TW202135779A - 促進毛髮再生的組合物、富粒線體血漿、其製造方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明實施例提供一種促進毛髮再生的組合物、富粒線體血漿、其製造方法及其用途。包含粒線體之組合物可提高受損毛囊細胞的存活率、改善毛囊細胞的老化、改善毛囊細胞的氧化損傷及改善毛囊發炎現象，以達到促進毛髮再生的目的。
Description
本發明係關於包含粒線體的組合物及其用途，尤其係關於包含粒線體的組合物於促進毛髮再生的用途。
毛囊是生長毛髮的重要組織。毛囊的活化循環會從休止期（telogen）經由生長期（anagen）再進入衰退期（catagen），最後回到休止期，毛髮則在此循環中生長並脫落。毛囊在生長期最為活躍。位於毛囊根部的毛囊真皮乳突細胞（Hair Follicle Dermal Papilla Cell，HFDPC）在生長期大量增生，並傳遞訊號給周圍的基質細胞，以促進基質細胞增殖並分化成毛髮。
當毛囊受損或老化時，會影響毛髮生長。具體表現包含毛髮脆弱、生長緩慢、毛髮量稀少，甚至不再生長毛髮。毛髮不僅有美觀作用，依部位的不同，毛髮還具有隔熱、保暖及保護作用。動物若缺乏毛髮，不僅會對外觀造成影響（例如禿頭），還會面臨許多不便與危險，例如睫毛可以保護眼睛、頭髮可以調節頭部溫度等。
根據本發明一實施例，透過對毛囊給予粒線體，可促進毛髮再生。
本發明一實施例提供一種促進毛髮再生的組合物，包含粒線體。
本發明一實施例提供一種富粒線體血漿的組合物，包含粒線體及血漿。
本發明一實施例提供一種含粒線體的組合物用於促進毛髮再生的用途。
本發明一實施例提供一種富粒線體血漿的組合物用於促進毛髮再生的用途。
本發明一實施例提供一種富粒線體血漿的製造方法，包含：將血漿及複數個細胞自血液中分離；從該些細胞中取出複數個粒線體；以及混合該血漿與該些粒線體，形成該富含粒線體血漿。
根據本發明一實施例，藉由對毛囊給予粒線體或富粒線體血漿，可幫助毛囊中的細胞生長，以促進毛髮再生。對於受損的細胞而言，可提高受損細胞的存活率；對於老化的細胞而言，可改善細胞的老化程度；對於受自由基損傷的細胞而言，可改善細胞的氧化損傷。除此之外，將含粒線體之組合物塗敷或注射於毛囊周圍的皮膚，可改善毛囊發炎現象。
於以下實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵及優點，其內容足以使任何熟習相關技藝者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露的內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技藝者可輕易理解本發明相關之目的及優點。以下實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。
粒線體是細胞內進行氧化磷酸化反應及合成三磷酸腺苷（ATP）的場所，除了提供細胞正常代謝所需的能量外，還負責調控細胞內氧化壓力處理、訊號傳遞等功能。在毛髮生長的過程中，毛囊細胞內粒線體異常會導致毛囊活化與毛髮生長發生問題。因此，發明人透過粒線體置換的方式修補毛囊細胞內的粒線體，能改善毛囊的受損並促進毛髮再生。
根據本發明一實施例，促進毛髮再生的組合物包含粒線體。組合物可透過塗敷、注射或直接滴入的方式接觸毛囊或毛囊周圍的皮膚，以促進毛髮再生。在此組合物中，粒線體的濃度可為5微克/毫升至200微克/毫升，但不以此為限。在其他實施例中，粒線體的濃度可為40微克/毫升至200微克/毫升。組合物中所包含的溶劑可為使粒線體可維持功能與形貌的溶劑，例如為水、生理食鹽水、磷酸鹽溶液、各種鹽類緩衝液、甘露醇溶液、蔗糖溶液、血漿、血清、富血小板血漿等。
粒線體可取自動物細胞的粒線體，但不以此為限。提供粒線體的細胞可包含脂肪幹細胞、單核球細胞、胚胎幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、CD34+幹細胞、骨髓幹細胞、肌肉細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、皮膚細胞、神經細胞、血球細胞等具有粒線體的細胞。
於此說明下述實驗中所使用之粒線體。實施例所使用之粒線體取自人類脂肪幹細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）。幹細胞培養液包含Keratinocyte SFM (1X)溶液（Gibco）、bovine pituitary extract（BPE，Gibco）、重量百分濃度10%之胎牛血清（HyClone）。首先，在培養皿中將人類脂肪幹細胞培養至細胞數為1.5×108
個細胞，再以杜氏磷酸鹽緩衝液（DPBS）沖洗培養皿中的人類脂肪幹細胞。接著，移除培養皿中的杜氏磷酸鹽緩衝液後，在培養皿中加入細胞剝離用之胰蛋白酶（Trypsin），並在37℃下反應3分鐘後，再加入幹細胞培養液以終止反應。接著，將人類脂肪幹細胞自培養皿沖洗下來後打散，以600 g離心10分鐘後，移除上清液。接著，將離心後留下的人類脂肪幹細胞及80毫升之IBC-1緩衝液（225 mM甘露醇、75mM蔗糖、0.1 mM EDTA、30 mM Tris-HCl pH 7.4）加入均質器中，並在冰上的均質器中對人類脂肪幹細胞進行研磨15次。接著，以1000 g將研磨後的人類脂肪幹細胞離心15分鐘，將上清液收集至另一離心管，再以9000 g將收集的上清液再次離心10分鐘，移除再次離心後得到的上清液，獲得之沉澱物即為粒線體。在粒線體沉澱物中加入1.5毫升之IBC-2緩衝液（225 mM甘露醇、75mM蔗糖、30 mM Tris-HCl pH 7.4）及蛋白質分解酶抑制劑，並置於4℃下保存。
根據本發明另一實施例，促進毛髮再生的組合物可包含粒線體及血漿。在此組合物中，粒線體的濃度可為5微克/毫升至200微克/毫升，但不以此為限。在其他實施例中，粒線體的濃度可為40微克/毫升至200微克/毫升。在此組合物中，血漿中的血小板數目可小於1×104
個/微升，且血漿的體積百分濃度可為5%。
於此說明下述實驗中所使用之血漿。首先，抽取新鮮血液至含有抗凝血劑的採血管或離心管，將管中的血液以1500至2000 g離心10分鐘使血液分層，形成紅血球層、膠體層、白細胞層（buffy coat）及血漿層。接著，收集所分離出的血漿層以獲得實施例所使用之血漿。由上述方式獲得之血漿中，血小板數目小於1×104
個/微升。
根據本發明另一實施例，富粒線體血漿的組合物包含粒線體及血漿。血漿可包含生長因子。生長因子可包含TGF-β1、PDGF-AA、PDGF-AB或PDGF-BB。在此組合物中，TGF-β1的濃度可為3.1毫克/毫升（mg/mL）以上，PDGF-AA的濃度可為9.5奈克/毫升（ng/mL）以上，PDGF-AB的濃度可為91.7奈克/毫升（ng/mL）以上，PDGF-BB的濃度可為79.3奈克/毫升（ng/mL）以上。組合物可透過塗敷、注射或直接滴入的方式接觸毛囊或毛囊周圍的皮膚，以促進毛髮再生。在此組合物中，粒線體的重量可大於5微克。
根據本發明另一實施例，請參考圖1，圖1為實施例之富粒線體血漿（Mitochondria Rich Plasma，MRP）的製造方法的流程圖，富粒線體血漿的製造方法包含：將血漿及細胞自血液中分離（S10）；從細胞中取出粒線體（S20）；以及混合血漿與粒線體，形成該富含粒線體血漿（S30）。將血漿及細胞自血液中分離的步驟（S10）中，可包含：使血液分層，形成紅血球層、白細胞層（buffy coat）及血漿層；以及取出白細胞層及血漿層。從細胞中取出粒線體的步驟（S20）中，可包含從白細胞層中的細胞中取出粒線體。混合血漿與粒線體的步驟（S30）中，可包含混合血漿層與粒線體。此外，從細胞中取出粒線體的步驟（S20）中，可包含將細胞與萃取緩衝液混合，以成為混合物；使用針筒及針頭對混合物進行抽吸，使細胞破裂成細胞碎片並釋放粒線體；以及分離細胞碎片及粒線體，並收集粒線體。
於此說明下述實驗中所使用之富粒線體血漿的製備方法。首先，抽取8至10毫升的血液至CPT管（BD Vacutainer® CPTTM
Cell Preparation Tube，REF362761），但不限於此，可使用任何含有抗凝血劑的採血管或離心管。接著，將血液以1500 g離心10分鐘使血液分層，形成紅血球層、膠體層、白細胞層（buffy coat）及血漿層，其中白細胞層含有單核球細胞及血小板。接著，將血漿層及白細胞層取出至新的離心管中，將血漿層及白細胞層以400g離心5分鐘使細胞及血漿分離，並將分離之血漿收集至另一離心管。接著，加入1.5毫升之萃取緩衝液至細胞，以23G針頭及針筒抽吸細胞，使單核球細胞及血小板破裂進而釋放粒線體。萃取緩衝液可為滲透壓為42.8 mOsm/L的氯化鈉溶液。接著，將經抽吸處理的細胞以400g離心5分鐘使細胞碎片與粒線體分層，並收集含有粒線體的上清液。釋放粒線體的方式不限於此，亦可使用界面活性劑（detergent）來幫助細胞釋放粒線體，例如CHAPS detergent、Triton X-100、NP40等。接著，將含有粒線體的上清液與前述收集之血漿混合，獲得富粒線體血漿約5至8毫升。由上述方式獲得之富粒線體血漿中，粒線體的重量可大於5微克。
於此說明下述實驗所使用之細胞，實驗一至實驗五使用人類毛囊真皮乳突細胞（Human Hair Follicle Dermal Papilla Cell，HFDPC）作為探討毛囊活化的細胞模式。培養條件如下，將HFDPC培養於毛囊真皮乳突細胞培養基（Follicle Dermal Papilla Growth Medium，PromoCell，C-26501），並置於37℃、5%二氧化碳環境的培養箱中。將HFDPC培養至其體積為培養皿的九分滿時，移除培養皿中的培養液並使用磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗細胞。接著，移除磷酸鹽緩衝液，在培養皿中加入0.25%之胰蛋白酶並使胰蛋白酶在37℃下反應5分鐘，再加入培養液以終止胰蛋白酶的反應。接著，以1000 rpm離心5分鐘移除上清液，並加入新的培養液，進行細胞計數，依實驗需求進行細胞繼代培養。
〔實驗一，細胞損傷〕
過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2
O2
）及過氧化三級丁醇（tert-butyl hydroperoxide，tBHP）皆為過氧化物，常用作為誘導細胞損傷、氧化、老化與凋亡的物質。在本實驗中，使用H2
O2
及tBHP對HFDPC造成損傷，並透過阿爾瑪藍檢測試劑探討HFDPC的損傷情況，以存活率（亦稱為細胞存活率）來表示。
阿爾瑪藍（Alamar blue）係用於檢測細胞活力的檢測試劑。檢測套組內的刃天青（resazurin）是一種氧化還原指示劑，其為無毒、可穿透細胞膜且低螢光性之深藍色染料。當刃天青進入健康的細胞中，會因活細胞體內的還原環境而被還原成粉紅色且具高螢光性的試鹵靈（resorufin）。可藉由量測試鹵靈的光吸收值或螢光值來評估細胞的增生率或存活率（cell proliferation）。試鹵靈的光吸收值或螢光值愈高，表示細胞量越多，細胞的增生率或存活率愈高。細胞的增生率或存活率愈高也表示細胞愈健康、增生能力愈強。因此，本實驗使用阿爾瑪藍作為評估細胞增生率或細胞存活率的指標。
以下說明實驗流程。將HFDPC繼代後培養於24孔盤中，以每孔5×104
個細胞/500微升（μL）的密度培養8小時。接著，移除孔盤中的上清液並使用磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗細胞，再移除上清液並加入500 μL細胞培養液培養8小時。接著，在孔盤中加入不同濃度的H2
O2
或tBHP，使細胞在H2
O2
或tBHP的存在下培養4小時，其中H2
O2
及tBHP於孔盤中的濃度分別為100 μM、300 μM、500 μM及100 μM、200 μM、300 μM。接著，移除孔盤中的上清液並加入含有阿爾瑪藍的培養液，在37°C下培養3至4小時。培養完成後，以OD560/590的波長量測螢光，計算細胞的存活率。
實驗結果請參考表1、表2、圖2及圖3。圖2顯示不同濃度之tBHP對HFDPC的細胞存活率的影響。圖3顯示不同濃度之H2
O2
對HFDPC的細胞存活率的影響。控制組為未添加過氧化物的組別。對照組為添加有過氧化物的組別。存活率為培養後的細胞數相對於培養前的細胞數。*表示相對控制組具有顯著差異（P＜0.05）。
〔表1〕
| tBHP（μM） | 存活率（%） | |
| 控制組1 | - | 98.17±8.1 |
| 對照組1-1 | 100 | 88.59±22.1 |
| 對照組1-2 | 200 | 82.69±21.7 |
| 對照組1-3 | 300 | 59.46±28.7 |
〔表2〕
| H2 O2 （μM） | 存活率（%） | |
| 控制組2 | - | 101.83±8.4 |
| 對照組2-1 | 100 | 88.9±28.4 |
| 對照組2-2 | 300 | 63.05±26.9 |
| 對照組2-3 | 500 | 61.14±14.0 |
由實驗結果可知，tBHP及H2
O2
皆會對HFDPC造成損傷。並且，損傷的程度隨著濃度增加而更加明顯。以下實驗使用tBHP及H2
O2
誘導HFDPC損傷及老化。
〔實驗二，提高受損細胞的存活率〕
在本實驗中，使用300 μM之H2
O2
及300 μM之tBHP對HFDPC造成損傷，再使用實施例之組合物進行修復。並且，透過阿爾瑪藍檢測試劑探討實施例之組合物對HFDPC的修復情形，以存活率（亦稱為細胞存活率）來表示。
以下說明實驗流程。請參考實驗一的實驗流程，在孔盤中添加H2
O2
或tBHP，使細胞在300 μM之H2
O2
或300 μM之tBHP的存在下培養4小時後，移除孔盤中的上清液並加入實施例之組合物培養8小時，其中孔盤中含有40 μg之粒線體及體積百分濃度為5%之血漿。接著，移除孔盤中的上清液並加入含有阿爾瑪藍的培養液，在37°C下培養3至4小時。培養完成後，以OD560/590的波長量測螢光，計算各細胞的存活率。
實驗結果請參考表3、表4、圖4及圖5。圖4顯示使用實施例之組合物提升受到tBHP損害的HFDPC的細胞存活率。圖5顯示使用實施例之組合物提升受到H2
O2
損傷的HFDPC的細胞存活率。控制組為未添加過氧化物、血漿及粒線體的組別。對照組為未添加粒線體的組別。存活率為培養後的細胞數相對於培養前的細胞數。*表示相對對照組具有顯著差異（P＜0.05），**表示相對對照組具有高顯著差異（P＜0.01）。
〔表3〕
| tBHP （μM） | 粒線體 （μg） | 血漿 | 存活率 （%） | |
| 控制組3 | - | - | - | 99.34±6.1 |
| 對照組3-1 | 300 | - | 79.02±18.3 | |
| 實施例3-1 | 40 | 98.54±1.8 | ||
| 對照組3-2 | - | 5% | 92.98±2.4 | |
| 實施例3-2 | 40 | 100.17±1.6 |
〔表4〕
| H2 O2 （μM） | 粒線體 （μg） | 血漿 | 存活率 （%） | |
| 控制組4 | - | - | - | 101.1±6.4 |
| 對照組4-1 | 300 | - | 75.48±25.7 | |
| 實施例4-1 | 40 | 94.52±0.7 | ||
| 對照組4-2 | - | 5% | 95.67±2.0 | |
| 實施例4-2 | 40 | 113.6±4.9 |
由實驗結果可知，含有粒線體的組合物有助於提升細胞存活率，表示可改善H2
O2
及tBHP所造成的損傷情況以幫助細胞修復。並且，含有粒線體及血漿的組合物可進一步提升細胞存活率，表示在改善H2
O2
及tBHP所造成的損傷以及幫助細胞修復的效果更加明顯。
〔實驗三，細胞老化〕
在本實驗中，使用不同濃度的H2
O2
對HFDPC誘導老化損傷，並透過SA-β-gal套組來探討HFDPC的老化程度，並以老化程度（%）來表示。
在老化的細胞中，老化相關-β-半乳糖苷酶（Senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal）會被過度表達，因此SA-β-gal可作為細胞衰老的標記之一。本實驗使用SA-β-gal套組（Senescence β-Galactosidase Staining Kit #9860，Cell Signaling technology）來評估細胞的老化程度。
以下說明實驗流程。將HFDPC繼代後培養於12孔盤中，以每孔4×104
個細胞/1毫升的密度培養8小時。接著，在孔盤中加入不同濃度的H2
O2
，使細胞在H2
O2
的存在下培養4小時，其中H2
O2
於孔盤中的濃度分別為100 μM、300 μM、500 μM。培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗細胞並使用SA-β-gal套組進行細胞老化的評估。
實驗結果請參考表5及圖6。圖6顯示不同濃度之H2
O2
對HFDPC的老化程度的影響。控制組為未添加H2
O2
的組別。對照組為添加有H2
O2
的組別。老化程度為在單位面積中老化細胞的數量佔所有細胞的數量的百分比。*表示相對控制組具有顯著差異（P＜0.05），**表示相對控制組具有高顯著差異（P＜0.01），***表示相對控制組具有非常顯著差異（P＜0.001）。
〔表5〕
| H2 O2 （μM） | 老化程度（%） | |
| 控制組5 | - | 29±6.1 |
| 對照組5-1 | 100 | 42±2.5 |
| 對照組5-2 | 300 | 47±6.9 |
| 對照組5-3 | 500 | 58±6.4 |
由實驗結果可知，H2
O2
會對HFDPC造成老化損傷。並且，老化程度隨著濃度增加而更加明顯。以下實驗使用300 μM之H2
O2
誘導HFDPC老化。
〔實驗四，改善細胞老化〕
在本實驗中，選用300 μM之H2
O2
對HFDPC造成老化損傷，再使用實施例之組合物進行修復。並且，透過SA-β-gal套組探討實施例之組合物對老化HFDPC的影響，並以老化程度（%）來表示。
以下說明實驗流程。請參考實驗三的實驗流程，在孔盤中添加H2
O2
，使細胞在300 μM之H2
O2
的存在下培養4小時後，移除孔盤中的上清液並使用磷酸鹽緩衝液清洗細胞，再加入實施例之組合物培養8小時，其中孔盤中含有40 μg之粒線體及體積百分濃度為5%之血漿。培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗細胞並使用SA-β-gal套組進行細胞老化的評估。
實驗結果請參考表6及圖7。圖7顯示使用實施例之組合物改善HFDPC的老化程度。控制組為未添加H2
O2
、血漿及粒線體的組別。對照組為未添加粒線體的組別。老化程度為在單位面積中老化細胞的數量佔所有細胞的數量的百分比。*表示相對對照組具有顯著差異（P＜0.05），**表示相對對照組具有高顯著差異（P＜0.01），***表示相對對照組具有非常顯著差異（P＜0.001）。
〔表6〕
| H2 O2 （μM） | 粒線體 （μg） | 血漿 | 老化程度（%） | |
| 控制組6 | - | - | - | 43±10.02 |
| 對照組6 | 300 | - | 68±6.3 | |
| 實施例6-1 | 40 | 51±8.6 | ||
| 實施例6-2 | 40 | 5% | 38±5.8 |
由實驗結果可知，含有粒線體的組合物有助於降低細胞老化程度，表示可有效改善細胞的老化情況以幫助細胞修復。並且，含有粒線體及血漿的組合物可進一步降低細胞老化程度，表示在改善細胞老化以及幫助細胞修復的效果更加明顯。
〔實驗五，改善細胞氧化損傷〕
在本實驗中，選用300 μM之tBHP對HFDPC誘導氧化損傷，再使用實施例之組合物進行修復。並且，透過雙氯螢光黃乙酸乙酯（2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFDA）探討實施例之組合物對HFDPC的氧化壓力的影響，並以螢光強度表示。
DCFDA為一種螢光物質，具有四個苯環。DCFDA可通過細胞膜並受細胞內的酯解酶（esterase）作用移除乙羧基而停留在細胞中。DCFDA可與細胞內的自由基物質反應而發出螢光，自由基表現量愈多，表示氧化壓力愈大，所產生的螢光強度愈強。因此，DCFDA常被用作為檢測自由基的螢光物質。本實驗使用DCFDA檢測螢光來評估細胞的氧化壓力。
以下說明實驗流程。將HFDPC繼代後培養於96孔盤中，以每孔2.5×104
個細胞/200微升的密度培養8小時。接著，在孔盤中加入tBHP，使細胞在tBHP的存在下培養4小時，其中tBHP於孔盤中的濃度為300 μM。接著，移除孔盤中的上清液並使用磷酸鹽緩衝液清洗細胞，再加入實施例之組合物培養8小時，其中孔盤中含有1、15、40 μg之粒線體。培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗細胞，並使用含有25 μM的DCFDA的培養液，在37°C下反應30分鐘。反應結束後，使用磷酸鹽緩衝液清洗細胞並加入新的細胞培養液，以OD485/535的波長量測螢光。
實驗結果請參考表7及圖8。圖8顯示使用實施例之組合物改善HFDPC的氧化損傷。控制組為未添加過氧化物及粒線體的組別。對照組為未添加粒線體的組別。縱軸為相對螢光強度，表示相對於控制組的螢光強度，以控制組訂為1。**表示相對對照組具有高顯著差異（P＜0.01）。
〔表7〕
| tBHP（μM） | 粒線體（μg） | 相對螢光強度 | |
| 控制組7 | - | - | 1 |
| 對照組7 | 300 | - | 2.51±0.46 |
| 實施例7-1 | 1 | 2.06±0.16 | |
| 實施例7-2 | 15 | 1.88±0.23 | |
| 實施例7-3 | 40 | 1.57±0.33 |
由實驗結果可知，含有粒線體的組合物有助於降低細胞中自由基表現量，表示可有效降低氧化壓力並改善細胞受到的氧化損傷以幫助細胞修復。並且，隨著粒線體的濃度增加，自由基表現量下降更加明顯，表示改善氧化損傷的效果也隨之增加。
〔實驗六，小鼠實驗〕
在本實驗中，使用tBHP與小鼠進行動物實驗，觀察小鼠在受到tBHP誘導損傷後，有無使用實施例之組合物處理的皮膚及毛髮生長狀況。
以下說明實驗流程。選用35天（Day 35）大的C57BL/6公鼠，使用氣麻機以2%異氟醚（isoflurane）進行麻醉。使用電動剃刀將小鼠背部的毛髮剃除，並使用75%酒精進行消毒。使用胰島素注射針（BD VeoTM
inslin syringes）取100 μL之300 μM tBHP於小鼠背部進行皮下注射。每天注射一次，連續注射5天。接著，以皮下注射的方式分別給予100 μL之實施例之組合物。每天注射一次，連續注射3天。注射結束6天後（Day 49）觀察皮膚及毛髮生長狀況。
接著，將小鼠犧牲後，取小鼠背部的皮膚進行冷凍組織包埋處理。詳細來說，將皮膚組織取至4%甲醛（Formaldehyde）固定液中，在4°C下於水平儀搖盪4至6小時。移除4%甲醛固定液後，將皮膚組織移入15%蔗糖（Sucrose）溶液中，在4°C下於水平儀搖盪6至8小時。移除15%蔗糖溶液後，將皮膚組織移入30%蔗糖溶液中，在4°C下於水平儀搖盪一晚。將皮膚組織自溶液中取出後移至包埋盒，加入OCT冷凍包埋液（型號：23-730-571，Thermo Fisher Scientific）進行包埋處理。包埋完成的組織保存於-80°C中。將皮膚組織進行冷凍切片，切片厚度約為15至20微米，切片的組織保存於-80°C中。
接著，將完成切片的組織進行螢光染色。詳細來說，將切片之組織自-80°C取出後置於室溫進行回溫，再以PBS潤洗兩次，每次5分鐘。接著，使用配製於PBS-T（含有0.4%triton X-100之PBS）中之1%牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）進行組織潤洗兩次，每次10分鐘。接著，使用配製於PBS-T中之5%BSA進行遮蔽（blocking），在室溫下與組織作用30分鐘，以遮蔽非專一性物質並提高抗體專一性及靈敏度。接著，使用配製於PBS-T中之1%BSA進行組織潤洗兩次，每次10分鐘。接著，使用F4/80抗體（#MA5-16624，Thermo Fisher Scientific）以1：50的比例配製於1%BSA之PBS-T中，在室溫下與組織作用1.5小時。接著，使用配製於PBS-T中之1%BSA進行組織潤洗兩次，每次10分鐘。接著，使用羊抗鼠二級抗體複合物Alexa Fluor®594（goat anti rat secondary conjugation Alexa Fluor®594，ab150160，abcam）以1：200的比例配製於1%BSA之PBS-T中，在室溫下與組織作用1小時。接著，使用配製於PBS-T中之1%BSA進行組織潤洗兩次，每次10分鐘。接著，使用DAPI（D1306，Thermo Fisher Scientific）在室溫下與組織反應5分鐘，進行細胞核染色。最後，使用螢光顯微鏡拍照。
實驗結果請參考圖9至圖11及表8。圖9顯示使用實施例之組合物處理之小鼠背部的毛髮生長狀況。圖10顯示圖9之小鼠的組織冷凍切片圖。圖11顯示圖10之切片圖中巨噬細胞的表現量。控制組為未施以tBHP及實施例之組合物處理的組別。對照組為未施以實施例之組合物處理的組別。實施例8-1為施以含40微克之粒線體之組合物處理的組別。實施例8-2為施以含40微克之粒線體及體積百分濃度5%血漿之組合物處理的組別。***表示相對對照組具有非常顯著差異（P＜0.001）。
〔表8〕
| tBHP （μM） | 粒線體 （μg） | 血漿 | 巨噬細胞 表現量 | |
| 控制組8 | - | - | - | 2.81±0.67 |
| 對照組8 | 300 | - | 13.05±2.43 | |
| 實施例8-1 | 40 | 5.63±1.28 | ||
| 實施例8-2 | 40 | 5% | 4.37±1.1 |
從圖9之照片可看出，對照組之小鼠的背部較紅，表示小鼠的皮膚及毛囊產生發炎現象。給予含有粒線體之組合物或含有粒線體及血漿之組合物處理的小鼠，其背部沒有發紅現象且顏色呈現較黑，表示發炎現象得到改善，且毛囊有因損傷減緩而開始生長毛髮。
在圖10中，藍色表示被染色的細胞核，藍色區域呈現出毛囊型態；紅色表示被染色的巨噬細胞，紅色區域表示巨噬細胞聚集的區域，亦表示發炎的位置。從圖10之切片圖可看出，對照組之小鼠因tBHP誘導毛囊受損發炎，巨噬細胞集中在毛囊處。給予含有粒線體之組合物或含有粒線體及血漿之組合物處理的小鼠，在毛囊處的巨噬細胞明顯減少，表示發炎現象得到明顯改善。
圖11及表8呈現以Image J定量軟體對圖10之切片圖進行分析。巨噬細胞表現量係以Image J定量軟體分析單位區域內的螢光表現量，以面積與螢光強度的乘積表示。巨噬細胞表現量愈多，表示發炎現象愈嚴重。由螢光分析進一步證實，給予含有粒線體之組合物或含有粒線體及血漿之組合物處理的小鼠，其巨噬細胞表現量明顯下降，表示發炎現象明顯改善。並且，含有粒線體及血漿之組合物具有更優異的改善發炎現象的效果。
〔實驗七，富粒線體血漿的小鼠實驗〕
在本實驗中，使用tBHP與小鼠進行動物實驗，觀察小鼠在受到tBHP誘導損傷後，有無使用實施例之組合物處理的皮膚及毛髮生長狀況。
實驗流程請參考實驗六。本實驗所使用之組合物為富粒線體血漿。
實驗結果請參考圖12至圖14及表9。圖12顯示使用實施例之組合物處理之小鼠背部的毛髮生長狀況。圖13顯示圖12之小鼠的組織冷凍切片圖。圖14顯示圖13之切片圖中巨噬細胞的表現量。控制組為未施以tBHP及實施例之組合物處理的組別。對照組為未施以實施例之組合物處理的組別。實施例9為施以含富粒線體血漿之組合物處理的組別。**表示相對對照組具有高顯著差異（P＜0.01）。
〔表9〕
| tBHP（μM） | 富粒線體血漿 | 巨噬細胞 表現量 | |
| 控制組9 | - | - | 3.03±1.04 |
| 對照組9 | 300 | - | 11.51±2.97 |
| 實施例9 | + | 5.36±1.97 |
從圖12之照片可看出，對照組之小鼠的背部較紅，表示小鼠的皮膚及毛囊產生發炎現象。給予含有富粒線體血漿之組合物處理的小鼠，其背部沒有發紅現象且顏色呈現較黑，表示發炎現象得到改善，且毛囊有因損傷減緩而開始生長毛髮。
在圖13中，藍色表示被染色的細胞核，藍色區域呈現出毛囊型態；紅色表示被染色的巨噬細胞，紅色區域表示巨噬細胞聚集的區域，亦表示發炎的位置。從圖13之切片圖可看出，對照組之小鼠因tBHP誘導毛囊受損發炎，巨噬細胞集中在毛囊處。給予含有富粒線體血漿之組合物處理的小鼠，在毛囊處的巨噬細胞明顯減少，表示發炎現象得到明顯改善。
圖14及表9呈現以Image J定量軟體對圖13之切片圖進行分析。由螢光分析進一步證實，給予含有富粒線體血漿之組合物處理的小鼠，其巨噬細胞表現量明顯下降，表示發炎現象明顯改善。
〔實驗八，富粒線體血漿的頭皮實驗〕
在本實驗中，以微針在頭皮上創造出微型傷口，使用含有富粒線體血漿之組合物塗抹於頭皮上。取用適當量之含有富粒線體血漿之組合物，使其均勻覆蓋患部，塗抹範圍約25至49平方公分。在塗抹前及塗抹後第60天，觀察毛髮生長狀況並進行像素分析。
實驗結果請參考表10、圖15及圖16。圖15顯示使用實施例之組合物塗敷於頭皮前後毛髮生長的情況，左圖為塗抹前，右圖為塗抹後第60天。圖16顯示圖15之照片中頭皮的像素分析。縱軸之像素代表單位面積中毛髮的數量，以像素表示毛髮的密度。
〔表10〕
| 時間 | 像素 |
| 塗抹前 | 167.2±13.7 |
| 塗抹前後第60天 | 188.4±8.9 |
由圖15及圖16可看出，在將實施例之組合物塗敷於頭皮經過60天後，毛髮的密度有所提升，表示含有富粒線體血漿之組合物確實有助於毛髮的生長。
根據本發明一實施例，藉由對毛囊給予粒線體或富粒線體血漿，可幫助毛囊中的細胞生長，以促進毛髮再生。對於受損的細胞而言，可提高受損細胞的存活率；對於老化的細胞而言，可改善細胞的老化程度；對於受自由基損傷的細胞而言，可改善細胞的氧化損傷。除此之外，將含粒線體之組合物塗敷或注射於毛囊周圍的皮膚，可改善毛囊發炎現象。
雖然本發明以前述之實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。在不脫離本發明之精神和範圍內，所為之更動與潤飾，均屬本發明之專利保護範圍。關於本發明所界定之保護範圍請參考所附之申請專利範圍。
S10、S20、S30:步驟
圖1為實施例之富粒線體血漿的製造方法的流程圖。圖2顯示不同濃度之tBHP對HFDPC的細胞存活率的影響。圖3顯示不同濃度之H2
O2
對HFDPC的細胞存活率的影響。圖4顯示使用實施例之組合物提升受到tBHP損害的HFDPC的細胞存活率。圖5顯示使用實施例之組合物提升受到H2
O2
損害的HFDPC的細胞存活率。圖6顯示不同濃度之H2
O2
對HFDPC的老化程度的影響。圖7顯示使用實施例之組合物改善HFDPC的老化程度。圖8顯示使用實施例之組合物改善HFDPC的氧化損傷。圖9顯示使用實施例之組合物處理之小鼠背部的毛髮生長狀況。圖10顯示圖9之小鼠的組織冷凍切片圖。圖11顯示圖10之切片圖中巨噬細胞的表現量。圖12顯示使用實施例之組合物處理之小鼠背部的毛髮生長狀況。圖13顯示圖12之小鼠的組織冷凍切片圖。圖14顯示圖13之切片圖中巨噬細胞的表現量。圖15顯示使用實施例之組合物塗敷於頭皮前後毛髮生長的情況。圖16顯示圖15之照片中頭皮的像素分析。
Claims (13)
- 一種促進毛髮再生的組合物，包含粒線體。
- 如請求項1所述之組合物，其中該粒線體的濃度為5微克/毫升至200微克/毫升。
- 如請求項1所述之組合物，更包含血漿，該血漿中的血小板數目小於1×104 個/微升。
- 如請求項3所述之組合物，其中該血漿的體積百分濃度為5%。
- 一種富粒線體血漿的組合物，包含粒線體及血漿。
- 如請求項5所述之組合物，其中該富粒線體血漿中的該粒線體重量大於5微克。
- 一種含粒線體的組合物用於促進毛髮再生的用途。
- 一種富粒線體血漿的組合物用於促進毛髮再生的用途。
- 如請求項7或8所述之用途，其中將該組合物以塗敷、注射或直接滴入的方式接觸毛囊或毛囊周圍的皮膚。
- 如請求項7或8所述之用途，其中該組合物提高受損人類毛髮細胞的存活率、改善人類毛髮細胞的老化或改善人類毛髮細胞的氧化損傷。
- 一種富粒線體血漿的製造方法，包含：將血漿及複數個細胞自血液中分離；從該些細胞中取出複數個粒線體；以及混合該血漿與該些粒線體，形成該富含粒線體血漿。
- 如請求項11所述之製造方法，其中將血漿及複數個細胞自血液中分離的步驟包含：使該血液分層，形成紅血球層、白細胞層（buffy coat）及血漿層；以及取出該白細胞層及該血漿層；從該些細胞中取出複數個粒線體的步驟包含從該白細胞層中的該些細胞中取出該些粒線體；混合該血漿與該些粒線體的步驟包含混合該血漿層與該些粒線體。
- 如請求項11所述之製造方法，其中該富粒線體血漿中的該些粒線體重量大於5微克。
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