及对所述三维多孔支架芯片进行检测；其中，所述三维多孔支架预先携带特异性识别所述生物标志物的亲和分子。

根据本发明的实施例，每个所述三维多孔支架吸收1～2微升的所述含水样品。由此，加样量增加，减少了操作人员滴加样品的次数，更无需操作人员滴加1微升以下的样品，从而减少操作的压力和操作导致的误差。

根据本发明的实施例，通过涂布或者点样的方式，将含有生物标志物的含水样品加载至所述载样板。通过这样的加样方式，无需自动加样仪也可以进行加样，尤其在采用人工加样时，还可以减少操作人员滴加样品的次数，方便快捷。

利用本申请的三维生物标志物检测装置可以实现微小化的生物标志物检测，而且经过冷冻干燥后的三维多孔支架孔径变大，能够吸收更多液体，由此，根据载样板对应的三维多孔支架的数量以及每个三维多孔支架的能够吸收液体的量，操作人员每次可将5微升以上的液体直接滴加至载样板上与多个三维多孔支架对应的亲水区域，不仅减少了操作人员滴加样品的次数，更无需滴加1微升以下的样品，有效提高了检测的准确度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的三维生物标志物检测装置的三维多孔支架芯片的结构示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的三维生物标志物检测装置的载样板的结构示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的利用本发明的三维生物标志物检测装置检测生物标志物时，三维多孔支架芯片与载样板结合状态的结构示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的利用本发明的三维生物标志物检测装置检测生物标志物时，三维多孔支架芯片与载样板结合状态的部分结构示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的三维生物标志物检测装置检测人白蛋白浓度的曲线图，其中图5A为人白蛋白标准曲线图，图5B为未知浓度的人白蛋白样品的检测准确性的直线图；

图6根据本发明一个实施例的三维生物标志物检测装置检测乙酰氨基酚对HepaRG人肝癌细胞分泌人白蛋白量的影响的检测曲线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种三维生物标志物检测装置，下面参考附图对该三维生物标志物检测装置进行详细描述。参考图1，根据本发明的实施例，三维生物标志物检测装置包括三维多孔支架芯片100和载样板200；其中，三维多孔支架芯片100包括基板110以及多个三维多孔支架120；载样板200包括基底210、多个亲水区域220以及多个疏水区域230；多个亲水区域220与多个疏水区域230间隔设置，并且多个亲水区域220与多个三维多孔支架120相对应，以方便三维多孔支架芯片100和载样板200的对接。

根据本发明的实施例，发明人发现本发明的三维生物标志物检测装置不仅方便储存，还可以实现微小化的生物标志物检测。此外，具有亲疏水区域的载样板可以实现人工的高通量加样，由此，操作人员可将5微升以上的液体直接滴加至与多个三维多孔支架对应的亲水区域，不仅减少了操作人员滴加样品的次数，更无需滴加1微升以下的样品，可以有效减少操作压力和操作导致的误差。

根据本发明的实施例，三维多孔支架120是经过干燥处理的，任选地，是可以经过冷冻干燥处理的。发明人发现，三维多孔支架120通过冷冻干燥后程海绵状，孔径变大，其吸水性能好，可以解决物质在水凝胶中扩散的问题，从而使三维多孔支架可以做到几百微米高度的尺寸，方便人工加样。而且三维多孔支架120经冷冻干燥处理后，样品滴加到支架上不会被稀释，从而提高了检测结果的可信度。此外，三维多孔支架120经冷冻干燥处理后，其机械性能提高，弹性变高，不易碎。

根据本发明的实施例，三维多孔支架120可以携带有亲和分子，亲和分子特异性结合生物标志物。根据本发明的实施例，亲和分子的种类并不受特别限制，可以是抗体/抗原(比如IgG、IgM等)，也可以是蛋白(比如酶)、糖蛋白(比如亲和素，生物素)、核酸序列(比如DNA序列、RNA序列、适配体)、短肽者多肽等。

根据本发明的实施例，三维多孔支架120的排布不受特别限制，可以根据仪器需求、检测需求等制作成各种排布形式。根据本发明的一些实施例，三维多孔支架120的排布被设置为阵列式排布，例如可以是如6×16阵列(即横排16排，纵排6列)。

根据本发明的实施例，三维多孔支架120的形状不受特别限制。根据本发明的一些实施例，三维多孔支架120可以呈圆柱状。根据本发明的另一些实施例，三维多孔支架120的底部直径可以为1-2mm，高度可以为300-350微米。由此，三维多孔支架吸水性更强，便于人工加样，实现高通量、微小化的生物标志物检测。

根据本发明的实施例，三维多孔支架中含有甘油。发明人发现，在制作三维多孔支架时，加入甘油可以提高支架在冷冻干燥后的透光性，从而降低三维多孔支架的光学干扰，提高信号传输的质量。

根据本发明的一些实施例，基底210的至少上表面是由亲水材料形成的，这里的亲水材料的种类不受特别限制，带有极性基团的分子、对水有大的亲和能力的材料即可，例如聚环氧乙烷(PEO)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)等。根据本发明的另一些实施例，基底210也可以是全部采用亲水材料形成的，例如可以采用玻璃(如硅化玻璃)、纸、石英、纤维膜、塑料、聚合物等形成基底210。

根据本发明的实施例，多个亲水区域220的排布不受特别限制，可以根据仪器需求、检测需求等设置。根据本发明的一些实施例，多个亲水区域220的排布的至少一部分可以设置为阵列排布，或者多个亲水区域220的至少一部分可以被设置为条状。发明人发现，当多个亲水区域220的排布的至少一部分可以设置为阵列排布时，利于一种生物标志物的检测，并且人工加样方便快捷；当多个亲水区域220的至少一部分可以被设置为条状时，利于多种生物标志物的检测，同样也可以实现人工加样的方便快捷。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备上述三维生物标志物检测装置的方法，包括以下步骤：

S100：制备三维多孔支架芯片

根据本发明的实施例，三维多孔支架可以通过在基板上形成多个三维多孔支架而完成。

根据本发明的实施例，形成基板的原料并不受特别限制，可以是玻璃、纸、石英、纤维膜、塑料、聚合物等。根据本发明的实施例，可以形成三维多孔支架的原料并不受特别限制，可以是聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、胶原蛋白、基质胶、明胶等聚合物材料。

根据本发明的实施例，三维多孔支架可以是制备好三维多孔支架后再结合到基板，或者在制备三维多孔支架的同时结合到基板。三维多孔支架与基板可通过化学或物理结合。根据本发明的实施例，如使用自带或修饰后带有双键、氨基等功能基团的硅化玻璃作为基板，便可以通过化学反应(例如紫外光交联)与聚乙二醇二丙烯酸酯、聚(N-异丙基丙烯酰胺)等原料形成的三维多孔支架进行结合。但如果使用不带或者未修饰功能基团的基板，也可以通过环氧树脂与三维多孔支架进行物理固化结合。

本发明中，术语“修饰”应作广义理解，可以指任何使得基板具有与多孔支架相结合的功能基团和/或化学键的方式或手段，例如可以是通过化学修饰的方式使得基板具有与多孔支架相结合的功能基团和/或化学键。

根据本发明的实施例，三维多孔支架是在-12摄氏度至-20摄氏度下形成，再进行干燥处理；或者在常温下形成三维多孔支架后，将三维多孔支架进行冷冻干燥。根据本发明的一些实施例，三维多孔支架可以通过对形成三维多孔支架的原料进行化学或光学催化，形成水凝胶后进行冷冻干燥；也可以在低温情况下，例如在-12摄氏度至-20摄氏度条件下，优选在-20摄氏度下通过化学或光学催化形成冰胶后再干燥。根据本发明的另一些实施例，三维多孔支架的多孔性质可以通过添加盐粒、甘油、冰晶等与胶体原液不相容的化学试剂或固体颗粒制作而成。

根据本发明的实施例，在形成三维多孔支架后，在三维多孔支架上添加亲和分子，并对三维多孔支架进行封闭处理。由此利于捕获待检测的生物标志物样品，并对三维多孔支架进行封闭处理以对亲和分子进行保护。

本发明中，术语“添加”应作广义理解，可以指任何使得三维多孔支架包含亲和分子的手段，例如，可以是通过将亲和分子通过化学键固定或结合于三维多孔支架上。

根据本发明的一些实施例，亲和分子可在制备水凝胶前加入，从而在形成水凝胶时便以固定亲和分子。根据本发明的另一些实施例，亲和分子也可以在水凝胶形成后加入。根据本发明的另一些实施例，亲和分子也可以在三维多孔支架进行冷冻干燥后再固定。根据本发明的实施例，每个三维多孔支架可以固定一个或多个亲和分子，每个三维多孔支架芯片也可以包含一种或多种固定了亲和分子的三维多孔支架。

根据本发明的实施例，亲和分子的种类并不受特别限制，可以是抗体/抗原(比如IgG、IgM等)，也可以是蛋白(比如酶)、糖蛋白(比如亲和素，生物素)、核酸序列(比如DNA序列、RNA序列、适配体)、短肽者多肽等。

根据本发明的实施例，抗非特异性吸附的物质的种类并不受特别限制，可以是牛血清白蛋白、乙醇胺、脱脂牛奶、巯基乙醇(MCH)、三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、11-巯基十一烷基-四(乙二醇)(OEG4)、1-巯基十一烷基-六(乙二醇)(OEG6)等寡聚乙二醇、以及聚乙二醇(PEG)及其衍生物等。

根据本发明的实施例，三维多孔支架在制备时可修饰各种基团(比如双键、羟基、醛基、翔基等)，以提供亲和分子固定所需的基团。

根据本发明的实施例，将修饰了亲和分子并封闭后的三维多孔支架阵列芯片低温冷冻并干燥。低温冷冻后干燥的条件可根据亲和分子的特性而加入必要的保护剂(比如蔗糖、海藻糖)和适合的缓冲液(比如pH 7的Tris缓冲液)。

根据本发明的实施例，冷冻干燥后的三维多孔支架芯片可置于低温或常温干燥的环境中保存。

S200：制备载样板

根据本发明的实施例，载样板可以通过在基底上形成多个亲水区域和多个疏水区域而完成。

根据本发明的实施例，多个亲水区域与多个疏水区域间隔设置，并且多个亲水区域与多个三维多孔支架相对应，由此便于三维多孔支架芯片和载样的对接。

根据本发明的一些实施例，基底的至少上表面是由亲水材料形成的，这里的亲水材料的种类不受特别限制，带有极性基团的分子、对水有大的亲和能力的材料即可，例如聚环氧乙烷(PEO)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)等。根据本发明的另一些实施例，基底210也可以是全部采用亲水材料形成的，例如可以采用玻璃(如硅化玻璃)、纸、石英、纤维膜、塑料、聚合物等形成基底210。

根据本发明的一些实施例，提供基底后，可以预先对基底进行亲水处理，例如使用氧等离子体清洁仪对基底进行清洗。

根据本发明的一些实施例，多个疏水区域的至少一部分是通过在基底的上表面施加疏水材料而形成。根据本发明的另一些实施例，多个疏水区域的至少一部分是通过在基底的上表面形成纳米级的粗糙表面而形成。由此，利于含水样品在亲水区聚集，加样简便快捷。

根据本发明的实施例，疏水材料包括选自SU-8(环氧基紫外负型光刻胶)、如CHF₃、十八烷基三氯硅烷(OTS)、聚二甲硅氧烷(PDMS)、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化铝/二氧化硅混合涂层和氧化钛的至少一种。根据本发明的一些实施例，形成多个亲水区域和多个疏水区域的方法可以采用影印石版术(photolithography)、微接触打印技术(microcontact printing)、微流体图案技术(microfluidic patterning)、层流图案技术(laminar flow patterning)、模版图案技术(stencil patterning)、压印光刻技术(imprintlithography)、流体光刻技术(flow lithography)、等离子体处理(plasma)、(contactelectrochemical replication)等。

通过本发明的方法制备的三维生物标志物检测装置不仅方便储存，还可以实现微小化的生物标志物检测；此外，具有的亲疏水区域的载样板可以实现人工的高通量加样，操作简便的同时可以有效减少误差。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种利用上述三维生物标志物检测装置检测生物标志物的方法。参考图3，根据本发明的实施例，该检测方法包括：

S100：将含有生物标志物的含水样品加载至载样板。

本发明中，术语“生物标志物”应作广义理解，可以指够反映致病因素或毒物从暴露到效应过程中，各个环节性质的任何的特异性生物分子,如DNA、蛋白质、酶、脂质、糖类等；也指在各种效应过程中反映某种外来物质引发的生物化学反应以及各种数据指标。

根据本发明的实施例，生物标志物可指处于缓冲液、细胞培养液中或血液、唾液、尿液等体液中。

根据本发明的实施例，通过涂布或者点样的方式，将含有生物标志物的含水样品加载至载样板。根据本发明的一些实施例，生物标志物可手动或通过自动加样仪，以一排或一列的方式涂布加载至载样板上。根据本发明的另一些实施例，生物标志物可手动或通过自动加样仪，以点样或涂布的方式加载至载样板上。通过这样的加样方式，无需自动加样仪也可以进行加样，尤其在采用人工加样时，还可以减少操作人员滴加样品的次数，方便快捷。

根据本发明的实施例，可以将相同或不同种类、相同或不同浓度的生物标志物样品加载至载样板上，如人白蛋白溶液、其他蛋白、空白对照等。

S200：使载样板的亲水区域与三维多孔支架芯片的三维多孔支架接触。

根据本发明的实施例，将生物标志物加载至载样板后，将三维多孔支架芯片与载样板相扣，进行孵育、反应。如图3和图4(图4是图3圆圈区域的放大示意图)所示，将三维多孔支架芯片与载样板相扣后，三维多孔支架与亲水区域接触，三维多孔支架吸收样品液体。

根据本发明的实施例，每个三维多孔支架可以吸收1～2微升的含水样品。由此，操作人员在加样时，根据载样板对应的三维多孔支架的数量以及每个三维多孔支架的能够吸收液体的量，每次可将5微升以上的液体滴加至载样板上的亲水区域，一个区域可同时供三维多孔支架芯片上一排或者一列的三维多孔支架使用，加样量增加，不仅减少了操作人员滴加样品的次数，更无需操作人员滴加1微升以下的样品，从而减少操作的压力和操作导致的误差。

S300：对三维多孔支架芯片进行检测；其中，三维多孔支架预先携带特异性识别生物标志物的亲和分子。

根据本发明的实施例，载样板的亲水区域与三维多孔支架芯片的三维多孔支架接触，使生物标志物与亲和因子反应后，将三维多孔支架芯片以缓冲液清洗数遍，于吸水纸上吸走多余水分，再与检测物质孵育、反应。检测物质的加样方式与生物标志物的加样方式相同。

根据本发明的实施例，检测物质为修饰了荧光基团、催化物(比如酶)或者贵金属纳米颗粒的抗体/抗原、细胞、微生物、病毒、抗体/抗原、蛋白、小分子、核酸序列(比如DNA序列、RNA序列)、短肽或多肽等。

根据本发明的实施例，检测可以是直接放入酶标仪等具有阵列吸收谱/散射谱/消光谱/反射谱测试功能的仪器里检测荧光、化学发光或者吸收光的强弱，也可以通过扫描或拍摄将三维多孔支架芯片上的每个三维多孔支架的灰度、亮度、颜色深浅、荧光强弱、化学发光的强弱等以图片形式输出信号。

根据本发明的实施例，本发明提供的三维生物标志物检测装置可以用于多种信号方式的检测，例如可以检测荧光标记二抗的荧光强度，由此根据荧光强度制作曲线；或者检测辣根酶标记二抗催化四甲基联苯胺等底物的光吸收强度，由此根据吸收强度制作曲线；或者检测辣根酶催化的二氨基联苯胺等底物的显色灰度，由此根据显色灰度制作灰度定量曲线。

现有技术中，三维多孔支架芯片的保存和使用均需在含水环境中，由此在检测生物标志物时会造成物质的稀释和扩散，并且吸水性能差，检测量低。同时，由于形成三维多孔支架为聚合物材料，其冷冻干燥后会变得不透明，干扰检测信号，所以很难想到将三维多孔支架芯片进行冷冻干燥处理。而本发明人经过反复研究发现，根据本发明的方法制备的三维生物标志物检测装置不仅可以解决物质的扩散和稀释问题，以提高检测结果的可信度；同时由于三维多孔支架可以做到几百微米高度的尺寸，方便人工加样。此外，虽然经过冷冻干燥处理，却不会造成三维多孔支架的光学干扰，提高了信号传输的质量。

下面通过具体的实施例对本发明进行解释和说明，本领域技术人员能够理解的是，下面的实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明的范围。并且在下面的实施例中，除非特别说明，所采用的试剂、材料均为市售可得的。

实施例1

1、三维多孔支架芯片的制备过程如下：

(1)三维多孔支架芯片的制备

1g聚乙二醇二丙烯酸酯4000、0.1g光引发剂IG2959、0.006g N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺溶于6mL甘油和4mL水中，配成预混液。以两片盖玻片(总350微米厚)夹在一片修饰了十八烷基三氯硅烷(OTS)的75mm×25mm×1mm的载玻片和修饰了弘甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(TMSPMA)同等大小的载玻片中，用移液器将两片载玻片之间的缝隙灌满预混液。将6列×16排阵列，孔径为1.4mm的光掩膜(即除了6列，16排共96个1.4mm直径的透明区域外，其他皆为黑色不透光的75mm×25mm塑料膜)盖于载玻片上，通过紫外光将预混液交联形成直径1.4mm、高350微米的圆柱体水凝胶。将OTS修饰的载玻片和盖玻片撤走后，用水漂洗结合在TMSPMA载玻片上的水凝胶并将其置于-20℃冷冻。待水凝胶冻实便可置于冷冻干燥机(FD－1A-50，北京博医康实验仪器有限公司)里干燥成多孔支架。

(2)三维多孔支架芯片的捕获抗体修饰及封闭

将捕获抗体(如人白蛋白的捕获抗体)滴加至三维多孔支架芯片上，4℃反应过夜后，加入牛血清白蛋白(BSA)封闭液在室温下封闭4个小时。用5M Tris(pH 7)缓冲液冲洗十分钟三次后，将三维多孔支架芯片浸没于25％(质量体积比)的蔗糖溶液中置于-20℃冷冻，冻实后干燥。储存于-20℃真空的环境储存。

2、载样板的制备过程如下：

(1)亲疏水间隔模具

本实施例制备的亲疏水间隔PDMS模具可用于75mm×25mm的载玻片，使其形成16道2毫米宽、25毫米长的亲水通道，其余面积为疏水表面。将16条高2毫米、宽2.5毫米、长30毫米的PMMA塑料条以2毫米的间隔粘于一块75毫米×30毫米的1毫米厚的PMMA板，再将其置于10厘米直径的培养皿内制做成亲疏水间隔模具的倒模。取出184 Silicone Elastomer Kit有机硅弹性体中的聚硅氧烷弹性体(Silicone Elastomer)和固化剂(Curing agent)以10∶1的比例配制共22克的液态胶体，充分调匀。使用抽真空泵(SHZD(III)，巩义市予华仪器有限公司)把配制好的液态胶体抽直至无气泡存在。将无气体的液态胶体缓缓倒入粘有PMMA条的培养皿中，胶体需灌入PMMA条之间的2毫米间隔，并整体胶体高度高于PMMA条，即4毫米左右。把灌满PDMS的培养皿置于70摄氏度加热4小时，使液态胶体充分交联形成固体PDMS模具。PDMS凝固后，用刀片沿着底部75mm×30mm大小的PMMA板割开，慢慢把PDMS从倒模具出揭下来，形成75毫米×30毫米并有17条2毫米高、2毫米宽、30毫米长的突出的PDMS模具。用透明胶把PDMS模具上突出的横条上的灰尘粘干净。

(2)采用微接触印刷术制作载样板

这里采用载玻片作为基底，载玻片的大小为75mm×25mm×1mm。将载玻片进行氧等离子体(plasma)亲水处理。使用氧等离子体清洁仪(Harrick Plasma，PDC-32G)，RF为最高档位。预先用真空泵抽气1分钟后，plasma处理1分钟。在事先制备好的PDMS模具上的突起横条上均匀涂上10μL/条的1％十八烷基三氯硅烷(OTS)(溶于正己烷)，晾干10秒。把涂好OTS的PDMS模具扣在plasma处理好的载玻片上，轻按20秒。晾干3分钟。16通道(6列16排)的载样板便制作完成。

由此获得本发明的三维生物标志物检测装置。

实施例2

除形成三维多孔支架的原料选用聚乙二醇、光引发剂、甘油、水，形成疏水材料选用OTS以外，按照与实施例1相同的方式制备三维生物标志物检测装置。

实施例3

除形成三维多孔支架的原料选用聚(N-异丙基丙烯酰胺)、光引发剂、甘油、水，形成疏水材料选用PDMS以外，按照与实施例1相同的方式制备三维生物标志物检测装置。

实施例4

申请人最好再提供制备其他阵列排布的三维生物标志物检测装置的实施例，制备纳米级粗糙表面疏水区载样板的实施例，以及低温条件下制备三维多孔支架再进行干燥的实施例。

测试实施例1

应用实施例1制备的三维生物标志物检测装置检测样品中人白蛋白的浓度。

(1)人白蛋白标准曲线

从-20℃真空环境中取出修饰了人白蛋白的捕获抗体的三维多孔支架芯片，待回温至室温后，从真空包装中取出芯片。分别将6微升、不同浓度(浓度梯度为0、1、10、20、50、100、200、1000、2000、10000、100000ng/mL)的人白蛋白溶液涂抹于载样板中与三维多孔支架对应的多个亲水区域通道。将芯片的每一排支架对准载样板上相对应的载样通道相扣上，在防蒸发的环境中，室温孵育一个小时。用酶联免疫实验的Tris缓冲液(50mM,pH8.0)冲洗3次，于一张吸水纸上吸干多余水分。以同样的方式在新的载样板上涂抹辣根酶标记的抗人白蛋白抗体，将吸干水分的芯片与之相扣，如孵育样品一样孵育一个小时后再度冲洗3次。

将芯片朝下(即支架朝下)架于酶标仪检测适配器(SpectraMax M5/M5e，MolecularDevices)上放入酶标仪读取450nm的吸收值，此为背景值。将芯片吸干多余水分后，与涂抹了辣根酶底物液的新载样板扣上反应15分钟后，立即扣在涂抹了0.18M硫酸终止液的载样板上，吸附在支架上的液体变成黄色。同样将芯片朝下架于酶标仪检测适配器上放入酶标仪读取450nm的吸收值，此为信号值。

根据读取数值，绘出人白蛋白的标准曲线(参见图5A)。

(2)检验人白蛋白样品浓度的准确性

为测试芯片检测的准确性，将6微升实际浓度为25、50、250、500、750ng/mL的人白蛋白溶液分别涂抹于实施例1制备的载样板中与三维多孔支架对应的多个亲水区域通道。从-20℃真空环境中取出修饰了人白蛋白的捕获抗体的三维多孔支架芯片，待回温至室温后，从真空包装中取出芯片，与涂布了白蛋白溶液的载样板相扣。其余按照与人白蛋白标准曲线的制备的相同步骤，读取信号值。将信号值减去背景值即可得到绝对吸收值，套入图5A中的人白蛋白标准曲线换算出样品浓度。参见图5B，以实际浓度为横轴，换算的样品浓度为纵轴，如换算浓度完全相等于实际浓度(完全落在虚线上)既认为检测100％准确。

(3)未知浓度的人白蛋白样品检测

从-20℃真空环境中取出修饰了人白蛋白的捕获抗体的三维多孔支架芯片，待回温至室温后，从真空包装中取出芯片。将6微升未知浓度的人白蛋白溶液涂抹于实施例1制备的载样板的其中一个通道。其余按照与人白蛋白标准曲线的制备的相同步骤，读取信号值。将信号值减去背景值即可得到绝对吸收值，套入图5A中的人白蛋白标准曲线即可换算样品浓度。

测试实施例2

应用实施例1制备的三维生物标志物检测装置对乙酰氨基酚对HepaRG人肝癌细胞分泌人白蛋白量的影响进行检测。

以3000个细胞/孔的密度将HepaRG种植在三维的细胞培养芯片上(参考X.Li,X.Zhang,S.Zhao,J.Wang,G.Liu and Y.Du,Lab on a Chip,2014,14,471-481)，用添加了10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM GlutaMAX、0.5μM氢化可的松半琥酯和4μg/mL胰岛素的William’s E培养基在37℃、5％CO₂培养箱中培养。5天后，将三维细胞培养芯片上培养的细胞划分为6组，分别加入20、10、5、2.5、1.25mM乙酰氨基酚和0.1％二甲基亚砜处理24小时。从-20℃真空环境中取出修饰了人白蛋白的捕获抗体的三维多孔支架芯片，待回温至室温后，从真空包装中取出芯片，将芯片与三维细胞培养芯片相扣，使三维多孔支架芯片和三维细胞培养芯片上细胞分泌的白蛋白进行反应。其余按照与人白蛋白标准曲线的制备的相同步骤，读取信号值。将信号值减去背景值即可得到绝对吸收值，套入图5A中的人白蛋白标准曲线即可换算样品浓度。将不同浓度的乙酰氨基酚处理的细胞所分泌的白蛋白量除以0.1％二甲基亚砜处理的细胞所分泌的白蛋白量以得到相对白蛋白表达量，参见图6。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种三维生物标志物检测装置，其特征在于，包括：

三维多孔支架芯片，和

载样板；

其中，

所述三维多孔支架芯片包括：

基板，以及

多个三维多孔支架，所述多个三维多孔支架形成在所述基板的上表面；

所述载样板包括：

基底，

多个亲水区域，所述多个亲水区域形成在所述基底的上表面，以及

多个疏水区域，所述多个疏水区域形成在所述基底的上表面；

所述多个亲水区域与所述多个疏水区域间隔设置，并且所述多个亲水区域与所述多个三维多孔支架相对应。

2.根据权利要求1所述的三维生物标志物检测装置，其特征在于，所述三维多孔支架是经过干燥处理的，

任选地，所述三维多孔支架是经过冷冻干燥处理的，

任选地，所述三维多孔支架携带有亲和分子，所述亲和分子特异性结合所述生物标志物。

3.根据权利要求1所述的三维生物标志物检测装置，其特征在于，所述三维多孔支架被设置为阵列式排布，

任选地，所述三维多孔支架呈圆柱状，

任选地，所述三维多孔支架的底部直径为1-2mm，高300-350微米。

4.根据权利要求1所述的三维生物标志物检测装置，其特征在于，所述基底的至少上表面是由亲水材料形成的，

任选地，所述多个亲水区域的至少一部分设置为阵列排布，或者

任选地，所述多个亲水区域的至少一部分被设置为条状。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述的三维生物标志物检测装置的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供基板，并在所述基板的上表面形成多个三维多孔支架，以便获得三维多孔支架芯片；以及

提供基底，并在所述基底的上表面形成多个亲水区域和多个疏水区域，以便获得载样板；

其中，

所述多个亲水区域与所述多个疏水区域间隔设置，并且所述多个亲水区域与所述多个三维多孔支架相对应。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述三维多孔支架是在-12摄氏度至-20摄氏度下形成，

或者在常温下形成所述三维多孔支架后，将所述三维多孔支架进行冷冻干燥，

任选地，在形成所述三维多孔支架后，在所述三维多孔支架上添加亲和分子，并对所述三维多孔支架进行封闭处理。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在形成所述三维多孔支架时加入甘油。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基底的至少上表面是由亲水材料形成的，并且

所述多个疏水区域的至少一部分是通过在所述基底的上表面施加疏水材料而形成，或者所述多个疏水区域的至少一部分是通过在所述基底的上表面形成纳米级的粗糙表面而形成，

任选地，所述疏水材料包括选自SU-8、CHF3、OTS、PDMS、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化铝/二氧化硅混合涂层和氧化钛中的至少一种。

9.一种利用权利要求1～4任一项所述的三维生物标志物检测装置检测生物标志物的方法，其特征在于，包括：

将含有生物标志物的含水样品加载至所述载样板；

使所述载样板的亲水区域与所述三维多孔支架芯片的所述三维多孔支架接触；以及

对所述三维多孔支架芯片进行检测；

其中，所述三维多孔支架预先携带特异性识别所述生物标志物的亲和分子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，每个所述三维多孔支架吸收1～2微升的所述含水样品，

任选地，通过涂布或者点样的方式，将含有生物标志物的含水样品加载至所述载样板。