CN116990497A - 一种高通量高内涵的药物筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高通量，高内涵的药物筛选方法，首先，我们描述了一种灵活高效的超疏水微坑阵列芯片的制备方法。所述药物筛选方法通过将所述微坑阵列芯片与膨胀显微技术结合，实现了高通量，高内涵的药物筛选。与现有技术相比，本发明在同步提高通量和分辨率的同时，还大大降低了时间和材料成本。此外，该方法不需要昂贵的仪器设备和和具有丰富专业技术知识的操作员，在普通生物实验室即可实施和完成。其高效性可大大促进药物的早期筛选，减少新发疾病造成的经济和健康损失。

Description

一种高通量高内涵的药物筛选方法
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，具体是一种高通量高内涵的药物筛选方法。
背景技术
发现和筛选有效的候选药物一直是科学界和制药界的最终目标。然而，对于一种候选药物，在进入临床试验前，就需要通过大量的细胞实验确定其剂量-反应关系、毒性、副作用和药理作用等，这是一个昂贵、耗时和费力的过程。此外，当一些新兴疾病迅速传播和发展时，我们需要尽可能迅速地筛选大量候选药物，并且得到尽可能多的药物用作信息，以将经济和健康损失降到最低。因此，时间成本、通量和内涵丰富度是优化筛药方法的主要考虑因素。
传统的药物筛选多是在多孔板中完成的，这种方法不仅通量低，对试剂的消耗量还很大。面对庞大的潜在药物体系，需要付出的研究成本非常高。微坑阵列通过注塑成型、软光刻等工艺将大量微小的细胞培养单元集成在一张芯片上，其小型化和高集成度的特点不仅大大提高了检测通量，还减少了试剂消耗。因此，这种制备成本低、检测通量高的微坑阵列芯片已经广泛地应用于药物筛选研究中。
使用微坑阵列芯片进行高通量的药物筛选时必须保证微坑之间不能发生交叉污染。目前，能较好的满足上述要求的是申请号为201610232372.6的文献公开了一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用，其提供了两种超疏水微坑阵列芯片的制备方法。第一种是基于PDMS制备的，该方法将PDMS预聚物注入到硅模具中，固化后翻模得到PDMS微坑芯片。通过在微坑表面附着一层3140康宁胶将事先固化在玻片表面的疏水层转移到PDMS微坑表面，形成超疏水微坑阵列芯片。另一种是基于玻璃基底制备的，该方法通过将微柱模具和硅烷化的玻片对齐后夹紧，向形成的空隙内注入超疏水预聚物后经固化形成微坑阵列芯片。
以上两种方法制备得到的超疏水微坑芯片都能避免微坑之间的交叉污染，满足高通量筛选的要求。但是加工过程比较繁琐耗时，而且加工过程中的人为因素很大程度上会影响制备的成功率。例如，制备基于PDMS的芯片时，微坑表面的3140胶必须薄而均匀且完整，胶太厚会造成堵孔现象，不均匀不完整的胶会导致转移到芯片上的疏水层不完整，即使附着在微坑表面的胶是薄而均匀且完整的，在转移时要需保证玻片上的疏水层和芯片接触时整个芯片受力均匀，否则转移到芯片的疏水层也是不完整的。而对于另外一种基于玻璃的芯片，在制备时要保证模具的微柱和玻片完全接触，若留有缝隙，在毛细力作用下超疏水预聚物就会进入缝隙，导致微坑底部也形成疏水层，影响后续细胞培养，在组装时还不能夹得太紧以免模具变形或玻片破裂。
除了提高药物筛选的通量，提高内涵丰富度也是优化筛药方法的一个重要方面。高内涵筛选以自动化显微镜和图像分析平台为依托，通过超分辨成像和可视化分析深入研究药物的药理作用和剂量关系。传统的超分辨技术往往需要复杂而精密的仪器设备以及经验丰富的技术员进行操作，而且往往需要特定的荧光探针。此外，与普通的荧光显微镜相比，超分辨显微成像系统每单位面积需要分辨更多的像素，由此产生的巨大时间成本使我们在将超分辨技术应用于高通量药物筛选的路上望而却步。
膨胀显微成像技术通过在组织或细胞内形成可膨胀的水凝胶网络可实现对细胞内精细结构的物理放大。将细胞中的生物分子和荧光探针共价地锚定到聚合物网络上，待水凝胶在适当浓度的溶液中膨胀后，原本由于其距离小于光学衍射极限而无法分辨的生物分子由于水凝胶的膨胀而拉大了距离，便可以分辨出来，从而仅使用普通荧光显微镜就可实现超分辨率成像。这一过程大大缩短了成像时间，同时保持了高分辨率。膨胀显微成像技术不需要复杂的仪器设备，且使用普通的荧光探针就可成像。此外，即使对于专业知识储备不多的技术人员也比较容易上手，在普通生物实验室就可完成。
目前，现有的药物筛选方法往往只能单一地满足高通量或者高内涵的要求。例如，在给定时间内进行药物筛选时，超分辨成像保证了高内涵药物筛选，但其时间成本高，极大地限制了我们能够检测药物的通量。例如单分子定位显微镜的分辨率可以达到20～50nm。但在图像采集过程中会产生大量数据，并且采集时间也很长，Anne Beghin等人提出了一种基于单分子的自动化定量超分辨率技术，该方法在标准多孔板中操作，结合数据挖掘软件可以很大程度上节省时间。尽管如此，在96孔板中完成图像采集仍然需要8小时。另一方面，若想进行高通量的药物筛选，则只能降低成像分辨率，使用普通荧光显微镜成像降低时间成本，但是由于分辨率降低导致很多亚细胞结构无法被清楚的分辨，我们仅能通过观察细胞的死活来对药物的作用进行评估和研究，这限制了我们对药物药理作用的进一步研究。因此，就目前的筛药方法来看，高通量和高内涵似乎是不能兼容的，这极大地限制了药物筛选的效率，延缓了药物研发的整体进程。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明解决所述技术问题的技术方案是，提供一种高通量、高内涵的药物筛选方法(简称方法)，首先提供一种灵活高效的超疏水微坑阵列芯片的制备方法。所述药物筛选方法通过将所述超疏水微坑阵列芯片与膨胀显微技术结合，实现了高通量，高内涵的药物筛选。与现有技术相比，本发明在同步提高通量和分辨率的同时，还大大降低了时间和材料成本。此外，该方法不需要昂贵的仪器设备和和具有丰富专业技术知识的操作员，在普通生物实验室即可实施和完成。其高效性可大大促进药物的早期筛选，减少新发疾病造成的经济和健康损失。
所述高通量、高内涵的药物筛选方法包括以下步骤：
步骤1、制备超疏水微坑阵列芯片、多孔状微柱阵列芯片以及图案化树脂芯片；
其中所述超疏水微坑阵列芯片的微坑底部为硅烷化的玻璃，除微坑底部以外的表面均为超疏水层；所述多孔状微柱阵列芯片基底为硅烷化的玻璃，其上为多孔状的微柱阵列；所述图案化树脂芯片的基底为硅烷化的玻璃，其上为图案化的树脂凸起结构。
优选地，步骤1中，超疏水微坑阵列芯片制备方法包括以下步骤：
A1、将两个硅烷化的玻片两侧对齐粘接后，在缝隙中注入光敏树脂；然后利用图案化的光掩模对上述光敏树脂进行光固化，固化完成后清洗掉未固化的光敏树脂，在两个玻片中间形成树脂微柱阵列；
优选地，步骤A1中的光敏树脂的配方不受限，可以是任何含有“-C＝C-”的可光固化的光敏树脂。例如，光敏树脂中的单体可以是二缩三丙二醇二丙烯酸酯单体(TPGDA)、聚氨酯丙烯酸酯(PUA)以及二丙二醇二丙烯酸酯单体(DPGDA)等；光敏树脂中的光引发剂可以是任何可引起单体发生光聚合反应的光引发剂，例如可以是二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(TPO)以及过氧化苯甲酰(BPO)等。优选地，光敏树脂可以通过在TPGDA中加入TPO，然后摇匀，使TPO完全溶解后得到。(TPO用量为3～5％w/v(相对于TPGDA))。优选地，TPO的用量为4％w/v(相对于TPGDA)。
优选地，步骤A1中，清洗掉未固化的光敏树脂的试剂采用无水乙醇或丙酮。
A2、将固化后具有超疏水性的含有“-C＝C-”的超疏水预聚物注入到两玻片和树脂微柱阵列产生的空隙中，再利用紫外光对超疏水预聚物进行固化(此时，紫外光的辐照方向与固化光敏树脂时的辐照方向相反)，固化完成后在两玻片和树脂微柱的缝隙中形成超疏水层；
优选地，A2中，超疏水预聚物的配方不受限。可选地，超疏水预聚物包含甲基丙烯酸丁酯(BMA，20～30％v/v)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，10～20％v/v)、1-癸醇(45～60％v/v)、光引发剂苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(I819，1～3％w/v)。
进一步优选地，A2中，超疏水预聚物中各成分的含量为23％v/v BMA、15％v/vEDMA、60％v/v 1-癸醇、2％w/v I819。
A3、由于固化树光敏树脂和超疏水预聚物时紫外光辐照的方向相反，树脂微柱阵列和超疏水层优先固化在不同的玻片上；将两个玻片从粘接处撬开，两玻片分离后，在一侧的玻片上得到完整的超疏水微坑阵列层，在另一侧玻片上得到树脂微柱阵列。覆盖有超疏水微坑阵列层的玻片即所述超疏水微坑阵列芯片，具有树脂微柱阵列的玻片可直接丢弃。再将超疏水微坑阵列芯片在无水乙醇或丙酮中清洗3次，烘干后备用。
优选地，步骤1中，多孔状微柱阵列芯片的制备方法包括以下步骤：
B1、将一片硅烷化的玻片和一片粘有不粘膜的玻片两侧对齐粘接，然后在缝隙中注入经光固化可形成多孔状聚合物的预聚物，再利用图案化的光掩模对上述预聚物进行光固化；
优选地，B1中，用于制备多孔状聚合物的预聚物的配方不受限，其中聚合单体可以是聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，5～30％w/v)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA，5～30％w/v)、甲基丙烯酸酐化透明质酸(HAMA，5～10％w/v)等经光固化可形成多孔状聚合物的聚合单体；光引发剂可以是苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂(LAP，0.2～0.6％w/v)、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959，0.2～0.6％w/v)等可以引发光聚合反应的光引发剂。优选地，向超纯水中加入15％w/v PEGDA和0.5％w/v LAP，混匀后得到用于制备多孔状聚合物的预聚物。
B2、将两个玻片从粘接处撬开，两玻片分离后，在烷基化的玻片上得到完整的PEGDA微柱阵列，然后用超纯水清洗掉未固化的预聚物后冻干。
优选地，步骤1中，图案化树脂芯片的制备方法包括以下步骤：
C1、将一片硅烷化的玻片和一片粘有不粘膜的玻片两侧对齐粘接，然后在缝隙中注入光敏树脂；然后利用图案化的光掩模对上述光敏树脂进行光固化。
优选地，步骤C1中的光敏树脂的配方不受限，可以是任何含有“-C＝C-”的可光固化的光敏树脂。例如，光敏树脂中的单体可以是二缩三丙二醇二丙烯酸酯单体(TPGDA)、聚氨酯丙烯酸酯(PUA)以及二丙二醇二丙烯酸酯单体(DPGDA)等；光敏树脂中的光引发剂可以是任何可引起单体发生光聚合反应的光引发剂，例如可以是二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(TPO)以及过氧化苯甲酰(BPO)等。优选地，光敏树脂可以通过在TPGDA中加入TPO，然后摇匀，使TPO完全溶解后得到。(TPO用量为3～5％w/v(相对于TPGDA))。优选地，TPO的用量为4％w/v(相对于TPGDA)。
C2、将两个玻片从粘接处撬开，在烷基化的玻片上得到图案化的树脂结构，然后清洗掉未固化的光敏树脂。
优选地，步骤C2中，清洗掉未固化的光敏树脂的试剂采用无水乙醇或丙酮。
优选地，步骤1中，所述硅烷化的玻片的粘接方式不受限制。可选地，用双面胶将其两侧短边对齐粘接，最终得到的微坑深度取决于双面胶的厚度。
优选地，步骤1中，图案化的光掩模的形成方式和图案形状均不受限。可选地，可以是圆斑形阵列光，可经数字微镜阵列(DMD)反射产生。
优选地，步骤1中，所述微坑阵列芯片的微坑直径为300～2000μm，微坑深度小于500μm和微坑间距大于1000μm；
步骤2、对超疏水微坑阵列芯片中微坑底部进行去双健化处理。步骤1制备得到的超疏水微坑阵列芯片中微坑底部为硅烷化的玻璃，其表面有“-C＝C-”官能团，在后续与膨胀显微镜结合时会参与水凝胶交联而使水凝胶无法与微坑底部分离，因此需要对超疏水微坑阵列芯片中微坑底部进行去双健化处理。
优选地，步骤2中去双键化处理的方式不受限，可选地，通过用高锰酸钾溶液(0.1～10mg/mL)处理微坑底部进行去双键化处理。包括以下步骤：
D1、将固体高锰酸钾溶于水，摇匀，配制高锰酸钾溶液(0.1～10mg/mL)。
优选地，D1中，高锰酸钾溶液的浓度为1mg/mL。
D2、将高锰酸钾溶液加入到微坑中。
优选地，D2中，在微坑中加入高锰酸钾溶液的方式不受限。可选地，使用微量移液枪直接将高锰酸钾溶液加入微坑中；或者将高锰酸钾溶液从超疏水微坑阵列芯片上方(高于5厘米)滴加到超疏水微坑阵列芯片上，直至高锰酸钾溶液覆盖所有微坑。然后去除微坑外超疏水表面多余的高锰酸钾溶液(由于微坑表面的超疏水性，多余的高锰酸钾溶液可以轻易的用吸管吸走)。此时在超疏水微坑阵列芯片中形成高锰酸钾微液滴阵列。
D3、高猛酸钾溶液处理微坑底部20～40分钟后，去除微坑中的高锰酸钾溶液。
优选地，D3中，使用干燥纸巾吸去微坑中的高锰酸钾溶液，或者直接用超纯水冲洗掉微坑中的高锰酸钾溶液后晾干。
步骤3、将细胞接种到超疏水微坑阵列芯片上的每个微坑中进行细胞培养，具体步骤如下：
E1、将细胞接种到超疏水微坑阵列芯片的每个微坑中。
优选地，E1中，所述超疏水微坑阵列芯片中的细胞接种方式是：通过将整个芯片浸没在细胞悬液中10分钟，待细胞自然沉降到微坑底部后，用移液枪吸去多余的细胞悬液，也可通过用微量移液枪将细胞悬液直接加入到微坑中。
E2、将细胞接种到微坑中后，将上述接种有细胞的超疏水微坑阵列芯片放入一个小培养皿中，再一起放入一个较大培养皿中，然后向大培养皿中加入无菌水，以减少微坑中培养基的蒸发。最后将整个装置放入细胞培养箱。
E3、根据细胞的生长情况定期更换培养基(每6～12小时更换一次)。
优选地，E3中，通过将整个芯片浸没在新鲜培养基中，静置2～10分钟，然后移去多余的培养基，最后放回细胞培养箱。
步骤4、当细胞增殖到微坑底部面积的80％时，使用不同浓度的待筛选药物对细胞进行药物处理；
优选地，步骤4中，对微坑中的细胞进行药物处理的步骤如下：
F1、将不同的药物均匀涂抹到图案化树脂芯片的各个树脂图案区域，在图案化树脂结构表面得到液体药物层。
F2、使多孔状微柱阵列芯片中的微柱与液体药物层相接触，实现多孔状微柱阵列中药物的自动加载。
F3、将装载有不用药物的多孔状微柱阵列芯片的微柱插入到接种有细胞的超疏水微坑阵列芯片的微坑中，形成微柱-微坑镶嵌结构。此时多孔状微柱中的药物扩散进微坑中，实现药物的并行释放。
步骤5、药物处理完成后，应用膨胀显微技术对细胞进行染色和成像观察。
优选地，步骤5中，应用膨胀显微技术时进行染色和观察时，步骤如下：
G1、固定细胞。
优选地，G1中，固定细胞的流程因染色结构而异，均可通过常规的细胞固定流程实现。如，对细胞微管染色时，依次用0.2％v/v的Triton X-100、3％v/v多聚甲醛和0.1％v/v戊二醛、0.1％w/v的NaBH4、0.5％v/v的Triton X-100进行穿透和固定细胞。(上述试剂均用磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释)
G2、封闭细胞。
优选地，用1％w/v的牛血清白蛋白(BSA，稀释在PBS中)封闭。
G3、孵育一抗。
优选地，G3中，使用微量移液枪将一抗加入超疏水微坑阵列芯片的每个微坑中，孵育过夜。
G4、锚定试剂处理细胞，锚定剂首先与细胞内的蛋白或抗体结合，并且锚定剂带有“-C＝C2-”官能团，在后续水凝胶聚合时可参与交联，将细胞内的蛋白或抗体锚定到水凝胶网络中。
优选地，G4中，锚定剂的选择不受限，只需要能与蛋白或抗体结合，并带有“-C＝C-”官能团，可参与水凝胶交联即可。例如，6-((丙烯酰)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(AcX)或甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MA-NHS)等。
优选地，使用0.1mg/mL Aex溶液(稀释在PBS中)处理细胞1～4小时。
优选地，将整个超疏水微坑阵列芯片浸泡在0.1mg/mL Acx溶液(稀释在PBS中)中，反应2小时。
G5、添加水凝胶预聚物，发生化学交联。
优选地，G5中，水凝胶预聚物的配方不受限制。可选地，所述水凝胶预聚物包含单体、引发剂和催化剂。所述单体由2M氯化钠(NaCl)、8.6％～25％w/w丙烯酸钠、2.5％～4％w/w丙烯酰胺、0.04％～0.15％w/w N，N’-亚甲基双丙烯酰胺溶解在PBS中配制而成。向单体溶液中加入0.1～0.2％w/w过硫酸铵(APS，引发剂)和0.1～0.2％w/w N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMDE，催化剂)引发交联反应。
优选地，上述水凝胶预聚物中包含2M NaCl、8.625％w/w丙烯酸钠、2.5％w/w丙烯酰胺、0.15％w/w N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、0.2％w/w APS和0.2％w/w TEMED，溶解在PBS中。
优选地，将上述水凝胶预聚物滴加到所述超疏水微坑阵列芯片上，然后用尺寸匹配的盖玻片轻轻压平后静置于37℃恒温箱使水凝胶预聚物交联成水凝胶。水凝胶交联时间为2～4小时。
优选地，使水凝胶预聚物在37℃恒温箱交联3小时。
G6、水凝胶交联完成后，使用蛋白酶K均质化。
优选地，G6中，蛋白酶K的浓度为5～9units/mL，稀释在消化缓冲液中(50mM Tris-HCl，1M NaCl，0.5％v/v Triton X-100，0.8M盐酸胍，用超纯水稀释)。
优选地，G6中，蛋白酶K的浓度为8units/mL。
优选地，G6中，将上述表面覆盖水凝胶的超疏水微坑芯片直接浸泡在蛋白酶K溶液中，微坑内水凝胶的膨胀导致微坑侧壁对水凝胶产生挤压，导致水凝胶内部产生应力，促使水凝胶自动与所述超疏水微坑阵列分离，然后将水凝胶转移到干净容器中。
G7、带有荧光标记的二抗染色。选择与上述G3中一抗相匹配的，带有荧光标记的二抗进行染色。
优选地，G7中，将G6中的水凝胶浸泡在带有荧光标记的二抗(0.5～2％v/v，稀释在PBS中)中进行染色。
优选地，G7中，带有荧光标记的二抗浓度为1％v/v，稀释在PBS中。
优选地，G7中，二抗染色时间为8～16小时。进一步优选地，二抗染色时间为12小时。
G8、清洗未结合的二抗。
优选地，将G7中染色后的水凝胶浸泡在PBS中半小时清洗未结合的二抗。清洗3次。
G9、水凝胶膨胀。
优选地，将G8得到的水凝胶浸泡在低渗透压的溶液中使水凝胶发生均匀膨胀。
优选地，使水凝胶发生膨胀的低渗透压的溶液种类不受限。如不同浓度的Tris溶液，超纯水等。
优选地，将水凝胶浸泡在50mM Tris溶液中(用超纯水稀释)2小时。
G10、使用激光共聚焦显微镜进行成像。
优选地，G10中，使用激光共聚焦显微镜的自动扫描模式对水凝胶中各个染色区域进行自动扫描成像。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)描述了一种灵活高效的超疏水微坑阵列芯片的制备方法。
相较于之前的技术，所述超疏水微坑阵列芯片通过在两个玻片中间形成树脂微柱，然后注入超疏水预聚物进行固化，由于微柱已经交联在两个玻片中间，玻片和微柱之间没有缝隙，超疏水预聚物不会渗入微坑底部。该方法降低了制备过程中人为因素对制备结果的影响，提高了制备出具有完整图案的超疏水芯片的成功率。
相较于之前的技术，在制备所述超疏水微坑阵列芯片时，无需专门制备用于产生微坑阵列的模具，只需要通过绘图软件绘制想要的图案，然后使用相应图案的光掩模进行光固化即可。当需要改变疏水层的几何形状时，只需要通过绘图软件修改即可，无需制备新的模具。该方法提高了制备所述超疏水微坑阵列芯片的灵活性，同时降低了制备成本。
(2)描述了一种适用于微阵列的并行的药物释放方法，微坑中的药物释放通过将载药的微柱与微坑中的培养基接触实现，这种并行的药物释放方式大大节约了时间成本，而且不需要使用昂贵且复杂的点样机器人，也不需要专业的大型仪器操作员。
(3)在本发明中，在所述超疏水微坑中对细胞进行培养、固定和染色过程都是通过直接将整个芯片浸入所需试剂中，无需逐坑处理。此外，由于微坑芯片的小型化和高集成度的特点，我们只需在所述微坑芯片表面合成一片水凝胶即可对整个芯片所有微坑内的细胞进行成像和分析。在筛选大量药物时，这种并行处理的方式极大地缩短了所需时间，提高了药物筛选的效率。
(4)在本发明中，通过使用高锰酸钾溶液处理所述超疏水微坑阵列芯片中微坑底部玻璃，使得微坑底部玻璃上的“-C＝C-”官能团被氧化反应掉，因此水凝胶在发生化学交联时不会与微坑底部的玻璃之间产生共价结合，使得水凝胶可以轻易从微坑中剥离出。解决了超疏水微坑阵列芯片与膨胀显微镜结合时水凝胶无法从超疏水微坑阵列芯片剥离的技术难题。超疏水微坑阵列芯片与膨胀显微镜的成功结合，提供了一种高通量、高内涵的药物筛选方法。
与现有技术相比，本发明解决了现有药物筛选方法中高通量与高内涵不能很好地兼容的技术难题，在同步提高通量和分辨率的同时，还大大降低了时间和材料成本。此外，该方法使用激光共聚焦显微镜就可得到高分辨率的荧光图像，相较于传统的超分辨技术，极大地缩短了成像所需时间。而且不需要昂贵的仪器设备和和具有丰富专业技术知识的操作员，在普通生物实验室即可实施和完成。其高效性可大大促进药物的早期筛选，减少新发疾病造成的经济和健康损失。
附图说明
图1为实施例一中超疏水微坑阵列芯片示意图。图1中各标记如下：11载玻片、12超疏水微坑阵列层。
图2为实施例一中制备超疏水微坑阵列芯片的流程图。
图3为实施例一、实施例二以及实施例三中用于在两载玻片中间制备微柱阵列以及条带状树脂凸起结构的光路图。
图4为实施例一中制备得到的超疏水微坑阵列芯片的照片。其中图4(a)中超疏水微坑阵列芯片的直径约为700μm，图4(b)中超疏水微坑阵列芯片的直径约为300μm；
图5为实施例一中制备得到的不同超疏水微坑阵列芯片的SEM图像。其中图5(a)中微坑直径为680μm；图5(b)为图5(a)中微坑的纵切面的SEM图像；图5(c)为疏水层微观结构的SEM图像；图5(d)和5(e)中微坑的直径分别为290μm和390μm。图5(f)和5(g)分别为图5(d)和5(e)中黑色虚线框区域的放大图像。
图6为超疏水微坑阵列芯片的超疏水表面的接触角测量结果。
图7为实施例二中多孔状微柱阵列芯片的示意图。图7中各标记如下：71载玻片、72PEGDA微柱阵列。
图8为实施例三中图案化树脂芯片的示意图。图8中各标记如下：81载玻片、82条带状树脂凸起结构。
图9为实施例四中在超疏水微坑阵列芯片中进行高通量细胞微阵列培养的示意图。
图10为在超疏水微坑芯片中接种COS-7以及Hela细胞，然后培养24小时以及60小时，细胞在光学显微镜下的照片，以及相应的60小时的活/死染色的荧光图像。
图11为将多西紫杉醇(母液溶解在DMSO中)用PBS稀释不同倍数后，其在207nm处的吸收值随稀释倍数变化的标准曲线。
图12为实施例五中药物的并行加载和释放的示意图。
图13为实施例五中不同染料并行加载和释放的实物图。
图14为按照实施例五进行药物释放后微坑中溶液的光吸收谱。其中图14(a)为多西紫杉醇并行释放后微坑中溶液的光吸收谱，图14(b)为β-榄香烯并行释放后微坑中溶液的光吸收谱。各图中插图为对应的虚线区域的放大图。
图15为实施例六中利用所述高通量、高内涵的药物筛选方法观察不同浓度多西紫杉醇和β-榄香烯对COS-7细胞微管的影响的实施流程图。
图16为实施例六中所用超疏水微坑阵列芯片的照片以及膨胀后的水凝胶照片。
图17为对照组和膨胀组中正常细胞的微管共聚焦成像结果。其中图17(a)为图17(c)中白色虚线框区域的放大图；图17(b)和图17(c)分别为膨胀组和对照组中正常细胞微管的荧光共聚焦图像；图17(d)为沿着图17(a)和17(b)中白色直线的荧光强度分布图。
图18为实施例六中利用所述高通量、高内涵的药物筛选方法对多西紫杉醇进行药物筛选的结果。其中图18(a)-18(e)为膨胀组中分别经0μM，0.01μM，0.1μM，1μM和10μM多西紫杉醇处理后的细胞微管荧光共聚焦图像；图18(a1)-18(e1)分别为图18(a)-18(e)中白色虚线框区域的放大图；图18(f)-18(j)为对照组中分别经0μM，0.01μM，0.1μM，1μM和10μM多西紫杉醇处理后的细胞微管荧光共聚焦图像；图18(f1)-18(j1)分别为图18(f)-18(j)中白色虚线框区域的放大图；图18(a2)和18(d2)为膨胀组中分别经0μM和1μM多西紫杉醇处理后的细胞微管荧光共聚焦图像；图18(a3)和18(d3)分别为图18(a2)和18(d2)中白色虚线框区域的放大图；图18(k)和图18(l)分别为沿着图18(a3)和图18(d3)中白色直线的荧光强度分布图；图18(m)和图18(n)分别为膨胀组和对照组中沿着各荧光图像中白色直线上的荧光分布图中可分辨的峰的数量。统计显著性计算采用双尾t检验(n＝4)。
图19为实施例六中利用所述高通量、高内涵的药物筛选方法对β-榄香烯进行药物筛选的结果。其中图19(a)-19(d)为膨胀组中分别经0μM，0.489μM，4.89μM和48.9μM β-榄香烯处理后的细胞微管荧光共聚焦图像；图19(e)-19(h)为对照组中分别经0μM，0.489μM，4.89μM和48.9μM β-榄香烯处理后的细胞微管荧光共聚焦图像；图19(a1)-19(h1)分别为对图19(a)-19(h)进行二值化处理后的结果；图19(i)和图19(j)分别为膨胀组和对照组中不同浓度β-榄香烯处理后细胞微管密度分布。统计显著性计算采用双尾t检验(n＝3)
具体实施方式
下面给出本发明的具体实施例。具体实施例仅用于进一步详细说明本发明，不限制本发明权利要求的保护范围。
本发明提供了实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中光敏树脂中包含TPGDA单体、光引发剂TPO，其用量为4％w/v相对于单体。
下述实施例中用于制备超疏水微坑阵列芯片的超疏水预聚物包含：23％v/v BMA、15％v/v EDMA、60％v/v 1-癸醇、2％w/v 1819。
下述实施例中用于制备多孔状微柱阵列芯片的PEGDA预聚物包含：15％w/v PEGDA和0.5％w/v LAP，溶解在超纯水中。
下述实施例中水凝胶预聚物包含：2M NaCl、8.625％w/w丙烯酸钠、2.5％w/w丙烯酰胺、0.15％w/w N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、0.2％w/w APS和0.2％w/w TEMED，溶解在PBS中。
实施例一，基于光刻技术制备超疏水微坑阵列芯片。
超疏水微坑阵列芯片的结构示意图如图1所示，包含硅烷化的玻片11和直接在其表面形成的超疏水微坑阵列层12。
光刻法制备超疏水微坑阵列芯片流程图如图2，具体步骤如下：
玻片的硅烷化修饰和组装：将两片干净的玻片浸泡在食人鱼溶液中(浓硫酸∶双氧水＝3∶1)2小时后取出；超纯水清洗3次，每次5分钟；氮气吹干；在玻片表面涂覆硅烷化试剂(90％v/v无水乙醇，10％v/v 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸甲酯)；室温下静置修饰2小时。修饰完成后丙酮清洗玻片，然后将玻片对齐，再用4层双面胶粘接。
在两玻片中间制备树脂微柱阵列：用注射器将光敏树脂注入上述两玻片的缝隙中，然后将玻片水平放置在图3所示的装置中固化，光敏树脂在DMD反射形成的圆形阵列光掩模下固化形成树脂微柱阵列。固化后，立即用无水乙醇冲洗未固化的光敏树脂。
制备超疏水层：待乙醇挥发后，用注射器向上述玻片和树脂微柱阵列产生的空隙中注入超疏水预聚物并光固化。光固化时紫外光从上向下辐射，与固化光敏树脂时方向相反。
分离树脂微柱阵列和超疏水微坑阵列层：使用刀片分离两个载玻片，在上方的载玻片上得到超疏水微坑阵列层。将超疏水微坑阵列芯片在无水乙醇中浸泡3次，然后转移到100℃真空干燥箱干燥2小时。
超疏水微坑阵列芯片中微坑底部去双键化处理：称量10mg高锰酸钾固体，溶于10mL超纯水，配制1mg/mL的高锰酸钾溶液。然后使用吸管吸取高锰酸钾溶液，从距离超疏水微坑阵列芯片10厘米高处滴下高锰酸钾溶液，直至高锰酸钾溶液覆盖所有微坑。再用吸管吸去超疏水微坑阵列芯片表面多余的高锰酸钾溶液，静置20分钟(此时微坑内的高锰酸钾溶液与微坑底部玻璃表面的“-C＝C-”发生氧化反应)。然后用干燥吸水纸吸去微坑内的高锰酸钾溶液。最后用超纯水冲洗超疏水微坑阵列芯片，置于干燥箱中烘干。
本实施例制备得到的超疏水微坑阵列芯片的照片如图4所示。为确保微坑中有足量的细胞以保证筛药结果的准确性和普遍性，在下述微坑中药物筛选的实施例中我们选用微坑直径为600～700μm的芯片，如图4(a)所示。利用本实施例所述制备方法可制备直径最小为300μm的微坑，如图4(b)所示。
本实施例制备得到的不同微坑直径的超疏水微坑阵列芯片的SEM图片如图5所示。其中图5(a)和图5(b)为直径为680.3μm的微坑的SEM图片，图5(d)和图5(e)分别为直径为290μm和390μm的微坑的SEM图片。图5(f)和图5(g)分别为图5(d)和图5(e)中黑色虚线框区域的放大图。图5(c)为超疏水层微观结构图，其表面的球状聚合物形成的微观结构使其具有超疏水性。
本实施例制备得到的超疏水微坑阵列芯片的超疏水表面的静态接触角测量结果如图6所示，疏水层与培养基的接触角为155°，满足超疏水的条件(＞150°)。
实施例二，用于药物并行释放的多孔状微柱阵列芯片的制备。
多孔状微柱阵列芯片的结构示意图如图7所示，包含硅烷化的玻片71和在其表面形成的PEGDA微柱阵列72。
光刻法制备与所述超疏水微坑阵列芯片尺寸相匹配的多孔状PEGDA微柱阵列芯片的具体步骤如下：
将一硅烷化的玻片和一粘有不粘膜的玻片对齐，然后用3层双面胶粘接。用注射器将PEGDA预聚物注入上述两玻片的缝隙中，然后将玻片水平放置在图3所示的装置中光固化，PEGDA预聚物在DMD反射形成的圆形阵列光下固化形成PEGDA微柱阵列。用小刀轻轻撬开两玻片，然后用超纯水清洗未固化的PEGDA预聚物，最后在硅烷化的玻片上得到PEGDA微柱阵列，冻干备用。
实施例三，图案化树脂芯片的制备。
图案化树脂芯片的结构示意图如图8所示，包含硅烷化的玻片81和在其表面形成的树脂条带结构82。
图案化树脂芯片的具体制备步骤如下：
将一硅烷化的玻片和一粘有不粘膜的玻片对齐，然后用4层双面胶粘接。用注射器将光敏树脂注入上述两玻片的缝隙中，然后将玻片水平放置在图3所示的装置中固化，光敏树脂在DMD反射形成的图案化光掩模下固化形成条带状的树脂凸起结构。用小刀撬开两玻片，然后用无水乙醇清洗未固化的光敏树脂，最后在硅烷化的玻片上得到条带状的树脂凸起结构。
实施例四，超疏水微坑阵列芯片中的细胞培养。
超疏水微坑阵列芯片中的细胞培养和培养基更换方式如图9所示。将超疏水微坑阵列芯片浸泡在无水乙醇中2小时，然后紫外灭菌2小时后使用。接种细胞时，首先将细胞悬液装入移液枪中，并在芯片正上方10厘米左右的高度处逐滴滴下，直至细胞悬液覆盖整个芯片。静置3分钟，然后用移液枪移去多余的细胞悬液。在微坑玻璃底部的亲水性和超疏水层的疏水性的共同作用下，超疏水微坑阵列芯片中自发形成细胞悬液的微液滴阵列。
在培养箱中进行细胞培养时，为防止微坑中的液体蒸发，将载细胞的芯片和培养皿放入一个更大的培养皿中，并在大培养皿内加入适量无菌水，然后立即放入细胞培养箱。
在更换培养基时，用移液枪将新鲜培养基覆盖到整个芯片，2分钟后，移去多余的培养基，放入细胞培养箱。
利用本实施例所述方法，将COS-7细胞接种到超疏水微坑中24小时、60小时后COS-7细胞的光学显微镜图片以及相应的60小时的细胞活/死染色结果如图10(a)所示。
利用本实施例所述方法，将Hela细胞接种到超疏水微坑中24小时，60小时后Hela细胞的光学显微镜图片以及相应的60小时的细胞活/死染色结果如图10(b)所示。
上述结果表明不同细胞在所述超疏水微坑阵列芯片中培养的细胞都具有较高的存活率。
实施例五，药物的并行加载和释放。
在进行药物并行加载与释放之前，需要测量不同浓度药物的光吸收谱，建立光吸收强度随药物浓度变化的标准曲线(以下简称标准曲线)。所使用的多西紫杉醇原液的浓度为1mM，溶解在DMSO中。首先将多西紫杉醇用PBS分别稀释100、500、1000、5000、104、5×104、105、5×105、106倍，然后测量稀释不同倍数后溶液的紫外光吸收谱，测量结果显示其在207nm处具有明显的光吸收，并且吸收强度随稀释倍数的增大而减小，由此得到207nm处光吸收强度随稀释倍数变化的标准曲线，如图11所示。在这里需要说明测量得到的光吸收谱中207nm处的吸收峰为原液中溶剂DMSO的吸收峰，而多西紫杉醇的光吸收信息由于浓度太小而无法检测到。由于多西紫杉醇的原液是溶解在DMSO中的，且多西紫杉醇在原液中的浓度已知，在药物释放后，通过测量微坑中溶液的光吸收谱，得到其在207nm处光吸收强度，就可以根据上述标准曲线反推出稀释倍数，最终得出药物释放后微坑中药物的浓度。
药物的并行加载和释放的流程图如图12所示，具体步骤如下：
如图12所示，用移液枪将不同药物涂覆在上述实施例三中制备得到的图案化树脂芯片中不同条带上，然后将上述实施例二中制备得到的PEGDA微柱阵列倒扣在相应的药物区域后静置，药物自动装载到相应的PEGDA微柱中，静置10分钟。药物装载完成后，将载药的PEGDA微柱阵列倒扣在装有细胞和培养基的微坑中，药物自动释放入微坑中。
为了使药物并行加载和释放的过程可视化，利用本实施例完成了不同染料的自动装载和释放，实物图如图13所示。
利用本实施例进行微坑中的多西紫杉醇的并行释放后，微坑中溶液的光吸收谱如图14(a)所示，通过与上述标准曲线(图11)进行比对，可知药物释放后微坑中多西紫杉醇浓度分别为0.01μM，0.1μM，1μM和10μM。
利用本实施例进行微坑中的β-榄香烯的并行释放的光吸收谱与上述多西紫杉醇的结果相似，如图14(b)所示。原因是测量得到的吸收谱中的吸收峰值实际为DMSO的吸收信号，药物的吸收信号由于浓度太低而无法检测到。
实施例六，在所述超疏水芯片上应用膨胀显微成像技术观察不同浓度多西紫杉醇和β-榄香烯对COS-7细胞微管形态的影响(如图15)，具体步骤如下：
按照上述实施例五完成药物释放后，使细胞在药物中培养12小时，然后将细胞从培养箱取出，再向培养皿中加入0.2％v/v Triton X-100溶液直至浸没芯片，在0℃下处理1分钟后用吸管吸走。接下来，按照上述方法依次加入含有3％w/v多聚甲醛和0.1％v/v戊二醛的PBS溶液，0.1％w/v NaBH4，0.5％v/v Triton X-100和1％w/v BSA。
1％(w/v)BSA处理30分钟后，使用微量移液枪将mouse anti-Homo sapiensTUBA1A monoclonal antibody(以下简称一抗，1∶100稀释在1％w/v BSA中)添加到微坑中，孵育过夜。
孵育完成后，用PBS浸洗3次，每次5分钟。
向培养皿中加入0.1mg/mL AcX溶液直至浸没芯片，处理细胞2小时。
AcX处理完成后，将预先配制好的200μL水凝胶预聚物滴加到芯片表面，然后将一块盖玻片放置在水凝胶预聚物表面压平，避免产生气泡，再将覆盖有水凝胶的芯片放入37℃恒温箱中。3小时后交联成胶，从恒温箱中取出。
配制消化缓冲液，包含50mM Tris-HCl，1M NaCl，0.5％v/v Triton X-100，0.8M盐酸胍，用超纯水稀释。
将上述覆盖有水凝胶的芯片浸没在蛋白酶K(8units/mL稀释在消化缓冲液中)中，均质化3小时，水凝胶自动从芯片上脱落，然后用小型毛刷将水凝胶转移到培养皿中，用PBS浸洗3次，每次30分钟。
浸洗完成后将水凝胶浸没在Cy3-conjugated goat-anti-mouse antibody(以下简称二抗，1∶100稀释在PBS中)中染色过夜。染色完成后用PBS浸洗3次，每次30分钟。
浸洗完成后，将水凝胶浸没在50mM Tris溶液中进行膨胀。
使用激光扫描共聚焦显微对上述膨胀后水凝胶中的细胞微管进行成像(以下称膨胀组)，然后使用ImageJ软件进行图像分析。
作为对照，制备了底部为薄玻片的超疏水微坑阵列芯片，在其中培养细胞后进行常规的微管染色，然后使用激光扫描共聚焦显微镜对未经水凝胶膨胀的细胞微管进行成像(以下称对照组)，用ImageJ软件进行图像分析。
本实施例中所用超疏水微坑阵列芯片和膨胀后的水凝胶图片如图16所示，通过比较膨胀前后水凝胶的尺径(图16(a)和16(b))，本实施例中水凝胶的放大倍数为3.6倍。
本实施例中采集到细胞微管的共聚焦图像如图17所示，其中图17(b)和17(c)分别为膨胀组和对照组中正常细胞微管的荧光图像，图17(a)为图17(c)中白色虚线框区域的放大图。图17(d)为沿着图17(a)和17(b)中白色直线的光强分布。可以看到在膨胀组中细胞微管的半高宽为80nm，而对照组中细胞微管的半高宽为280nm。本实施例中所用共聚焦显微镜(60×，1.42NA，油浸物镜)的衍射极限为244.86nm，除以膨胀系数后，得到膨胀后横向分辨率约为68nm。
本实施例中，多西紫杉醇处理后细胞微管的荧光图像如图18所示，在膨胀组中，正常细胞(多西紫杉醇浓度为0μM)的微管呈丝状均匀分布(图18(a)和图18(a1))。经0.01μM多西紫杉醇处理后，其边缘处的微管开始聚集并形成一些小微管束(图18(b1))。经0.1μM多西紫杉醇处理后，靠近细胞中心的微管也开始聚集并形成一些相对松散的周向微管束(图18(c1))。随着多西紫杉醇浓度进一步增加(1μM)，微管进一步聚集，形成致密的微管束(图18(d1))。当多西紫杉醇浓度增加到10μM时，形成了多个致密的小微管束，像是微管束断裂成段(图18(e1))。
研究表明多西紫杉醇通过诱导微管聚集、抑制微管组装动力学阻止细胞分裂。上述膨胀组中的结果与理论结果一致。
在对照组中(图18(f)-10(j)；图18(f1)-(j1))，不同浓度的多西紫杉醇处理后细胞的微管形态之间的差异并不明显。
为定量分析微管的聚集程度，在图18(a)-18(e)以及图18(f1)-18(j1)中，提取垂直于微管排列方向的4条等长直线上的荧光强度图，然后计算强度图中可分辨的峰的数量(当峰顶和峰谷的高度差大于峰值的一半时认为该峰可分辨)。例如，图18(k)为图18(a3)中白色直线上的荧光强度分布图，可以看到21个可分辨的峰，表明沿着图18(a3)中白色直线上有21条可分辨的微管排列。同样地，图18(d3)中白线的强度分布图中，仅存在5个可区分的峰(图18(l))，即图18(d3)中白线上只有5条可分辨的微管排列。然而，在图18(l)的强度曲线中有两个特别宽的峰(第四和第五个峰)，并且峰顶处有许多小的波动。结合图18(d3)，可推测在这两个峰的位置其实有更多微管，只是由于这些微管聚集成了致密的微管束而无法区分。因此，在等长的直线上，微管的聚集程度越高，可分辨的微管数越少。
图18(m)和图18(n)分别为本实施例中使用上述方法计算出的图18(a)-18(e)以及图18(f1)-18(j1)中白色直线上可分辨的微管数量。在膨胀组中(图18(m))，可分辨峰的数量随药物浓度的增加而减少，即微管的聚集程度随药物浓度增加而增加。除0.01μM组外，0μM组和药物处理组之间都有显著差异(p＜0.0001)(n＝4)。0μM和0.01μM组之间差异不显著的原因如下：由于0.01μM浓度较低，仅在细胞边缘形成少量微管束。而在选择划线位置时，为确保整条线段都有微管分布，划线位置更靠近细胞中心，在这些区域还未形成微管束。此外，1μM组和10μM组间差异不显著是由于1μM多西紫杉醇处理后微管聚集程度已经达到饱和。然而，在对照组中(图18(n))，各个浓度组之间可分辨峰的数量没有显著差异(p＞0.05)(n＝4)。
本实施例中，β-榄香烯处理后细胞微管的荧光图像如图19所示。在膨胀组中，正常细胞(β-榄香烯浓度为0μM)的微管排列均匀，整体上表现为纺锤形(图19(a))。用0.489μMβ-榄香烯处理后，微管开始变得弯曲，但整体上保持纺锤形(图19(b))。增加β-榄香烯浓度(4.89μM)后，微管排列不再均匀，变得分散而稀疏(图19(c))。β-榄香烯浓度增加至48.9μM时，微管变得更加稀疏，并且排列完全无序，不再保持纺锤形(图19(d))。研究表明β-榄香烯通过下调α-微管蛋白和抑制微管聚合来抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。上述膨胀组中的结果与理论结果一致。
在对照组中(图19(e)-19(h))，不同浓度的β-榄香烯处理后细胞的微管形态之间差异不明显。
为定量分析微管的分散程度，计算了不同浓度药物处理后细胞微管的密度。使用ImageJ软件对所有图像进行二值化处理(图19(a1)-19(h1))。在每个图像中手动圈出三个细胞的轮廓，计算细胞的总面积和微管的面积。微管密度定义为微管面积占细胞总面积的比例(图19(i)和图19(j))。在膨胀组中(图19(i))，微管密度随β-榄香烯浓度的增加而降低，除0.489μM组外，0μM组和药物处理组之间都有显著差异(p＜0.001)(n＝3)。0.489μM组和0μM组差异不显著的原因在于其浓度太低，未引起微管密度分布的显著变化。
在对照组中(图19(j))，微管密度与药物浓度无明显的依赖关系，0μM组和药物处理组的微管密度间差异不显著(p＞0.05)(n＝3)。
上述定性和定量分析的结果表明，在药物处理后细胞微管形态变化方面，膨胀组提供了更丰富的信息。而在对照组中，这些信息由于光学衍射极限限制无法被分辨和提取出来。这凸显了本发明将高通量的超疏水微坑阵列芯片与高内涵的膨胀显微成像技术相结合对于研究药物的药理作用的重要意义。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (22)

1.一种高通量，高内涵的药物筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、制备超疏水微坑阵列芯片、多孔状微柱阵列芯片以及图案化树脂芯片；
步骤2、对超疏水微坑阵列芯片中微坑底部进行去双健化处理；
步骤3、将细胞接种到超疏水微坑阵列芯片上的每个微坑中进行细胞培养；
步骤4、当细胞增殖到微坑底部面积的80％时，使用不同浓度的待筛选药物对细胞进行药物处理；
步骤5、药物处理完成后，应用膨胀显微技术对细胞进行染色和膨胀处理；
步骤6、荧光图像采集和分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述超疏水微坑阵列芯片的微坑底部为硅烷化的玻璃，除微坑底部以外的表面均为超疏水层。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述超疏水微坑阵列芯片制备方法包括以下步骤：
A1、将两个硅烷化的玻片两侧对齐粘接后，在缝隙中注入光敏树脂；然后利用图案化的光掩模对上述光敏树脂进行光固化，固化完成后清洗掉未固化的光敏树脂，在两个玻片中间形成树脂微柱阵列；
A2、将固化后具有超疏水性的含有“-C＝C-”的超疏水预聚物注入到两玻片和树脂微柱阵列产生的空隙中，再利用紫外光对超疏水预聚物进行固化(此时，紫外光的辐照方向与固化光敏树脂时的辐照方向相反)，固化完成后在两玻片和树脂微柱的缝隙中形成超疏水层；
A3、由于固化光敏树脂和超疏水预聚物时紫外光辐照的方向相反，树脂微柱阵列和超疏水层优先固化在不同的玻片上；将两个玻片从粘接处撬开，两玻片分离后，在一侧的玻片上得到完整的超疏水微坑阵列层，在另一侧玻片上得到树脂微柱阵列；覆盖有超疏水微坑阵列层的玻片即所述超疏水微坑阵列芯片；
A4、清洗掉超疏水微坑阵列芯片表面和内部的未固化预聚物，烘干后备用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，A1中，光敏树脂的配方不受限，可以是任何含有“-C＝C-”的可光固化的光敏树脂。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，A2中，超疏水预聚物的配方不受限，可以是任何含有“-C＝C-”的，可光固化的，固化后具有超疏水性的预聚物。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，A4中，用于清洗超疏水微坑阵列芯片的溶液不受限，可以是任何可以溶解超疏水预聚物的，不破坏超疏水层的溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述多孔状微柱阵列芯片的基底为硅烷化的玻璃，其上为多孔状的微柱阵列。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述多孔状微柱阵列芯片的制备方法包括以下步骤：
B1、将一片硅烷化的玻片和一片粘有不粘膜的玻片两侧对齐粘接，然后在缝隙中注入经光固化后可形成多孔状聚合物的预聚物，再利用图案化的光掩模对上述预聚物进行光固化；
B2、将两个玻片从粘接处撬开，两玻片分离后，在烷基化的玻片上得到完整的微柱阵列，然后清洗掉未固化的预聚物后冻干。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，B1中，用于制备多孔状聚合物的预聚物的配方不受限，可以是任何含有“-C＝C-”的，可光固化的，固化后形成多孔状结构的预聚物。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，B2中，用于清洗未固化的预聚物的溶液不受限，可以是任何可以溶解未固化预聚物的，不破坏微柱结构的溶液。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述图案化树脂芯片的基底为硅烷化的玻璃，其上为图案化的树脂凸起结构。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述图案化树脂芯片的制备方法包括以下步骤：
C1、将一片硅烷化的玻片和一片粘有不粘膜的玻片两侧对齐粘接，然后在缝隙中注入光敏树脂；然后利用图案化的光掩模对上述光敏树脂进行光固化；
C2、将两个玻片从粘接处撬开，在烷基化的玻片上得到图案化的树脂结构，然后清洗掉未固化的光敏树脂。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，C1中，光敏树脂的配方不受限，可以是任何含有“-C＝C-”的可光固化的光敏树脂。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，C2中，用于清洗掉未固化的光敏树脂的溶液不受限，可以是任何可以溶解光敏树脂，并且不破坏固化后的树脂图案的溶液。
15.根据权利要求3，8，12中的任一所述方法，所述图案化的光掩模的形成方式和图案形状均不受限，可以是任何可以形成图案化光强分布的方式。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，去双键化处理的方式不受限，可以是任何可以去掉微坑底部“-C＝C-”的方法。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，可通过用高锰酸钾溶液(0.1～10mg/mL)处理微坑底部进行去双键化处理。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，对微坑中的细胞进行药物处理的步骤如下：
D1、将不同的药物均匀涂抹到图案化树脂芯片的各个树脂图案区域，在图案化树脂结构表面得到液体药物层；
D2、使多孔状微柱阵列芯片中的微柱与液体药物层相接触，实现多孔状微柱阵列中药物的自动加载；
D3、将装载有不用药物的多孔状微柱阵列芯片的微柱插入到接种有细胞的超疏水微坑阵列芯片的微坑中，形成微柱-微坑镶嵌结构，此时多孔状微柱中的药物扩散进微坑中，实现药物的并行释放。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中，应用膨胀显微技术时进行染色和膨胀时，步骤如下：
E1、固定细胞，固定细胞的流程因染色结构而异，均可通过常规的细胞固定流程实现；
E2、封闭细胞，用1％w/v的牛血清白蛋白(BSA，稀释在PBS中)封闭；
E3、孵育一抗，使用微量移液枪将一抗加入超疏水微坑阵列芯片的每个微坑中进行孵育；
E4、锚定试剂处理细胞；
E5、将水凝胶预聚物滴加到所述超疏水微坑阵列芯片上，然后用尺寸匹配的盖玻片轻轻压平后静置于37℃恒温箱使水凝胶预聚物交联成水凝胶；
E6、水凝胶交联完成后，使用蛋白酶K均质化；
E7、选择与上述E3中一抗相匹配的，带有荧光标记的二抗进行染色；
E8、清洗未结合的二抗；
E9、将E8得到的水凝胶浸泡在低渗透压的溶液中使水凝胶发生均匀膨胀；
E10、使用激光共聚焦显微镜采集荧光图像。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，E4中，锚定剂的选择不受限，只需要能与蛋白或抗体结合，并带有“-C＝C-”官能团，可参与水凝胶交联即可。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，E5中，水凝胶预聚物的配方不受限制，可以是任何可用于细胞或组织膨胀的水凝胶预聚物。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，E9中，使水凝胶发生均匀膨胀的低渗透压的溶液种类不受限。可以是不同浓度的Tris溶液，超纯水等。
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