CN108588010B - 二维培养系统在小鼠肠上皮干细胞体外培养中的应用 - Google Patents

二维培养系统在小鼠肠上皮干细胞体外培养中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种培养系统。该培养系统用于单层细胞培养，该培养系统包括：基质胶、N2、B27、双抗、GlutaMAX、N‑acetylcysteine、R‑spondin 1以及基础培养基，其中，所述基质胶的厚度为5μm～50μm。该培养系统适用于胃肠道的表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养，尤其适用于肠道表皮细胞和肠道干细胞的单层细胞的培养。该培养系统可以更加直观的观察胃肠道表皮细胞和干细胞的一系列生化细胞水平的变化，能很好的模拟体内肠道表皮细胞的各项指标，能更加便捷地探索外泌体、炎症因子等对小肠干细胞稳态的影响，提供低成本、高效率的筛药体系。

Description

二维培养系统在小鼠肠上皮干细胞体外培养中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及二维培养系统在小鼠肠上皮干细胞体外培养中的应用。
背景技术
肠上皮是人体执行消化吸收功能的主要结构，它更新十分迅速，而它的更新主要是由位于其底部陷窝结构中的肠上皮干细胞所驱动的，因而肠干细胞的研究与人体健康息息相关。近年来，肠上皮干细胞体外培养系统便于在体外直接对肠上皮干细胞进行操作和观察，大大推动了肠上皮干细胞的研究。这些体外培养的肠上皮干细胞还可以整合进入损伤后的肠上皮，帮助修复肠上皮的损伤，有希望被应用于肠道损伤疾病的治疗。
目前，对于小肠上皮细胞和干细胞的研究多依赖于基质胶(Matrigel)的体外三维培养系统。三维培养系统可形成绒毛-陷窝结构的小肠类器官，其可摆脱间充质细胞的依赖并具有自我更新和分化的能力。在进行小鼠小肠上皮类器官培养时，使用的培养条件为：基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine，以及所需要的生长因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1。在进行单细胞培养时，需要在类器官培养基的基础上加入10μM的Blebbistatin和100ng/mL的Wnt-3a。进行小鼠结肠类器官体外培养时，需要在小肠培养基的基础上加入100ng/mL的WNt-3a。进行人的小肠培养时需要在小鼠小肠陷窝培养基的基础上加入100ng/mL的WNt-3a，500nM的A83-01，10μM的SB202190，1M的Nicotinamide和100μM的[Leu15]-Gastrin I。
发明内容
现有技术中的胃肠干细胞、表皮细胞体外培养系统需要基质胶以及加入EGF、Noggin和R-spondin(ENR)或者ENR和Wnt-3a(ENRW)等生长因子的培养基，而基质胶和这些所必须的生长因子价格昂贵，不利于胃肠干细胞和表皮细胞培养系统的推广，进而限制了胃肠干细胞和表皮细胞在体外大量扩增，用于胃肠道疾病的治疗。其次，现有技术中的培养系统的类器官是三维立体存活的，不利于生化细胞水平的直观观察。为了解决上述问题，发明人开发了一种体外二维(2D)培养系统，该培养系统利用较少的Matrigel，建立了可以不含EGF和Noggin等生长因子的单层细胞培养系统，同时上述培养系统适用于胃肠道的表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养，尤其适用于肠道表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养。培养的肠上皮干细胞具有与体内干细胞相似的增殖、分化和凋亡能力，其基因表达水平与三维培养的干细胞具有高度一致性，并且可以有效地在体外维持Lgr5-GFP+肠上皮干细胞内在的自我更新和分化能力。并且通过上述培养系统可以更加直观地观察胃肠道表皮细胞和干细胞的一系列生化细胞水平的变化，很好的模拟体内肠道表皮细胞和干细胞的各项指标，更加便捷地探索外泌体、炎症因子等对小肠干细胞稳态的影响，提供低成本、高效率的筛药体系。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种培养系统。根据本发明的实施例，所述培养系统用于单层细胞培养，所述培养系统包括：基质胶、N2、B27、双抗、GlutaMAX、N-acetylcysteine、R-spondin 1以及基础培养基，其中，所述基质胶的厚度为5μm～50μm。发明人发现，厚度超出50μm的基质胶将形成多层细胞，而厚度小于50μm的基质胶可以形成单层细胞，而厚度小于5μm的基质胶将不能支撑细胞生存，细胞存活率会大大降低。根据本发明实施例的培养系统适用于胃肠道的表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养，尤其适用于肠表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养。培养的单层干细胞具有与体内干细胞相似的增殖、分化和凋亡能力，其基因表达水平与三维培养的干细胞具有高度一致性，并且可以有效地在体外维持Lgr5-GFP+肠上皮干细胞内在的自我更新和分化能力。并且通过根据本发明实施例的培养系统可以更加直观的观察胃肠道表皮细胞和干细胞的一系列生化细胞水平的变化，很好的模拟体内肠道表皮细胞的各项指标，更加便捷地探索外泌体、炎症因子等对肠干细胞稳态的影响，提供低成本、高效率的筛药体系。
根据本发明的实施例，所述培养系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12。
根据本发明的实施例，所述基质胶的厚度为10μm。发明人发现，厚度为10μm的基质胶能更好地形成单层细胞。
根据本发明的实施例，所述细胞为干细胞或表皮细胞。根据本发明实施例的培养系统培养干细胞或表皮细胞的单层细胞，效果更佳。
根据本发明的实施例，所述细胞为肠干细胞或肠表皮细胞或胃干细胞或胃表皮细胞。根据本发明实施例的培养系统培养肠干细胞或肠表皮细胞或胃干细胞或胃表皮细胞的单层细胞培养，效果更佳。
根据本发明的具体实施例，所述细胞为肠干细胞。培养肠干细胞的单层细胞培养，效果更佳。
根据本发明的实施例，所述GlutaMAX的浓度为0.5-10mM，优选为2mM。
根据本发明的实施例，所述N-acetylcysteine的浓度为0.2-5mM，优选为1mM。
根据本发明的实施例，所述R-spondin 1的浓度为100-1000ng/mL，优选为1μg/mL。
根据本发明实施例的培养系统中有效成分在上述工作浓度下，使得培养系统的培养效率和细胞的成活率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括Blebbistatin。进而极大的促进小肠表皮细胞的存活率。
根据本发明的实施例，所述Blebbistatin的浓度为2-10μM，优选为10μM。发明人发现，细胞的存活率对Blebbistatin具有剂量依赖性，10μM的blebbistatin可以极大的提高细胞的存活率。
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括EGF。发明人发现，培养基中加入EGF可在一定程度上提高小肠干细胞的细胞比例。
根据本发明的实施例，所述EGF的浓度为5-100ng/mL，优选为50ng/mL。进而小肠干细胞的比例进一步提高。
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括Noggin以及LDN-193189的至少之一。发明人发现，Noggin和LDN-193189可以有效的抑制BMP信号通路，维持小肠干细胞干性。
根据本发明的实施例，所述Noggin的浓度为5-200ng/mL。进而，可以进一步有效的抑制BMP信号通路，维持小肠干细胞的干性。
根据本发明的实施例，所述Noggin的浓度为100ng/mL。进而，可以更进一步有效抑制BMP信号通路，更好地维持小肠干细胞的干性。
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括LDN-193189和/或GSK3抑制剂。发明人发现，LDN-193189和GSK3抑制剂同时使用，能可以大大促进小肠干细胞(如Lgr5-GFP)的比例，且不会影响其他分化细胞的占比。同样，Noggin与GSK3抑制剂同时使用，也能一定程度上促进小肠干细胞的比例。
根据本发明的实施例，所述GSK3抑制剂为CHIR-99021或LY2090314。发明人发现，GSK3抑制剂为CHIR-99021或LY2090314时，能更加促进小肠干细胞(如Lgr5-GFP)的比例，且不会影响其他分化细胞的占比。
根据本发明的实施例，所述GSK3抑制剂为CHIR-99021。CHIR-99021毒性较小，加入培养系统的效果更佳。
根据本发明的实施例，所述LDN-193189的浓度为0.1-2μM。发明人发现浓度为0.1-2μM的LDN-193189可以显著抑制BMP信号通路并提高干细胞比例。
根据本发明的实施例，所述LDN-193189的浓度为0.5μM。发明人发现浓度为0.5μM的LDN-193189可以更加显著抑制BMP信号通路并大大提高干细胞比例。
根据本发明的实施例，所述CHIR-99021的浓度为1-10μM。发明人发现浓度为1～10μM的CHIR-99021可以显著激活Wnt信号通路并提高细胞存活率。
根据本发明的实施例，所述CHIR-99021的浓度为2.5μM。发明人发现，浓度为2.5μM的CHIR-99021可以更加明显激活Wnt信号通路并大大提高细胞存活率。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种培养系统。根据本发明的具体实施例，所述培养系统用于单层细胞培养。
根据本发明的具体实施例，所述培养系统包括：基质胶、Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、2-10μM的Blebbistatin、5-100ng/mL的EGF、5-200ng/mL的Noggin，其中，所述基质胶的厚度为5～50μm。
根据本发明的具体实施例，所述培养系统包括：基质胶、Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、5-200ng/mL的Noggin，其中，所述基质胶的厚度为5～50μm。
根据本发明的具体实施例，所述培养系统包括：基质胶、Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、0.1-2μM的LDN-193189，其中，所述基质胶的厚度为5～50μm。
根据本发明的具体实施例，所述培养系统包括：基质胶、Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、5-200ng/mL的Noggin、1-10μM CHIR-99021，其中，所述基质胶的厚度为5～50μm。根据本发明的具体实施例，所述培养系统包括：基质胶、Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、0.1-2μM的LDN-193189、1-10μM CHIR-99021，其中，所述基质胶的厚度为5～50μm。
发明人发现，根据本发明实施例的上述培养系统厚度超出50μm的基质胶将形成多层细胞，而厚度小于50μm的基质胶可以形成单层细胞，但厚度小于5μm的基质胶将不能支撑细胞生存，细胞存活率会大大降低。根据本发明实施例的上述培养系统适用于胃肠道的表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养，尤其适用于肠表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养。培养的单层干细胞具有与体内干细胞相似的增殖、分化和凋亡能力，其基因表达水平与三维培养的干细胞具有高度一致性，并且可以有效地在体外维持Lgr5-GFP+肠上皮干细胞内在的自我更新和分化能力。并且通过根据本发明实施例的培养系统可以更加直观的观察单层细胞的一系列生化细胞水平的变化，很好的模拟体内肠道表皮细胞的各项指标，更加便捷地探索外泌体、炎症因子等对肠干细胞稳态的影响，提供低成本、高效率的筛药体系。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种单层细胞培养的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将初始培养样本在前面所述的培养系统中进行培养，所述培养系统中的基质胶预先平铺在培养器皿中。发明人发现，厚度超出50μm的基质胶将形成多层细胞，而厚度小于50μm的基质胶可以形成单层细胞，而厚度小于5μm的基质胶将不能支撑细胞生存，细胞存活率会大大降低。根据本发明实施例的培养方法应用于胃肠道的表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养，尤其是肠表皮细胞和干细胞的单层细胞的培养，所获得的单层细胞具有与体内对应细胞相似的增殖、分化和凋亡能力等，其基因表达水平与三维培养的干细胞具有高度一致性，并且可以有效地在体外维持Lgr5-GFP+肠上皮干细胞内在的自我更新和分化能力。并且通过根据本发明实施例的培养方法可以更加直观的观察单层细胞的一系列生化细胞水平的变化，很好的模拟体内肠道表皮细胞的各项指标，更加便捷地探索外泌体、炎症因子等对肠干细胞稳态的影响，提供低成本、高效率的筛药体系。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述细胞为干细胞或表皮细胞。需要注意的是，根据本发明具体实施例的干细胞为肠上皮干细胞。根据本发明实施例的培养方法培养干细胞或表皮细胞的单层细胞，效果更佳。
根据本发明的实施例，所述细胞为肠干细胞或肠表皮细胞或胃干细胞或胃表皮细胞。发明人发现，根据本发明实施例的培养方法更加适用于胃肠道干细胞和表皮细胞的培养。
根据本发明的具体实施例，所述细胞为肠干细胞或肠表皮细胞。发明人发现，根据本发明实施例的培养系统更加适用于肠道干细胞和表皮细胞的培养。
根据本发明的实施例，所述初始培养样本为小肠陷窝。小肠陷窝中具有丰富的小肠上皮干细胞，将小肠陷窝作为初始培养样本，可进一步提高小肠上皮干细胞单层细胞的培养效果。
根据本发明的具体实施例，所述小肠陷窝预先重悬于培养基中。进而小肠陷窝中上皮干细胞慢慢沉降，贴壁生存，形成二维单层细胞。
所述培养基包括：Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、2-10μM的Blebbistatin、5-100ng/mL的EGF、5-200ng/mL的Noggin。
根据本发明的具体实施例，所述小肠陷窝预先重悬于培养基中，所述培养基包括：Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、5-200ng/mL的Noggin。
根据本发明的具体实施例，所述小肠陷窝预先重悬于培养基中，所述培养基包括：Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、0.1-2μM的LDN-193189。
根据本发明的具体实施例，所述小肠陷窝预先重悬于培养基中，所述培养基包括：Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、5-200ng/mL的Noggin、1-10μM CHIR-99021。
根据本发明的具体实施例，所述小肠陷窝预先重悬于培养基中，所述培养基包括：Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、0.5-10mM的GlutaMAX、0.2-5mM的N-acetylcysteine、100-1000ng/mL的R-spondin 1、0.1-2μM的LDN-193189、1-10μM CHIR-99021。
根据本发明的具体实施例，所述培养器皿为细胞培养板，所述细胞培养板中设置有载玻片，所述基质胶预先平铺在所述细胞培养板中的载玻片上。
根据本发明的具体实施例，预先将所述载玻片进行脱水处理。发明人发现，对载玻片进行脱水处理，能有效保证基质胶厚度的均一。
根据本发明的具体实施例，所述脱水处理是通过OTS化学修饰进行的。OTS为对甲苯磺酰氧基。
根据本发明的实施例，所述平铺在所述细胞培养板中的载玻片上是通过如下方式进行的：向所述载玻片上滴加所述基质胶，再盖上盖玻片，所述盖玻片预先通过3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯(TMSPMA)进行化学修饰，所述基质胶的厚度为小于5～50μm；以及将所述盖玻片移除，以便获得平铺有所述基质胶的载玻片。基质胶属于水凝胶液体，发明人通过将盖玻片通过TMSPMA进行化学亲水修饰，使其可以与基质胶紧密结合，而不会粘黏在载玻片上，同时通过控制基质胶的体积和盖玻片的面积，进而改变基质胶的厚度。
根据本发明的实施例，所述培养是在温度为37摄氏度、5％二氧化碳的条件下中进行的。根据本发明实施例的培养条件能更好地进行胃肠道表皮细胞和干细胞的体外培养。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种筛药方法。根据本发明的实施例，所述药物用于提高肠干细胞的稳态，包括：将候选药物与肠干细胞进行接触，所述肠干细胞是通过前面所述的系统或前面所述的方法培养获得的；所述接触后相较于所述接触前，肠干细胞的稳态提升，是所述候选药物为目标药物的指示。需要说明的是，本申请所述的“肠干细胞的稳态”指肠干细胞的存活状态、增殖状态和分化能力等。根据本发明的实施例，肠干细胞的稳态可以通过检测肠干细胞的存活数量作定量分析；或通过检测标记的肠干细胞的荧光强度作定量分析；或通过免疫荧光对增殖标记物，如Ki67或PCNA等进行染色，分析其增殖能力；或通过定向分化系统，检测分化能力的变化；或者对细胞加辐照或药物刺激，检测在应激状态下，肠干细胞的存活率、增殖能力等方面的变化进而来反应药物对于肠干细胞稳态的影响。根据本发明实施例的方法能便捷地探索外泌体、炎症因子等对小肠干细胞稳态的影响，且成本低、效率高。
需要说明的是，本申请所述的干细胞的干性是指能表达干细胞干性基因，能分化形成各种细胞类型，单个细胞具有形成完整的类器官的能力，例如，本申请所述的肠干细胞的干性是指能表达肠干细胞干性基因Lgr5，能分化形成肠上皮各种细胞类型，单个细胞具有形成完整的肠类器官的能力。
另外，需要说明的是，本申请使用的培养初始的肠陷窝或肠干细胞可购买获得或自行分离获得，分离方法为本领域技术人员常规实验方法，不需经过外科临床培训即可掌握。
附图说明
图1是根据本发明实施例的blebbistatin可以在体外二维培养中显著提高小肠表皮细胞存活率；
图2是根据本发明实施例的体外二维系统可以培养并维持小鼠小肠上皮细胞的Lgr5+干细胞；
图3是根据本发明实施例的二维培养系统培养的细胞是表皮细胞且是单层生存的；
图4是根据本发明实施例的LDN与CHIR的加入可以大大提高小肠干细胞比例；
图5是根据本发明实施例的二维培养系统可以在体外维持小鼠小肠干细胞干性、细胞增殖、各分化细胞和正常凋亡；
图6是根据本发明实施例的二维培养与三维体外培养的小肠干细胞的基因表达水平相似；以及
图7是根据本发明实施例的二维培养的小肠干细胞具有自我更新能力和分化能力。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
以下实施例中，所用的基质胶购自BD Bioscience公司，货号为356231。
双抗购自Invitrogen公司,货号：15140-148，原始浓度：100X，工作浓度：1X。
N2购自Invitrogen公司,货号：17502-048，原始浓度：100X，工作浓度：1X。
B27购自Invitrogen公司,货号：17504-044，原始浓度：50X，工作浓度：1X。
所用到基础培养基为Advanced DMEM/F12；
所用到的BENR包含Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、10μM的blebbistatin、50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1；
所用到的BNR包含Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、10μM的blebbistatin、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1；
所用到的BLR包含Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、10μM的blebbistatin、0.5μM的LDN-193189和1ug/mL的R-spondin 1；
所用到的BNRC包含Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、10μM的blebbistatin、100ng/mL的Noggin、1ug/mL的R-spondin 1和2.5μM的CHIR-99021；
所用到的BLRC包含Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、10μM的blebbistatin、0.5μM的LDN-193189、1ug/mL的R-spondin 1和2.5μM的CHIR-99021。
实施例1基于2D培养系统的小鼠小肠陷窝培养
按照本发明提供的二维的干细胞培养基在培养干细胞的用途，对本实施例中制备的离体小鼠小肠陷窝进行培养。利用小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞三维体外培养为小肠类器官技术，构建了小肠表皮细胞的2D培养体系。按照文献(Sato,T.et al.(2009).“Single Lgr5stem cells build crypt-villus structures in vitro without amesenchymal niche.”Nature 459,262-5)报道的方法，从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠(可通过The Jackson Laboratory组织购得，Stock Number:008875，其特点描述：将绿色荧光蛋白基因GFP人工插入到内源Lgr5基因的启动子下游，故此转基因小鼠中表达Lgr5基因的细胞均被绿色荧光蛋白GFP标记，可用于追踪Lgr5阳性的成体干细胞)中分离并培养小肠陷窝，构建二维体外培养系统，具体方法如下所述：
(1)为了得到均一厚度的基质胶来支撑单层小肠表皮细胞的培养，发明人对盖玻片和载玻片进行化学修饰等处理。首先发明人对载玻片进行OTS化学修饰，即对载玻片表面加上了疏水基团，令其脱水。其次发明人对适用于24孔板、48孔板等的盖玻片进行TMSPMA的化学亲水修饰，即对盖玻片表面加上了亲水基团。而基质胶属于一种水凝胶液体，发明人通过控制基质胶的体积和盖玻片的面积，来改变基质胶的厚度。如，发明人使用48孔板的盖玻片时，首先在预冷的载玻片上滴加1μL的基质胶，再将盖玻片盖在基质胶上，利用其毛细作用，将基质胶压在盖玻片上且其厚度为10μm。而修饰过的盖玻片具有亲水性，修饰过的载玻片具有疏水性，使这一厚度的基质胶可以紧密结合在盖玻片上，而并不会粘黏在载玻片。将载玻片和盖玻片放置在室温五分钟后，将其浸泡在75％酒精中，将盖玻片轻轻地从载玻片上推离，将基质胶面向上放置在48孔细胞培养板内，待其酒精挥发紫外灭菌后即可使用。
(2)从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠中分离出小肠，将其纵切并用预冷的pH值为7.4的PBS缓冲液洗三遍，以去除食糜，之后用手术刀仔细刮去小肠内壁上的小肠绒毛。将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mM EDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟。用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量小肠陷窝从肠片上脱落到上清中。所获上清用70μm孔径的细胞筛(购于BD公司，货号352350)过滤，以去除残存的小肠绒毛，再经过600rpm转速离心3分钟去除散落的单细胞。离心后的沉淀为较为纯净的小肠陷窝，可用于体外培养以及通过后续处理从中获取Lgr5+小肠成体干细胞。
(3)将每200个分离的小肠陷窝与培养基重悬后平铺在已经处理过的10μm厚度的基质胶上。此时的培养基使用含有基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine，以及所需生长因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1的培养基培养。置于37摄氏度二氧化碳细胞培养箱中培养。发明人发现blebbistatin可以极大的促进小肠表皮细胞的存活率，此处发明人通过测试不同浓度的blebbistatin对二维系统中小肠表皮细胞存活率的影响。如图1A所示，10μM的blebbistatin可以极大的提高存活率，统计结果也可以得到相似的结果。如图1A所示，培养两天后，虽然在没有Blebbistatin条件下的细胞可以存活，但是存活率很低。而图1B显示，不同浓度Blebbistatin的加入剂量依赖性地提高了细胞的存活率，最终发明人选择10μM的blebbistatin来培养小肠表皮细胞以得到状态更好的细胞。
(4)实验结果如图2A所示，发明人发现在细胞形态和细胞致密性两方面上，二维培养的小鼠小肠表皮细胞存在异质性。通过共聚焦显微镜(Olympus公司FV2000)对二维培养的小肠表皮细胞进行活细胞观察，获取明场和绿色荧光图片。发明人可以清晰地观察到，密度较高的组分细胞的大小更小，且其可以与Lgr5-GFP有很好的共定位。这种小细胞聚集的Lgr5-GFP小肠干细胞被周围分化细胞包围的模式，与体内下方富含干细胞的陷窝、上方分化细胞的绒毛的模式具有高度的一致性。图2A的结果显示，在基质胶覆盖的细胞培养皿内可以存活的很好，且存在较多的Lgr5-GFP+小肠干细胞。而在胶原蛋白I型覆盖的细胞培养皿中并没有Lgr5-GFP+小肠干细胞存在。
而当发明人将基质胶的厚度从10μm提高至50μm后，通过共聚焦显微镜(Olympus公司FV20002)层扫功能，如图2B所示，无论在哪一层，10μm厚度的基质胶上存活的Lgr5-GFP+小肠干细胞在均只出现一次。相反，在50μm厚度的基质胶上的Lgr5-GFP+小肠干细胞却在不同Z轴上出现了两次，证明了该厚度基质胶上的存活的细胞并不是单一层的。即说明了10μm厚度的基质胶可以很好地支撑小肠干细胞单层细胞，且更厚的基质胶将形成多层细胞，并非是单层的；相反，更薄的基质胶不能更好地支撑细胞生存，使其细胞存活率降低。
(5)随后，如图3A、B、C所示，发明人通过表皮细胞标志物的染色手段进一步确认了根据本发明实施例的二维培养的细胞确实是表皮细胞。具体操作如下：用4％多聚甲醛在室温避光固定15分钟。PBS缓冲液重悬润洗三次后，使用1％Triton放置在4℃层析柜中通透15分钟。随后使用3％BSA和0.1％Triton室温封闭一小时后，加入E-cadherin(BD公司),ZO-1(Thermo公司)和F-actin抗体(Santa-Cruz公司)后4度孵育过夜，PBS润洗三次。使用488-偶联的鼠二抗和DAPI进行室温避光染色孵育一小时，随后使用PBS润洗并封片。之后使用激光共聚焦显微镜(Olympus)进行拍照观察。如图3A、B、C所述，所有的细胞均能被染上E-cadherin、ZO-1、EpCam和F-actin，进一步证明了二维培养的这些细胞确实是表皮细胞，不是其他间充质细胞。最后，发明人通过EpCam染色并利用共聚焦显微镜对样品进行三维重建，进一步确认二维存活的这些细胞确实是单层的，不存在多层细胞叠加的情况(图3D)。
实施例2基于二维系统优化培养条件的应用
按照本发明提供的二维的干细胞培养基在培养干细胞的用途，对本实施例中制备的离体小鼠小肠陷窝进行培养。实施例1中发明人已经可以成功培养并且较好地维持小肠干细胞的干性等，为了提高小肠干细胞比例，发明人利用小分子对培养基进行优化，具体方法如下所述：
(1)通过实施例1的方法，得到均一厚度的基质胶来支撑单层小肠表皮细胞的培养，发明人对盖玻片和载玻片进行化学修饰处理并得到疏水的载玻片和亲水的盖玻片。发明人利用48孔板的盖玻片，首先在预冷的载玻片上滴加1μL的基质胶，再将盖玻片盖在基质胶上，利用其毛细作用，将基质胶压在盖玻片上且其厚度为10μm。将载玻片和盖玻片放置在室温五分钟后，将其浸泡在75％酒精中，将盖玻片轻轻地从载玻片上推离，将基质胶面向上放置在48孔细胞培养板内，待其酒精挥发紫外灭菌后即可使用。
(2)从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠中分离出小肠，将其纵切并用预冷的pH值为7.4的PBS缓冲液洗三遍，以去除食糜，之后用手术刀仔细刮去小肠内壁上的小肠绒毛。将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mM EDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟。用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量小肠陷窝从肠片上脱落到上清中。所获上清用70μm孔径的细胞筛(购于BD公司，货号352350)过滤，以去除残存的小肠绒毛，再经过600rpm转速离心3分钟去除散落的单细胞。离心后的沉淀为较为纯净的小肠陷窝，用于体外培养。
(3)将每200个分离的小肠陷窝与培养基重悬后平铺在已经处理过的10μm厚度的基质胶上。此时的培养基使用含有基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine，10μM的blebbistatin以及所需生长因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1的培养基培养。培养两天后，发明人分别用BENR、BNR、BLR、BNRC和BLRC五种培养基分别培养细胞5天。一部分细胞收集获取细胞的mRNA，另一部分细胞进行流式分选技术分析小肠干细胞GFP的比例。使用预冷的PBS将细胞重悬起来后，离心并收集各个培养条件的细胞，使用RNA提取试剂盒(购于TIAGEN，货号74104)进行RNA提取。经测量RNA无误后，发明人对其进行cDNA反转，得到cDNA文库后，对样品进行各基因的实时荧光定量PCR。图4A所示，虽然撤掉EGF对小肠干细胞的比例有一定程度的降低，但是差异不显著。其次发明人发现BMP的I型受体抑制剂LDN-193189可以很好的代替生长因子Noggin来发挥抑制BMP信号通路的作用。最后，发明人发现CHIR-99021与LDN-193189组合在一起，可以大大的提高干细胞比例，却不影响其他分化细胞的表达水平。发明人对各个培养的细胞用Tryple(购自Invitrogen公司)于37度消化处理二十分钟，将小肠陷窝消化打散为单细胞。所获上清用40μm孔径的细胞筛(购于BD公司，货号352340)过滤，以去除残存的细胞团，使用PI区分活细胞和死细胞，并用流式细胞仪(购自Beckman公司，型号为Moflo)分析Lgr5-GFP+小肠干细胞的比例。如图4B所示，BLRC培养的二维细胞可以得到更高比例的小肠干细胞，且摆脱了EGF和Noggin两个生长因子的限制，大大减少了成分，为之后低成本筛选奠定了基础。
实施例3基于2D培养系统的小鼠陷窝体外染色及活细胞观察
按照本发明提供的二维的干细胞培养基在培养干细胞的用途，对本实施例中二维培养的小肠表皮细胞进行体外染色。发明人利用优化基质胶厚度，优化小分子培养基，将二维培养出来的小肠表皮细胞进行染色观察和分析，具体方法如下所述：
(1)如实施例1所述得到均一厚度的基质胶来支撑单层小肠表皮细胞的培养，发明人对盖玻片和载玻片进行化学修饰处理并得到疏水的载玻片和亲水的盖玻片。发明人利用48孔板的盖玻片，首先在预冷的载玻片上滴加1μL的基质胶，再将盖玻片盖在基质胶上，利用其毛细作用，将基质胶压在盖玻片上且其厚度为10μm。将载玻片和盖玻片放置在室温五分钟后，将其浸泡在75％酒精中，将盖玻片轻轻地从载玻片上推离，将基质胶面向上放置在48孔细胞培养板内，待其酒精挥发紫外灭菌后即可使用。
(2)从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠中分离出小肠，将其纵切并用预冷的pH值为7.4的PBS缓冲液洗三遍，以去除食糜，之后用手术刀仔细刮去小肠内壁上的小肠绒毛。将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mM EDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟。用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量小肠陷窝从肠片上脱落到上清中。所获上清用70μm孔径的细胞筛(购于BD公司，货号352350)过滤，以去除残存的小肠绒毛，再经过600rpm转速离心3分钟去除散落的单细胞。离心后的沉淀为较为纯净的小肠陷窝，用于体外培养。
(3)将每200个分离的小肠陷窝与培养基重悬后平铺在已经处理过的10μm厚度的基质胶上。此时的培养基使用含有基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine，10μM的blebbistatin以及所需生长因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1的培养基(BENR)培养。培养两天后，按照实施例2所述，发明人使用二维培养基，即含10μM的blebbistatin、0.5μM的LDN-193189、2.5μM的CHIR-99021和1ug/mL的R-spondin 1的基础培养基。之后，每两天更换一次培养基即可。
(4)对于二维培养7天的小肠单层表皮细胞，发明人进行了陷窝区域、干细胞、分化细胞和凋亡细胞等的染色论证这些表皮细胞的分化细胞是正常的。发明人用4％多聚甲醛在室温避光固定15分钟。PBS缓冲液重悬润洗三次后，使用1％Triton放置在4℃层析柜中通透15分钟。随后使用3％BSA和0.1％Triton室温封闭一小时后，加入EphB2(BD公司)、Ki67抗体(Abcam公司)、Lyz抗体(eBioscience公司)、Muc2抗体(Santa-Cruz公司)、Chga抗体(Santa-Cruz公司)和TUNEL抗体(Roche公司)后4度孵育过夜，PBS润洗三次。使用488-偶联的鼠二抗、561-偶联的兔二抗、647-偶联的羊二抗和DAPI进行室温避光染色孵育一小时，随后使用PBS润洗并封片。之后使用激光共聚焦显微镜(Olympus公司FV2000)进行拍照观察。图5A所示，Lgr5-GFP+小肠干细胞是处于小肠陷窝区域，可用EphB2标志物染色。通过明场可以明显观察到潘氏细胞，并发现Lgr5-GFP+小肠干细胞和潘氏细胞间隔紧密存在，进一步论证了潘氏细胞为干细胞的存活提供了生存的微环境。从图5B可以看出，通过标记增殖细胞的标志物Ki67、潘氏细胞的标志物Lyz、杯状细胞的标志物Muc2、肠内分泌细胞的标志物ChgA和凋亡细胞的标志物TUNEL，发明人发现2D系统培养的单层表皮细胞中的细胞增殖和分化细胞与体内小肠表皮细胞相似。与此同时，发明人还观察到细胞凋亡仅出现在单层细胞群的边界处，与体内凋亡仅发生在绒毛顶端相同(图5B)。通过此方法，可以进行小分子或药物筛选来直观的观察细胞的变化。
(5)发明人对于二维培养7天的小肠单层表皮细胞，可以进行mito-Tracker等染料的染色，在二维上实时活体观察小肠干细胞和分化细胞等的的差异。同时，发明人可以使用各干细胞或分化细胞标志小鼠来进行体外诱导追踪，来实时观察小肠细胞的命运决定和分化谱系追踪等。
实施例4验证二维培养的干细胞性质是否正常
发明人将根据本发明实施例1的2D培养体系的小肠上皮细胞的Lgr5-GFP+干细胞分选出来之后，提取了其总mRNA，使用实时荧光定量PCR检测了各个细胞类型标志基因、Wnt信号通路和BMP信号通路的表达情况，使用GAPDH作为内参，结果如图6A所示，在二维和三维培养的干细胞中，干细胞基因Lgr5、各个分化细胞标志基因(Alpi、Muc2、Chga和Lyz)、Wnt信号通路靶基因(Axin2、c-myc、CCND1、CCND2、EphB2和CD44)和BMP信号通路靶基因(ID1和ID2)的表达水平没有明显差别。培养了7天之后，流式分析的结果显示二维培养的Lgr5-GFP+干细胞的比例高于三维ENR培养的类器官(图6B)。发明人又将三维培养的小肠类器官和二维培养的单层肠上皮细胞中的Lgr5-GFP+干细胞分选出来进行了单细胞克隆实验，结果如图7A和7B所示，两者的克隆形成能力相同。这些实验结果表明，2D培养体系可以维持小鼠小肠干细胞的干性。最后，发明人检测二维培养的小肠干细胞是否可以定向分化为特定的分化细胞。使用2μM的IWP-2和10μM的DAPT在基础培养基(ENR)的条件下培养二维细胞5天后，如图7C所示，发明人发现抑制Wnt和Notch信号通路可以显著诱导细胞向杯状细胞分化，统计分析(图7D)和基因水平(图7E)的分析也同样得到了相同的实验结果。
实施例5基于2D培养系统APC突变小鼠小肠polys的培养
按照本发明提供的二维的干细胞培养基在培养干细胞的用途，对本实施例中制备的离体小鼠小肠陷窝进行培养。利用小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞三维体外培养为小肠类器官技术，构建了小肠表皮细胞的2D培养体系。发明人利用根据本发明实施例的二维培养体系，对APC突变小鼠的小肠polys进行培养，具体操作步骤如下：
(1)将外科手术截取的APC突变小鼠小肠肠段迅速置于预冷的pH值为7.4的PBS缓冲液中，漂洗三遍以去除食糜和血迹。在肠断中寻找发生病变的肠上皮组织，即肉眼可视的polys，并通过机械手段将其与包括脂肪和肌肉层在内的其他组织分离。之后用手术刀仔细轻轻刮去肠内壁上的肠绒毛。将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mM EDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟。用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量polys地肠陷窝从肠片上脱落到上清中。再经过600rpm转速离心3分钟去除散落的单细胞。离心后的沉淀为较为纯净的肠陷窝，可用于体外培养。
(2)将每200个分离的小肠陷窝与培养基重悬后平铺在已经处理过的10μm厚度的基质胶上。此时的培养基使用含有基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX和1mM的N-acetylcysteine，10μM的blebbistatin以及所需生长因子：50ng/mL的EGF、100ng/mL的Noggin和1ug/mL的R-spondin 1的培养基(BENR)培养。培养两天后，按照实施例2所述，发明人使用二维培养基，即含10μM的blebbistatin、0.5μM的LDN-193189、2.5μM的CHIR-99021和1ug/mL的R-spondin 1的基础培养基。之后，每两天更换一次培养基即可。
(3)其次，发明人对培养的表皮细胞进行染色，用4％多聚甲醛在室温避光固定15分钟。PBS缓冲液重悬润洗三次后，使用1％Triton放置在4℃层析柜中通透15分钟。随后使用3％BSA和0.1％Triton室温封闭一小时后，加入EphB2(BD公司)和E-cadherin抗体(BD公司)后4度孵育过夜，PBS润洗三次。使用488-偶联的鼠二抗、561-偶联的兔二抗和DAPI进行室温避光染色孵育一小时，随后使用PBS润洗并封片。之后使用激光共聚焦显微镜(Olympus公司FV2000)进行拍照观察。图3C所示，所有的细胞都可以被E-cadherin染色成功，说明所有的细胞都是表皮细胞，且均可以被EphB2标志物染色。说明这些表皮细胞都是Wnt信号高的细胞且类似于陷窝的状态。在上述培养体系的建立下，发明人可以更为轻易的从二维上进行药物的筛选。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (23)

1.一种培养系统，其特征在于，所述培养系统用于单层细胞培养，所述培养系统包括：基质胶、N2、B27、双抗、0.5-10mM GlutaMAX、0.2-5mM N-acetylcysteine、100-1000ng/mLR-spondin 1、2-10μM Blebbistatin以及基础培养基，
所述培养系统进一步包括Noggin以及LDN-193189的至少之一；所述Noggin的浓度为5-200ng/mL；所述LDN-193189的浓度为0.1-2μM，
其中，所述基质胶的厚度均一为10μm。
2.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12。
3.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述细胞为干细胞或表皮细胞。
4.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述细胞为肠干细胞或肠表皮细胞或胃干细胞或胃表皮细胞。
5.根据要求要求4所述的培养系统，其特征在于，所述细胞为肠干细胞。
6.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述GlutaMAX的浓度为2mM。
7.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述N-acetylcysteine的浓度为1mM。
8.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述R-spondin 1的浓度为1μg/mL。
9.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述Blebbistatin的浓度为10μM。
10.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述培养系统进一步包括EGF，所述EGF的浓度为5-100ng/mL。
11.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述EGF的浓度为50ng/mL。
12.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述Noggin的浓度为100ng/mL；所述LDN-193189的浓度为0.5μM。
13.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述培养系统进一步包括LDN-193189和/或GSK3抑制剂；所述LDN-193189的浓度为0.1-2μM。
14.根据权利要求13所述的培养系统，其特征在于，所述LDN-193189的浓度为0.5μM。
15.根据权利要求13所述的培养系统，其特征在于，所述GSK3抑制剂为CHIR-99021或LY2090314。
16.根据权利要求15所述的培养系统，其特征在于，所述CHIR-99021的浓度为1-10μM。
17.根据权利要求16所述的培养系统，其特征在于，所述CHIR-99021的浓度为2.5μM。
18.一种培养系统，其特征在于，所述培养系统包括：基质胶、Advanced DMEM/F12、N2、B27、双抗、2mM 的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine、500ng/mL的R-spondin 1、10μM 的Blebbistatin、0.5 μM的LDN-193189、2.5μM CHIR-99021；其中，所述基质胶的厚度均一为10μm。
19.一种单层细胞培养的方法，其特征在于，包括：
将初始培养样本在权利要求1~18任一项所述的培养系统中进行培养，所述培养系统中的基质胶预先平铺在培养器皿中。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述细胞为干细胞或表皮细胞。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述细胞为肠干细胞或肠表皮细胞或胃干细胞或胃表皮细胞。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述初始培养样本为小肠陷窝。
23.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述培养器皿为细胞培养板，所述细胞培养板中设置有载玻片，所述基质胶预先平铺在所述细胞培养板中的载玻片上；
预先将所述载玻片进行脱水处理；
所述脱水处理是通过OTS化学修饰进行的；
所述平铺在所述细胞培养板中的载玻片上是通过如下方式进行的：
向所述载玻片上滴加所述基质胶，再盖上盖玻片，所述盖玻片预先通过TMSPMA进行化学修饰，所述基质胶的厚度为10μm；以及
将所述盖玻片移除，以便获得平铺有所述基质胶的载玻片；
所述培养是在温度为37摄氏度、5%二氧化碳的条件下中进行的。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109679893A (zh) * 2019-01-17 2019-04-26 浙江工商大学 基于小鼠肠道干细胞的肠上皮单层培养及表征方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102940631A (zh) * 2012-11-02 2013-02-27 清华大学 Blebbistatin在促进干细胞存活和维持干细胞干性中的应用
CN106153891A (zh) * 2015-04-09 2016-11-23 清华大学 三维生物标志物检测装置、制备方法及检测生物标志物的方法
WO2018038042A1 (ja) * 2016-08-24 2018-03-01 学校法人慶應義塾 ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２ｄオルガノイド及びその使用
CN108085296A (zh) * 2018-01-29 2018-05-29 清华大学 培养基及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013152120A2 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for promoting intestinal stem cell function
US10426757B2 (en) * 2014-05-29 2019-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for promoting intestinal stem cell and/or non-stem progenitor cell function

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102940631A (zh) * 2012-11-02 2013-02-27 清华大学 Blebbistatin在促进干细胞存活和维持干细胞干性中的应用
CN106153891A (zh) * 2015-04-09 2016-11-23 清华大学 三维生物标志物检测装置、制备方法及检测生物标志物的方法
WO2018038042A1 (ja) * 2016-08-24 2018-03-01 学校法人慶應義塾 ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２ｄオルガノイド及びその使用
CN108085296A (zh) * 2018-01-29 2018-05-29 清华大学 培养基及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Curtis A. Thorne等.Enteroid Monolayers Reveal an Autonomous WNT.《Developmental Cell》.2018,第44卷(第5期),第627页右栏第2段，第631页右栏第3段，第e2-e3页隐窝分离和肠样培养部分，. *
Enteroid Monolayers Reveal an Autonomous WNT;Curtis A. Thorne等;《Developmental Cell》;20180312;第44卷(第5期);第627页右栏第2段，第631页右栏第3段，第e2-e3页隐窝分离和肠样培养部分 *

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