CN102940631A - Blebbistatin在促进干细胞存活和维持干细胞干性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Blebbistatin在制备药物中的用途、药物组合物、用于治疗或者预防脱发的药物、个人护理组合物、干细胞培养基、该干细胞培养基在培养干细胞中的用途。其中，含有Blebbistatin的药物用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一。

Description

Blebbistatin在促进干细胞存活和维持干细胞干性中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体的，本发明涉及Blebbistatin在促进干细胞存活和维持干细胞干性中的应用，更具体的，本发明涉及Blebbistatin在制备药物中的用途、药物组合物、用于治疗或者预防脱发的药物、个人护理组合物、干细胞培养基、该干细胞培养基在培养干细胞中的用途。

背景技术

在胎儿、儿童和成人组织中存在的具有自我更新、多向分化潜能的细胞称为成体干细胞。体内许多组织和器官具有修复和再生的能力，成体干细胞在其中起着关键的作用，如造血干细胞可分化成白细胞、红细胞和血小板，皮肤干细胞可形成各种不同类型的皮肤细胞。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞相对于胚胎干细胞更适用于临床医学治疗，因为成体干细胞可从患者本人体内方便获取，且源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在免疫排斥及伦理道德问题。近年来，利用成体干细胞治疗相关退行性疾病的再生医学正飞速发展，其必将成为未来医学发展的主要方向。

然而，目前关于干细胞的研究仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人意外发现，通过在培养干细胞的过程中，使干细胞接触Blebbistatin，可以有效地促进干细胞存活，同时也能够维持干细胞的干性。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了Blebbistatin在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一。发明人发现，Blebbistatin具有干细胞存活和维持干细胞干性的功能，从而利用采用Blebbistatin作为活性成份的药物，能够有效地干细胞存活和维持干细胞干性。根据本发明的实施例，可以采用Blebbistatin进行处理的干细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞。根据本发明的实施例，优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，根据本发明的实施例，更优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述药物用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。由此，利用Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞和小肠成体干细胞存活和维持这些干细胞干性，从而可以有效地用于由于这些干细胞受损而造成的疾病，例如脱发或者相关肠道疾病。

根据本发明的实施例，利用Blebbistatin进行制备药物的方法，并不受特别限制，可以将Blebbistatin掺入适合于给受试者施用的药物组合物内，以便得到适于给药的剂型。一般地，药物组合物包含Blebbistatin和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强结合蛋白的保存期限或效力。可以采用各种已知的递送系统，并且可以有效地用于施用Blebbistatin或Blebbistatin与其他药物的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如治疗脱发。例如，被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达SNX11的表达载体和重组细胞、受体介导的胞吞（参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432（1987））、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸构建等。

另外，根据本发明的实施例，施用所制备的药物的手段也不受特别限制，例如肠胃外施用（例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下），硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用（例如，鼻内和经口途径）。在具体实施方案中，本发明的药物可以通过肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。所制备的药物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。

在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶膜、聚合物、纤维基质（例如，）、或胶原基质。

由此，在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物组合物，其特征在于，包含：Blebbistatin作为活性成份；以及药物上可以接受的载体。如前所述，Blebbistatin能够用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一。根据本发明的实施例，可以采用Blebbistatin进行处理的干细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞。根据本发明的实施例，优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，根据本发明的实施例，更优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述药物用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。由此，利用Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞和小肠成体干细胞存活和维持这些干细胞干性，从而可以有效地用于由于这些干细胞受损而造成的疾病，例如脱发或者相关肠道疾病。

另外，利用根据本发明实施例的药物，还可以用于治疗下列至少之一造血障碍性疾病，神经退行性疾病，脱发，急性肠损伤，肌肉萎缩和乳腺发育不良。针对所治疗的疾病，可以选择适当的剂型，通过适当的给药路线为需要治疗的患者例如人提供根据本发明实施例的药物。例如对于皮肤相关疾病，可以采用透皮给药路线，例如采用贴剂。另外，前面所描述的优点和特征，也当然地适用于本发明实施例的药物，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于治疗或者预防脱发的药物。根据本发明的实施例，该药物包含Blebbistatin作为活性成份。如前所述，利用Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞的存活和干性的维持，从而可以有效地用于治疗脱发，根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的药物治疗的脱发类型包括但不限于选自下列的至少之一：雄性激素源性脱发、脂溢性脱发、外伤及感染性脱发、精神性脱发、内分泌失调性脱发、营养代谢性脱发及物理化学性脱发、症状性脱发。

另外在本发明的第四方面，根据本发明的实施例，本发明还提出了一种个人护理组合物，其特征在于，包含Blebbistatin。该个人护理组合物制备简单，只需要在常规个人护理产品中添加Blebbistatin即可。添加量也不受特别限制，根据本发明的实施例，在所述个人护理组合物中，Blebbistatin的浓度可以通过梯度实验确定，例如可以为0.001重量%~1重量%。根据本发明的实施例，其中个人护理组合物选自以下组中：身体清洗剂、淋浴凝胶、液体皂、棒状肥皂、润肤液、护肤霜、淋浴后护肤水、浴后洁肤水、剃须活性物、剃须后护肤品、除臭产品、止汗产品、皮肤清洁擦拭物、皮肤冷却擦拭物、皮肤调理擦拭物、皮肤药物输送产品、驱虫产品、防晒品、皮肤晒黑产品、皮肤着色产品、皮肤化妆产品、眼部护理产品、口红产品、洗发剂、调理剂、调理洗发剂、头发定型产品、染发产品、生发产品、脱毛产品。由此，可以在日常的个人护理中，摄入Blebbistatin，从而实现了治疗或预防脱发的效果。

在本发明的第五方面，本发明还提出了一种干细胞培养基。根据本发明的实施例，该干细胞培养基包含：基础培养基，所述基础培养基适于干细胞生成；以及blebbistatin。由此，利用该干细胞培养基，能够有效地用于促进干细胞存活和维护干细胞干性。根据本发明的实施例，基础培养基的类型并不受特别限制，可以为现有的任意培养基，优选地，所述基础培养基为选自下列的至少之一：Advanced DMEM/F12培养基,DK-SFM培养基，AIM V培养基，Neurobasal培养基，DMEM培养基，MEM培养基。根据本发明的实施例，优选地，进一步含有R-spondin1，优选地，进一步含有选自选自EGF、noggin、和wnt3a的至少一种，优选地，按照重量百分比，所述干细胞培养基培养基含有：5-100ng/ml终浓度的EGF、5-200ng/ml终浓度的noggin、100-1000ng/ml终浓度的R-spondin1和5-200ng/ml终浓度的wnt3a。由此，可以进一步提高利用根据本发明的实施例的干细胞培养基培养干细胞的效率。

在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的干细胞培养基在培养干细胞的用途。发明人发现，Blebbistatin具有干细胞存活和维持干细胞干性的功能，从而利用采用Blebbistatin作为活性成份的培养基，能够有效地干细胞存活和维持干细胞干性。根据本发明的实施例，可以采用Blebbistatin进行处理的干细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞。根据本发明的实施例，优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，根据本发明的实施例，更优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述药物用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。由此，利用该培养基，可以有效地培养干细胞，并进一步可以用于在分化条件下，得到相应的分化细胞。

成年小鼠的肠上皮持续进行着快速的更新过程，在正常生理状态下，全部肠上皮细胞被新生细胞取代只需要2-3天时间。Lgr5+的小肠成体干细胞存在于小肠腺窝的最底部，负责维持小肠上皮的日常更新过程。这类成体干细胞分裂极其活跃，在维持自我更新的同时，可以逐渐分化为各种类型的小肠上皮功能细胞，如潘氏细胞，杯状细胞等。现阶段，调控Lgr5+小肠成体干细胞自我更新和分化过程的具体机制还非常不清楚。深入了解Lgr5+小肠成体干细胞将为临床治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病提供厚实的科研基础。

离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞培养为小肠类器官的体外培养技术的建立极大促进了Lgr5+小肠成体干细胞的相关研究（Sato,T.et al.(2009).“Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without amesenchymal niche.”Nature 459,262-5）。且最新研究成果直接证明了同种方法培育的肠类器官可以有效修复小鼠体内急性肠炎导致的肠损伤，为通过再生医学治疗肠相关疾病提供了新的希望（Yui,S.et al.(2012).“Functionalengraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+)stemcell.”Nat Med 18,618-23）。进一步改进上述体外培养技术，及利用此种培养技术寻求有效改善Lgr5+小肠成体干细胞活性的药物，对推进肠再生医学的临床应用具有重大意义。

由此，根据本发明的实施例，本发明提出了含有blebbistatin的培养基在改进离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞培养为小肠类器官的体外培养技术和通过激活Lgr5+小肠成体干细胞来治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病中的应用。

根据本发明的实施例，本发明提出了含有blebbistatin的培养基在有效提升离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞的存活率，同时加速小肠类器官的体外生长中的应用，另外，blebbistatin可取代传统培养方式中EGF和noggin两种生长因子，在体外长期维持小肠类器官中的应用。

根据本发明的实施例，本发明提出了含有blebbistatin的培养基在通过激活Lgr5+小肠成体干细胞来治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病中的应用，即blebbistatin对Lgr5+小肠成体干细胞的激活作用在修复肠道损伤和治疗肠上皮再生障碍性疾病中的应用。

根据本发明的实施例，发明人发现含有blebbistatin的培养基的激活作用为blebbistatin通过诱导Lgr5+小肠成体干细胞中Akt蛋白的磷酸化，进而促进干性基因Lgr5和Ascl2的表达，从而实现其对Lgr5+小肠成体干细胞存活和干性的重大促进作用。

由此，本发明通过实验发现小分子药物blebbistatin可以有效提升离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞的存活率，同时加速小肠类器官的体外生长，并可取代传统培养方式中EGF和noggin两种生长因子，在体外长期维持小肠类器官，为常规化培养小肠类器官，并将其应用于医学科学研究和临床肠再生医疗提供了重要技术手段。应用blebbistatin激活Lgr5+小肠成体干细胞，可促进Lgr5+小肠成体干细胞存活并自我更新，为通过肠再生医学手段有效修复肠道损伤和治疗肠上皮再生障碍性疾病提供了重要的药物基础。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施例，blebbistatin有效提升离体小鼠小肠陷窝和小鼠Lgr5+小肠成体干细胞的存活率，同时加速小鼠小肠类器官的体外生长；

图2显示了根据本发明的一个实施例，blebbistatin有效促进离体人小肠陷窝和人大肠陷窝的存活；

图3显示了根据本发明的一个实施例，blebbistatin可取代EGF和noggin两种生长因子，在体外长期维持小肠类器官；以及

图4显示了根据本发明的一个实施例，blebbistatin激活Lgr5+小肠成体干细胞，并促进其存活和自我更新。

发明详细描述

本文中“Blebbistatin”化学名为3a-羟基-6-甲基-1-苯基-1,2,3,3a-四氢-吡咯并[2,3-b]-喹啉-4-酮（CAS No:674289-55-5），它是针对肌球蛋白Ⅱ的一类选择性、细胞渗透性抑制剂。它能够在微摩尔级的浓度范围内抑制骨骼肌肌球蛋白Ⅱ和非骨骼肌肌球蛋白ⅡA和ⅡB的ATP酶活性，但不抑制肌球蛋白Ⅰ、Ⅴ、Ⅹ。它还可以抑制骨骼肌肌球蛋白Ⅱ和非骨骼肌肌球蛋白Ⅱ体外与肌动蛋白丝结合的能力。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人意外发现，通过在培养干细胞的过程中，使干细胞接触Blebbistatin，可以有效地促进干细胞存活，同时也能够维持干细胞的干性。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了Blebbistatin在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一。发明人意外发现，Blebbistatin具有促进干细胞存活和维持干细胞干性的功能，从而利用Blebbistatin作为活性成份制备药物，用于促进干细胞存活和维持干细胞干性。根据本发明的实施例，可以采用Blebbistatin进行处理的干细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞。根据本发明的实施例，优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，根据本发明的实施例，更优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述药物用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。由此，利用Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞和小肠成体干细胞存活和维持这些干细胞干性，从而可以有效地用于由于这些干细胞受损而造成的疾病，例如脱发或者相关肠道疾病。根据本发明的实施例，利用Blebbistatin进行制备药物的方法，并不受特别限制，可以将Blebbistatin掺入适合于给受试者施用的药物组合物内，以便得到适于给药的剂型。一般地，药物组合物包含Blebbistatin和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强结合蛋白的保存期限或效力。可以采用各种已知的递送系统，并且可以有效地用于施用Blebbistatin或Blebbistatin与其他药物的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如治疗脱发。例如，被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达SNX11的表达载体和重组细胞、受体介导的胞吞（参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432（1987））、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸构建等等。

另外，根据本发明的实施例，施用所制备的药物的手段也不受特别限制，例如肠胃外施用（例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下），硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用（例如，鼻内和经口途径）。在具体实施方案中，本发明的药物可以通过肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。所制备的药物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里（例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等）吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。

在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶膜、聚合物、纤维基质（例如，

）、或胶原基质。

由此，在本发明的第二方面，本发明提出了一种药物组合物，其特征在于，包含：Blebbistatin作为活性成份；以及药物上可以接受的载体。如前所述，Blebbistatin能够用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一。根据本发明的实施例，可以采用Blebbistatin进行处理的干细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞。根据本发明的实施例，优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，根据本发明的实施例，更优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述Blebbistatin用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。由此，利用Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞和小肠成体干细胞存活和维持这些干细胞干性，从而可以有效地用于由于这些干细胞受损而造成的疾病，例如脱发或者相关肠道疾病。

另外，利用根据本发明实施例的药物，还可以用于治疗下列至少之一：造血障碍性疾病，神经退行性疾病，脱发，急性肠损伤，肌肉萎缩和乳腺发育不良。针对所治疗的疾病，可以选择适当的剂型，通过适当的给药路线为需要治疗的患者例如人提供根据本发明实施例的药物。例如对于皮肤相关疾病，可以采用透皮给药路线，例如采用贴剂。本领域技术人员可以理解的是，利用本发明实施例提供的药物组合物中活性成份Blebbistatin的含量可以根据治疗疾病的种类和难易程度设计梯度试验来确定。另外，前面所描述的优点和特征，也当然地适用于本发明实施例的药物，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于治疗或者预防脱发的药物。根据本发明的实施例，该药物包含Blebbistatin作为活性成份。如前所述，利用Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞的存活和干性的维持，从而可以有效地用于治疗脱发。皮肤的表皮细胞是持续更新的，但是毛发的生长却是周期性的，一般其生长周期可分为生长期、退行期和休止期。研究表明，新毛发是由Lgr5+毛囊干细胞在生长期不断分裂、生长、分化形成的，由于Lgr5+毛囊干细胞干性降低甚至死亡导致脱发。Blebbistatin可以有效地促进毛囊干细胞存活，同时也能够维持干细胞的干性。因此本发明提供了一种将Blebbistatin作为活性成份的药物用来治疗脱发。根据本发明的实施例，可以利用根据本发明的实施例的药物治疗的脱发类型包括但不限于选自下列的至少之一：雄性激素源性脱发、脂溢性脱发、外伤及感染性脱发、精神性脱发、内分泌失调性脱发、营养代谢性脱发及物理化学性脱发、症状性脱发。根据本发明的实施例，本领域技术人员可以理解的是，含有Blebbistatin作为活性成份药物可以制备成任意药物剂型，包括外用制剂或者口服制剂。例如可以制备成适于头部使用的涂抹剂、软豪剂、糊剂、贴剂等，或者可以制备成溶液剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、散剂、冲剂、片剂、丸剂、胶襄剂等。更具体的，本领域技术人员可以根据制备成不同药物剂型的需要，选择适宜的辅料，例如可以选择为十八醇、二甲基硅油、植物油、氢化植物油、凡士林、石蜡、羊毛脂、胆固醇、蜂蜡、硬脂酸、十六醇（即鲸蜡醇）、十二烷基硫酸钠、单硬脂酸甘油酯、吐温、卖泽52、司盘、蜂蜡、甘油单硬脂酸酯、羊毛醇、甘油明胶、淀粉甘油、海藻酸钠、聚乙二醇、甲基纤维素、CMC-Na、卡波普等的一种或几种混合。本领域技术人员可以理解的是，针对制备成不同剂型的药物，Blebbistatin与辅料的比例是可以采用梯度试验确定，例如每单位计量含Blebbistatin为克，并且根据能够达到Blebbistatin的有效血药浓度的剂量确定每次的给药量。

另外在本发明的第四方面，根据本发明的实施例，本发明还提出了一种个人护理组合物，其特征在于，包含Blebbistatin。该个人护理组合物制备简单，只需要在常规个人护理产品中添加Blebbistatin即可，也可以根据Blebbistatin的理化性质，筛选添加对有助于Blebbistatin活性发挥或者对其活性影响较小的辅料或者添加剂，制备成相应的个人护理组合物。Blebbistatin的添加量不受特别限制，根据本发明的实施例，在所述个人护理组合物中，Blebbistatin的浓度可以通过梯度实验确定，例如可以为0.001重量%~1重量%。根据本发明的实施例，其中个人护理组合物选自以下组中：身体清洗剂、淋浴凝胶、液体皂、棒状肥皂、润肤液、护肤霜、淋浴后护肤水、浴后洁肤水、剃须活性物、剃须后护肤品、除臭产品、止汗产品、皮肤清洁擦拭物、皮肤冷却擦拭物、皮肤调理擦拭物、皮肤药物输送产品、驱虫产品、防晒品、皮肤晒黑产品、皮肤着色产品、皮肤化妆产品、眼部护理产品、口红产品、洗发剂、调理剂、调理洗发剂、头发定型产品、染发产品、生发产品、脱毛产品。由此，可以在日常的个人护理中，逐渐缓慢地摄入Blebbistatin，从而实现了治疗或预防脱发的效果。

在本发明的第五方面，本发明还提出了一种干细胞培养基。根据本发明的实施例，该干细胞培养基包含：基础培养基和blebbistatin，其中基础培养基适于干细胞生成。培养基中含有的blebbistatin与干细胞接触，可以有效地促进干细胞存活，同时也能够维持干细胞的干性。由此，利用本发明提供的含有blebbistatin干细胞培养基，能够有效地用于促进干细胞存活和维护干细胞干性。根据本发明的实施例，培养基中含有的blebbistatin的量并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，依照培养的干细胞种类和培养难易程度，以及blebbistatin的量与促进肝细胞存活之间的制衡关系，或者包括本领域技术人员可以理解的在筛选blebbistatin的量的试验过程中遇到的其它因素，设计梯度试验或者影响因素试验筛选加入blebbistatin的量。由此，可以最大限度的提高干细胞培养基的质量，进而进一步提高利用根据本发明的实施例的干细胞培养基培养干细胞的效率和干细胞的质量。根据本发明的实施例，基础培养基的类型并不受特别限制，可以为现有的任意培养基，优选地，所述基础培养基为选自下列的至少之一：Advanced DMEM/F12培养基，DK-SFM培养基，AIM V培养基，Neurobasal培养基，DMEM培养基，MEM培养基。根据本发明的实施例，优选地，进一步含有R-spondin1。优选地，进一步含有选自选自EGF、noggin、和wnt3a的至少一种，优选地，按照重量百分比，所述干细胞培养基含有：5-100ng/ml终浓度的EGF、5-200ng/ml终浓度的noggin、100-1000ng/ml终浓度的R-spondin1和5-200ng/ml终浓度的wnt3a。

另外根据本发明的实施例，也可以根据blebbistatin的理化性质制备含有上述成份的基础培养基，目的在于根据本实施例制备的干细胞培养基能过最大程度的提高干细胞的培养效率和质量。

由此，可以进一步提高利用根据本发明的实施例的干细胞培养基培养干细胞的效率。

在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的干细胞培养基在培养干细胞的用途。发明人发现，Blebbistatin具有干细胞存活和维持干细胞干性的功能，从而利用采用Blebbistatin作为活性成份的培养基，能够有效地促进干细胞存活和维持干细胞干性。根据本发明的实施例，可以采用Blebbistatin进行处理的干细胞的类型并不受特别限制，根据本发明的实施例，干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞。根据本发明的实施例，优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，根据本发明的实施例，更优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述blebbistatin用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。由此，利用该培养基，可以有效地培养干细胞，并进一步可以用于在分化条件下，得到相应的分化细胞。

根据本发明的实施例，所述的干细胞培养基在培养干细胞的用途中优选用于培养Lgr5+干细胞。

Lgr5+小肠成体干细胞存在于小肠腺窝的最底部，这类成体干细胞分裂极其活跃，在维持自我更新的同时，可以逐渐分化为各种类型的小肠上皮功能细胞，如潘氏细胞，杯状细胞等，因此Lgr5+小肠成体干细胞负责维持小肠上皮的日常更新过程。现阶段，调控Lgr5+小肠成体干细胞自我更新和分化过程的具体机制还非常不清楚。深入了解Lgr5+小肠成体干细胞将为临床治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病提供厚实的科研基础。

离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞体外培养技术的建立，极大促进了Lgr5+小肠成体干细胞的相关研究（Sato,T.et al.(2009).“Single Lgr5 stem cellsbuild crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.”Nature 459,262-5）。且最新研究成果表明采用体外培养技术培育的肠类器官可以有效修复小鼠体内急性肠炎导致的肠损伤，为通过再生医学治疗肠相关疾病提供了新的希望（Yui,S.et al.(2012).“Functional engraftment of colon epithelium expanded invitro from a single adult Lgr5(+)stem cell.”Nat Med 18,618-23）。但Lgr5+小肠成体干细胞体外培养技术还存在不足，进一步改进上述体外培养技术，及利用此种培养技术寻求有效改善Lgr5+小肠成体干细胞活性的药物，对推进肠再生医学的临床应用具有重大意义。

由此，根据本发明的实施例，本发明提出了含有blebbistatin的培养基在改进离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞培养为小肠类器官的体外培养技术中的应用和通过激活Lgr5+小肠成体干细胞来治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病中的应用。由此，可以促进小肠类器官体外培养技术的成熟，实现利用肠再生医学手段有效修复肠道损伤，进一步推进肠再生医学在的临床上的应用。根据本发明的实施例，本发明提出了含有blebbistatin的培养基在有效提升离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞的存活率，同时加速小肠类器官的体外生长中的应用，另外，培养基中的blebbistatin可取代传统培养方式中EGF和noggin两种生长因子，在体外长期维持小肠类器官中的应用。由此，可以促进小肠类器官体外培养技术的成熟，为进一步推进肠再生医学在治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病中的应用。

根据本发明的实施例，本发明提出了含有blebbistatin的培养基在通过激活Lgr5+小肠成体干细胞来治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病中的应用，即blebbistatin对Lgr5+小肠成体干细胞的激活作用在修复肠道损伤和治疗肠上皮再生障碍性疾病中的应用。根据本发明的实施例，发明人发现含有blebbistatin的培养基的激活作用为blebbistatin通过诱导Lgr5+小肠成体干细胞中Akt蛋白的磷酸化，进而促进干性基因Lgr5和Ascl2的表达，从而实现其对Lgr5+小肠成体干细胞存活和干性的重大促进作用。

由此，本发明通过实验发现小分子药物blebbistatin可以有效提升离体小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞的存活率，同时加速小肠类器官的体外生长，并可取代传统培养方式中EGF和noggin两种生长因子，在体外长期维持小肠类器官，为常规化培养小肠类器官，并将其应用于医学科学研究和临床肠再生医疗提供了重要技术手段。应用blebbistatin激活Lgr5+小肠成体干细胞，可促进Lgr5+小肠成体干细胞存活并自我更新，为通过肠再生医学手段有效修复肠道损伤和治疗肠上皮再生障碍性疾病提供了重要的药物基础。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面的实施例，仅仅是为了说明本发明，而不以任何方式限制本发明。另外，在下面实施例中所采用的试剂和材料也均是市售可得的，如果未明确说明，则所采用的方法和条件，也均按照公知的方法和条件进行相关处理。

实施例1

按照本发明提供的含有Blebbistatin的干细胞培养基在培养干细胞的用途，对本实施例中制备的离体小鼠小肠陷窝和小鼠Lgr5+小肠成体干细胞进行培养。利用小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞体外培养为小肠类器官技术，探讨了小分子药物blebbistatin在此培养过程中的作用。按照文献（Sato,T.et al.(2009).“Single Lgr5stem cells build crypt-villus structures in vitro without amesenchymal niche.”Nature 459,262-5，通过参照将其并入本文）报道的方法，从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠（可通过The Jackson Laboratory组织购得，StockNumber:008875，其特点描述：将绿色荧光蛋白基因GFP人工插入到内源Lgr5基因的启动子下游，故此转基因小鼠中表达Lgr5基因的细胞均被绿色荧光蛋白GFP标记，可用于追踪Lgr5阳性的成体干细胞）中分离并培养小肠陷窝和Lgr5+小肠成体干细胞，观察blebbistatin对体外培养存活率和生长速度的影响，具体方法如下所述：

1、从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠中分离出小肠，将其纵切并用预冷的pH值为7.4的PBS缓冲液洗三遍，以去除食糜，之后用手术刀仔细刮去小肠内壁上的小肠绒毛。将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mM EDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟。用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量小肠陷窝从肠片上脱落到上清中。所获上清用70μm孔径的细胞筛（购于BD公司，货号352350）过滤，以去除残存的小肠绒毛，再经过600rpm转速离心3分钟去除散落的单细胞。离心后的沉淀为较为纯净的小肠陷窝，可用于体外培养以及通过后续处理从中获取Lgr5+小肠成体干细胞。

2、将每100个分离的小肠陷窝与50微升预冷的基质胶（购于BD公司，货号354230）混合均匀后平铺于48孔细胞培养板的一个孔中。将培养板置于室温20分钟，让包裹小肠陷窝的基质胶充分凝固。最后加入250微升含有50ng/ml EGF（购自peprotech公司）、100ng/ml noggin（购自R&D公司）和500ng/ml R-spondin1（购自R&D公司）的小肠基本培养基（具体成分为：Advanced DMEM/F12培养基、青链霉素、GlutaMAX-I,N2,B27和N-乙酰半胱氨酸）。对照组中加入DMSO，实验组加入10μM blebbistatin（购自Calbiochem公司），于二氧化碳细胞培养箱中培养12个小时，用显微镜观察存活的小肠陷窝并计数，实验结果如图1A所示：blebbistatin处理可有效增加离体小肠陷窝在体外培养条件下的存活数量。继续培养至第三天，如图1C所示：对照组中的小肠类器官体积较小，刚开始形成新生陷窝；实验组中的小肠类器官体积明显较大，已经形成数量可观的新生陷窝。证明blebbistatin有效加速了小肠类器官的体外生长。

3、将从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠中分离获得的小肠陷窝用Tryple（购自Invitrogen公司）于37度处理半个小时，再用1.2mm的注射器吹打10次以上，将小肠陷窝消化打散为单细胞。所获上清用40μm孔径的细胞筛（购于BD公司，货号352340）过滤，以去除残存的细胞团，并用流式细胞仪（购自BD公司，型号为FACSAria II)分选得到其中绿色荧光标记的Lgr5+小肠成体干细胞。将每500个分选得到的Lgr5+小肠成体干细胞与50微升预冷并添加1mM jagged-1（购自AnaSpec公司）的基质胶混合均匀后平铺于48孔细胞培养板的一个孔中。基质胶充分凝固后加入250微升含有50ng/ml EGF、100ng/ml noggin、500ng/ml R-spondin1和100ng/ml wnt3a（购自R&D公司）的小肠基本培养基。在分离培养的前48小时，对照组用DMSO处理，实验组用10μM blebbistatin处理，然后撤出刺激，换为新鲜的培养基继续培养至第七天。实验结果如图1B所示：48小时的blebbistatin处理有效的促进了实验组中Lgr5+小肠成体干细胞的存活，表现现象为由存活的Lgr5+小肠成体干细胞形成的小肠类器官数量显著增多。

实验结果表明，blebbistatin能够有效提升离体小鼠小肠陷窝和小鼠Lgr5+小肠成体干细胞的存活率，同时加速小肠类器官的体外生长。

实施例2

按照本发明提供的含有Blebbistatin的干细胞培养基在培养干细胞的用途，对本实施例中制备的离体人小肠陷窝和大肠陷窝进行培养。具体步骤如下：

将外科手术截取的大小肠段迅速置于预冷的pH值为7.4的PBS缓冲液中，漂洗三遍以去除血迹。在肠断中寻找尚未发生病变的正常肠上皮组织，并通过机械手段将其与包括脂肪和肌肉层在内的其他组织分离。之后用手术刀仔细刮去肠内壁上的肠绒毛。将剩余的部分剪切成5mm长度的肠片并用含有10mMEDTA的PBS缓冲液于冰上孵育40分钟。用新鲜预冷的PBS缓冲液换去含有EDTA的PBS缓冲液，在其中用移液器和10ml的移液管剧烈地反复吹打肠片，使大量肠陷窝从肠片上脱落到上清中。所获上清用70μm孔径的细胞筛过滤，以去除残存的肠绒毛，再经过600rpm转速离心3分钟去除散落的单细胞。离心后的沉淀为较为纯净的肠陷窝，可用于体外培养。样本的获取手段和后续科研方案均已通过合作医院伦理委员会审核。

将每100个分离的小肠或大肠陷窝与50微升预冷的基质胶混合均匀后平铺于48孔细胞培养板的一个孔中。基质胶充分凝固后加入250微升含有50ng/ml EGF、100ng/ml noggin、500ng/ml R-spondin1和100ng/ml wnt3a的小肠基本培养基。对照组中加入DMSO，实验组加入10μM blebbistatin，于二氧化碳细胞培养箱中培养24个小时，用显微镜观察存活的小肠或大肠陷窝并计数。结果示于图2中。

如图2所示，实验组中经过blebbistatin处理过的离体人小肠陷窝（图2A）和离体人大肠陷窝（图2B）体外培养的存活的数量明显多于对照组。从具体的数值能够更加明显的显示，对照组中离体人小肠陷窝和离体人大肠陷窝的存活数目均不到10单位，实验组中经过blebbistatin处理过的离体人小肠陷窝和离体人大肠陷窝的存活数目均达到40单位。实验结果表明，blebbistatin能够有效提升离体人小肠陷窝和和离体人大肠陷窝体外培养的存活率。

实施例3

按照本发明提供的干细胞培养基以及干细胞培养基在培养干细胞的用途，将本实施例培养基中EGF和noggin两种生长因子以Blebbistatin取代，在体外长期维持培养小肠类器官生长。具体步骤如下：

将从Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠中分离获得的小肠陷窝与预冷的基质胶混合均匀后平铺于48孔细胞培养板的一个孔中。基质胶充分凝固后加入250微升含有20μM blebbistatin和500ng/ml R-spondin1的小肠基本培养基。于二氧化碳细胞培养箱中培养，每两天一次更新全部培养基。图3A呈现在显微镜下拍摄的第三天（左）和第十天（右）小肠类器官的典型视野。应用新培养技术获得的小肠类器官同样拥有基本的小肠腺窝-小肠绒毛结构。

将上述培养获得的小肠类器官从基质胶中机械分离出来，用4%的多聚甲醛溶液于室温固定一小时，封片后于共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710 NLO激光扫描显微镜)下层扫观察。此小肠类器官来源于Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠，其中的Lgr5+小肠干细胞表达绿色荧光蛋白，在488nm激发光照射下能够产生绿色荧光。图3B是新培养技术获得的小肠类器官中Lgr5+小肠干细胞的分布情况，结果显示小肠类器官中含有数量众多的Lgr5+小肠干细胞，它们间隔排布于小肠类器官中陷窝的底部位置。这种排布方式与传统方式培养的小肠类器官完全相同，验证了新培养技术在体外维持Lgr5+小肠成体干细胞上的可靠性。

我们将此新培养技术应用于无荧光标记的小鼠小肠陷窝，获得小肠类器官，并利用免疫染色技术对其进行进一步检测。具体方法如下所述：将培养获得的小肠类器官从基质胶中机械分离，用4%的多聚甲醛溶液于室温固定一小时，后用含有0.2%Triton X-100的PBS缓冲液于冰上通透20分钟。置于5%BSA溶液中封闭一小时后，用特异性抗体于4度孵育过夜进行免疫杂交，并用相应荧光二抗标记，同时使用DAPI染料对细胞核进行标记，封片后于共聚焦显微镜下观察。图3C（上）使用抗Ki67抗体（购自Abcam公司）和绿色荧光二抗（购自Jackson ImmunoResearch公司）标记了活跃增殖的细胞，结果显示新技术培养下的小肠类器官生长状态良好。图3C（中）使用绿色荧光基团偶连的抗溶菌酶抗体（购自Dakocytomation公司）标记了潘氏细胞。图3C（下）使用抗Mucin2抗体（购自Santa Cruz公司）和绿色荧光二抗标记了杯状细胞。潘氏细胞和杯状细胞均为小肠中两种典型的终末分化细胞，证明培养获得的小肠类器官能够很好地保持小肠上皮特征。这种新的培养方式可以在体外维持小肠类器官达半年以上，而且不丢失上述诸多特性。这些结果表明，blebbistatin可以替代EGF和noggin两种生长因子在体外培养小肠类器官。

按照文献（Sato,T.et al.(2009).“Single Lgr5stem cells build crypt-villusstructures in vitro without a mesenchymal niche.”Nature 459,262-5）报道，现行小肠类器官体外培养技术中，EGF、noggin和R-spondin1三种生长因子缺一不可。使用blebbistatin取代EGF和noggin两种生长因子后，仍能维持小肠类器官的长期体外培养，由此建立了基于小分子blebbistatin的全新小肠类器官体外培养技术。此技术较传统技术相比，简单易行，节约培养成本，将其应用于医学科学研究，能够有效推动小肠类器官体外培养技术的普及，为临床肠再生医疗提供了重要技术手段。

实施例4

根据本发明提供的一种含有Blebbistatin的药物组合物，用于激活实施例1中制备的Lgr5+小肠成体干细胞。具体步骤如下：

首先将实施例1中制备得到的Lgr5+小肠成体干细胞重悬于小肠基本培养液中，对照组加入DMSO，实验组加入10μM blebbistatin，经过处理12小时后离心收取细胞。然后分别对对照组合和实验组中的Lgr5+小肠成体干细胞进行检测，检测指标为Akt磷酸化水平（细胞存活状态的重要指标）和Lgr5、Ascl2基因表达水平（小肠成体干细胞干性的重要指标），检测方法如下：

1、将处理过的Lgr5+小肠成体干细胞用4%的多聚甲醛溶液于室温固定一小时，后用含有0.2% Triton X-100的PBS缓冲液于冰上通透20分钟。置于5%BSA溶液中封闭一小时后，用特异性识别Akt473位丝氨酸磷酸化的抗体（购自Cell Signaling公司）于4度孵育过夜，并用红色荧光二抗标记。涂片后于共聚焦显微镜下观察（图4A）或直接用流式细胞仪分析红色荧光强度（图4B）证明，blebbistatin处理可在Lgr5+小肠成体干细胞中激活Akt，从而促进Lgr5+小肠成体干细胞存活。

2、用RNeasy Mini试剂盒（购自Qiagen公司）提取处理后Lgr5+小肠成体干细胞的总RNA，之后用Revertra Ace反转录酶(购自Toyobo公司)将其反转录为cDNA。用基于Taqman探针技术的实时定量PCR（购自Stratagene公司，型号Mx3000p）检测Lgr5+小肠成体干细胞中Lgr5（Gene ID:14160）和Ascl2（Gene ID:17173）的基因表达水平。所使用的探针试剂盒购自AppliedBiosystems公司，试剂盒ID：Ascl2(Mm01268891_g1)、GAPDH(Mm99999915_g1)、Lgr5(Mm00438890_m1)。

结果如图4C所示，实验组Lgr5+小肠成体干细胞中Lgr5和Ascl2基因的表达量明显高于对照组经过DMSO处理过的基因表达量。实验结果表明，经过blebbistatin处理可增强Lgr5+小肠成体干细胞中Lgr5和Ascl2基因的表达，从而促进Lgr5+小肠成体干细胞的干性。由此，可将Blebbistatin用于激活Lgr5+小肠成体干细胞来治疗肠道损伤和肠上皮再生障碍性疾病。

实施例5

依照本发明提供的一种含有Blebbistatin的治疗或者预防脱发的药物，将其用于本实施例制备的小鼠毛囊干细胞的培养中，观察并分析blebbistatin对小鼠毛囊干细胞在体外培养条件下存活率和干性的影响。具体步骤如下：

1、将Lgr5-EGFP-IRES-creERT2转基因小鼠背部毛发剪去之后，取其背部皮肤置于PBS缓冲液中。将皮肤内侧的皮下组织和脂肪仔细刮除之后，置于0.25%的胰酶溶液中，于32℃消化2小时。胰酶消化之后将皮肤的表皮层刮至SMEM培养基中(购于Invitrogen公司，货号11380-037)，100rpm室温搅拌20分钟。悬浮液用70μm孔径的细胞筛(购于BD公司，货号352350)过滤。将滤液以160g的转速离心七分钟后，用SMEM重悬离心后的细胞沉淀，稀释之后用血细胞计数器计数。

2、用流式细胞仪从上述所得的细胞悬液中分选得到其中绿色荧光标记的Lgr5+毛囊干细胞，将分离得到的Lgr5+毛囊干细胞铺于NIH3T3饲养层细胞之上，加入DK-SFM培养基(购自Invitrogen公司，货号10744-019)进行培养，在此培养条件下，毛囊干细胞可在饲养层细胞之上不断分裂、生长，形成集落。对照组在上述培养基中加入DMSO，实验组加入10μM blebbistatin（购自Calbiochem公司），于二氧化碳细胞培养箱中培养16天（每两天换一次培养液）。在此期间每天观察集落形成效率及集落大小，16天之后一半的实验组及对照组用4%甲醛固定后用0.5%的罗丹明染色，观察并拍照分析，将另外一半的实验组和对照组中的细胞消化之后进行流式分析，分析其中绿色荧光标记的Lgr5+毛囊干细胞所占比例。预期实验结果为：在实验前两天内，blebbistatin处理可有效增加集落数目，即促进毛囊干细胞的存活。在之后的14天中，blebbistatin实验组中的集落大小明显超过对照组。细胞流式分析实验中，blebbistatin实验组中Lgr5+毛囊干细胞所占比例高于对照组。实验结果表明，经过blebbistatin处理能显著增加体外培养的Lgr5+毛囊干细胞的存活和干性。

实施例6

依照本发明提供的一种含有Blebbistatin的治疗或者预防脱发的药物，将其用于本实施例制备的离体小鼠毛囊干细胞的培养中，分析经过blebbistatin预处理后的Lgr5+毛囊干细胞对毛发新生的影响，具体步骤如下：

首先，按照实施例5制备Lgr5+毛囊干细胞的方法，分离雄性供体小鼠背部皮肤中的Lgr5+毛囊干细胞。其次，分离雌性新生小鼠的真皮层纤维细胞，具体方法如下：将新生雌性小鼠背部皮肤取下之后，置于0.25%的胰酶中在4℃消化过夜后，将真皮层分离出来，碾碎后置于0.35%的胶原酶溶液（购自Invitrogen公司，货号17104-019）中于37℃消化半个小时。悬浊液用100μm孔径的细胞筛(购于BD公司)过滤，滤液离心之后用Eagle's MEM培养液（购自Cambrex公司）重悬。将Lgr5+毛囊干细胞以一定的比例与成纤维细胞混合，离心后用DK-SFM培养基(购自Invitrogen公司，货号10744-019)重悬，之后进行培养。对照组加入DMSO，实验组加入10μM blebbistatin（购自Calbiochem公司），于二氧化碳细胞培养箱中培养一周（每两天换一次液）。最后，将对照组和实验组细胞移植至BALB/c^nu/nu裸鼠的背部创伤处，三周之后观察移植处新生毛发的生长状况。预期结果为经过blebbistatin预处理的Lgr5+毛囊干细胞移植至裸鼠背部之后，可提前长出毛发，且三周之后与对照组相比新生毛发数量明显增多。结果表明，Blebbistatin具有通过激活Lgr5+毛囊干细胞，有效促进小鼠新生毛发的生长的作用。

实施例7

依照本发明提供的一种含有Blebbistatin的治疗或者预防脱发的药物，将其用于本实施例的脱落的老龄小鼠背部，分析blebbistatin对于正常生理状况下毛发新生的影响，具体步骤如下：

选取年龄相同，背部毛发脱落状况非常类似的老龄小鼠进行实验，对照组小鼠背部脱毛处涂抹DMSO，实验组小鼠背部脱毛处涂抹blebbistatin药物（购自Calbiochem公司），三至四周之后观察脱毛处新生毛发的生长状况。预期实验结果为，涂抹blebbistatin药物的小鼠背部脱毛处可在三至四周后长出新生毛发，而对照组则没有新生毛发长出。结果表明，Blebbistatin具有通过激活Lgr5+毛囊干细胞，有效促进小鼠新生毛发的生长的作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.Blebbistatin在制备药物中的用途，所述药物用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一，

优选地，所述干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞，

优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，

优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述药物用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。

2.一种药物组合物，其特征在于，包含：

Blebbistatin作为活性成份；以及

药物上可以接受的载体，

任选地，所述药物用于促进干细胞存活和维持干细胞干性的至少之一，

优选地，所述干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞，

优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，

优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述药物用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。

3.一种用于治疗或者预防脱发的药物，其特征在于，包含Blebbistatin作为活性成份，

优选地，所述脱发为选自雄性激素源性脱发、脂溢性脱发、外伤及感染性脱发、精神性脱发、内分泌失调性脱发、营养代谢性脱发及物理化学性脱发、症状性脱发的至少一种。

4.一种个人护理组合物，其特征在于，包含Blebbistatin，

优选地，所述个人护理组合物为选自身体清洗剂、淋浴凝胶、液体皂、棒状肥皂、润肤液、护肤霜、淋浴后护肤水、浴后洁肤水、剃须活性物、剃须后护肤品、除臭产品、止汗产品、皮肤清洁擦拭物、皮肤冷却擦拭物、皮肤调理擦拭物、皮肤药物输送产品、驱虫产品、防晒品、皮肤晒黑产品、皮肤着色产品、皮肤化妆产品、眼部护理产品、口红产品、洗发剂、调理剂、调理洗发剂、头发定型产品、染发产品、生发产品、脱毛产品的至少一种。

5.一种干细胞培养基，其特征在于，包含

基础培养基，所述基础培养基适于干细胞生成；以及

blebbistatin，

优选地，所述基础培养基为选自下列的至少之一：，

优选地，进一步含有R-spondin1，

优选地，进一步含有选自EGF、noggin、和wnt3a的至少一种，

优选地，按照重量百分比，所述干细胞培养基含有：

5-100ng/ml终浓度的EGF、

5-200ng/ml终浓度的noggin、

100-1000ng/ml终浓度的R-spondin1和

5-200ng/ml终浓度的wnt3a。

6.权利要求5所述的干细胞培养基在培养干细胞的用途，

优选地，所述干细胞为选自下列的至少之一：造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和骨髓基质细胞、毛囊干细胞、小肠成体干细胞，肌肉干细胞，乳腺干细胞，

优选地，所述干细胞为选自毛囊干细胞和小肠成体干细胞的至少之一，

优选地，所述干细胞为Lgr5+干细胞，其中，所述blebbistatin用于增强Lgr5基因和Ascl2基因至少之一表达。

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