CN105477018A - 修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法，该干细胞制剂包括浓度为4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％-20％的血小板血浆裂解液，还包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔。创伤愈合是细胞因子与效应细胞相互作用的结果，外源性细胞因子的局部使用可有效促进创伤愈合，本发明将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，制成干细胞制剂，相互作用可有效促进皮肤溃疡创伤的愈合。

Description

修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法。
背景技术
慢性皮肤溃疡又称难治性皮肤溃疡，是一种常见的难治性疾病，具有病因复杂、病程长和反复发作特点，可引起皮肤表皮和部分真皮甚至皮下脂肪缺损。致病因素包括糖尿病、外伤、压迫和感染等，其中糖尿病为主要原因。目前，我国糖尿病患者约9200万，15％～25％患者在其疾病过程中将发生足溃疡。
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCS)是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。近来有研究报道，在骨髓、软骨和脂肪组织之外的脐带血和脐带等胎儿附属组织中发现了MSCS。
间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一种成体干细胞，具有自我复制和定向分化潜能特点，由于其可通过旁分泌效应和向类皮细胞分化参与创伤愈合的各个阶段，具有治疗皮肤溃疡的潜在价值。
目前，尚无慢性皮肤溃疡治疗指南，临床上多采用清创术、负压疗法、抗感染药物及敷料处理，这些方法都达不到兼具促进创面愈合和保护创面的作用，治疗效果不尽人意。
发明内容
本发明需解决的技术问题是提供一种可有效促进创伤愈合的修复皮肤溃疡的干细胞制剂。
为解决上述的技术问题，本发明设计了一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其包括浓度为4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％-20％的血小板血浆裂解液。
作为本发明进一步改进，所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂还包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔。
作为本发明进一步改进，所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂还包括6～10U/mL的强力霉素。
本发明还提供了上述修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1：制备间充质干细胞的步骤，包括：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：利用胶原酶Ⅱ对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤液；
S13：将所述滤液离心，弃上清，将离心沉淀下来的细胞用含10％WT的FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；
S14：当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；
S2：制备血小板血浆裂解液的步骤，包括：
S21：获取骨髓，离心，吸取上层及中间的有核细胞；
S22：再离心，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；
S23：对所述细胞悬液离心，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液；
S3：配制所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液添加到所述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。
创伤愈合是细胞因子与效应细胞相互作用的结果，外源性细胞因子的局部使用可有效促进创伤愈合，本发明将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，制成干细胞制剂，互相作用可有效促进皮肤溃疡创伤的愈合。
具体实施方式
为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
本发明提供一种干细胞制剂，用于治疗皮肤溃疡，促进创伤的愈合。该干细胞制剂将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，即外源性细胞因子(血小板血浆裂解液)和效应细胞(间充质干细胞)相互作用，可有效地促进创伤愈合。
在本发明实施方式中，间充质干细胞的浓度为4～6×107个/ml和血小板血浆裂解液的体积分数为5％-20％。在其中，还包括有30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液、5～15μmol/L的法舒地尔和6～10U/mL的强力霉素。
本发明还提供了上述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备间充质干细胞：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：利用胶原酶Ⅱ对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤液；
S13：将所述滤液离心，弃上清，将离心沉淀下来的细胞用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；
S14：当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；
S2：制备血小板血浆裂解液：
S21：获取骨髓，离心，吸取上层及中间的有核细胞；
S22：再离心，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；
S23：对所述细胞悬液离心，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液；在之后，还对所述血小板血浆裂解液进行冻存，再解冻，反复冻存解冻至少3次以上。
S3：配制所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液、30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔以及6～10U/mL添加的步骤添加到所述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。
下面结合具体的实施例对本发明进一步详细说明
实施例一：
制备间充质干细胞悬液
取足月剖宫产胎儿的脐带约4～6cm长，在无菌条件下抽净脐带血，将约4～6cm长脐带放入超净台中，去除动静脉及外膜，PBS进行初次漂洗几次，剪成1cm小段，再用PBS多次漂洗以尽可能去除血液，最后剪成肉糜状。将肉糜状人脐带组织块移入50mL离心管，加入5mL的、经37℃预热的、质量分数为0.1％的胶原酶Ⅱ(100mlPBS缓冲液溶解0.1g胶原酶)，放入37℃水浴摇床中振荡消化180min，再加入30mL的DMEM/F12培养，反复吹打，细胞筛过滤，收集滤液。该滤液用1000转/min离心10min，弃上清，将离心沉淀下来的细胞按1×106/mL的密度用含10％WT的FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养，次日首次换液，以后每3d换液1次。当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶液配制：PBS缓冲液200mL，胰蛋白酶0.5g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液。
制备血小板血浆裂解液
无菌条件下用含100U/mL低分子量肝素钠的无菌针管从髂后上脊取骨髓30mL，生物安全柜中转入50mL的无菌离心管中，在200g/min的条件下离心6min，离心后可见骨髓分为3层，吸取上层及中间富含的有核细胞，将有核细胞转至另一离心管，1000g离心6min，弃上清液；下层加入DMEM培养液(含体积分数为10％血清、8U/mL强力霉素和3U/mL的肝素)，于37℃，体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中原代培养，得细胞悬液。将该细胞悬液离心，即可获得血小板血浆裂解液。在本实施例中，可采用以下三种离心方法中的一种方法获得该细胞悬液：
(1)：一次离心法：200g，20min离心上述细胞悬液，20min，吸取上层血清和下层1mm的红细胞；
(2)：采用2次离心方法：第1次离心(200g，6min)，吸取上层血清和下层2mm红细胞层进行第2次离心(200g，10min)，弃上层大部分血清，将留下的少量血清和底部浓缩的红细胞、白细胞的浓缩混合物混匀；
(3)：三次离心法：第1次离心(200g，5min)，吸取上层血清和下层2～3mm的红细胞层进行第2次离心(200g，5min)，取上层血清和下层1mm的红细胞层进行第3次离心(800g，10min)，可见3分层，弃去上层大部分血清，将剩余血清、白膜样物质层和下层红细胞层混匀。
将上述3种方法中之一获得的血小板血浆裂解液再在－80℃冰箱内保存，第2天取出，为防止蛋白质沉淀，在37℃恒温水浴中解冻，时间不能超过5min,反复冻存解冻至少3次以上。
混合制剂
将上述血小板血浆裂解液添加至上述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合，调至间充质干细胞的浓度为5×107个/ml和血小板血浆裂解液的体积分数为15％，同时，加入人血清蛋白、NaCl法舒地尔以及强力霉素，边添加，边混合，调至人血清蛋白的浓度为40mg/ml，NaCl溶液的浓度为0.2mol/L，法舒地尔的浓度为10μmol/L和强力霉素的浓度为8U/mL，各成分混合均匀。
为进一步验证本发明提供的干细胞制剂的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。
验证实验：
实验动物分组和模型构建：
SD免疫缺陷鼠40只，雌雄各半，体重约200～250g，随机分为对照组(实施注射未加入其他的单纯的干细胞制剂)和治疗组(实施注射本发明干细胞制剂)，通过化学方法灼伤建立皮肤损伤模型，分别隔离相同环境下饲养。以上各组治疗开始后3d、7d、14d观察伤口愈合情况，计算伤口愈合指数(WCI)，WCI(％)＝(1－现创面面积/原创面面积)×100％
计算两组鼠的WCI的平均值，实验结果数据见下表：
分组 样本量 伤后3d 伤后7d 伤后14d
对照组 20 2.91±1.30 5.21±0.97 11.10±1.62
治疗组 20 5.60±1.24 28.65±1.37 41.98±1.92
实验结果显示：随着天数增加，治疗组的伤口愈合指数越来越大，而对照组伤口愈合指数变化不大，说明本发明干细胞制剂逐渐显效，伤口愈合速度快于对照组，能促进皮肤溃疡创伤的愈合。
以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，包括浓度为4～6×107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5％-20％的血小板血浆裂解液。
2.根据权利要求1所述的修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，还包括30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L的法舒地尔。
3.根据权利要求2所述的修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，还包括6～10U/mL的强力霉素。
4.一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备间充质干细胞的步骤，包括：
S11：获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
S12：利用胶原酶Ⅱ对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤液；
S13：将所述滤液离心，弃上清，将离心沉淀下来的细胞用含10％WT的FBS的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；
S14：当细胞达融合后，用胰蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第三代后用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；
S2：制备血小板血浆裂解液的步骤，包括：
S21：获取骨髓，离心，吸取上层及中间的有核细胞；
S22：再离心，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；
S23：对所述细胞悬液离心，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液；
S3：配制所述修复皮肤溃疡的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液添加到所述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。
5.根据权利要求4所述的一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，在步骤S23中获得血小板血浆裂解液之后，还包括对所述血小板血浆裂解液进行冻存，再解冻，反复冻存解冻至少3次以上。
6.根据权利要求4所述的一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中还包括添加30～50mg/ml的人血清蛋白、0.1～0.3mol/L的NaCl溶液和5～15μmol/L法舒地尔的步骤。
7.根据权利要求6所述的一种修复皮肤溃疡的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中还包括添加6～10U/mL的强力霉素的步骤。
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