CN107523533A - 自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法 - Google Patents
自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107523533A CN107523533A CN201710725703.4A CN201710725703A CN107523533A CN 107523533 A CN107523533 A CN 107523533A CN 201710725703 A CN201710725703 A CN 201710725703A CN 107523533 A CN107523533 A CN 107523533A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- autologous
- liquid
- collagen
- fibroblast
- skin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 39
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 3
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009758 senescence Effects 0.000 abstract description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 abstract 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract 1
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000589 cicatrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000686 essence Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003182 parenteral nutrition solution Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Birds (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，包括以下步骤：皮肤成纤维细胞分离、培养和传代；自体高浓度以胶原蛋白为主的分泌浓缩蛋白液的制备；自体血小板富集血浆的制备。本发明针对皮肤衰老、疤痕形成的主要原因而设计制备的，制剂的三种成分——自体皮肤成纤维细胞、自体生长因子即PRP、自体胶原蛋白，保证了制剂的有效性，维持时间长的特点；而且三种成分全部都是自体的，保证了制剂的安全性，这较市场上单纯使用自体成纤维细胞移植的效果好。本发明主要内容是分泌的胶原蛋白为主的上清浓缩液制备的方法。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质获取技术领域，尤其涉及一种用自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法。
背景技术
随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，从而修复老化的、损伤的皮肤。成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。有活性的在体外培养好的符合临床级别要求的成纤维细胞移植到皱纹处需要成活、增殖、具有分泌功能，这就需要有促进成纤维细胞生长的因子及胶原蛋白等细胞外基质。血小板中含有大量的这些因子，培养的上清中含有成纤维细胞成活、生长的包括胶原蛋白等胞外基质成分。因此，本发明的制剂包含了自体成纤维细胞、PRP及浓缩的成纤维细胞培养上清中的分泌蛋白，主要是胶原蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，旨在解决制剂的有效成分获取的标准化程序的问题。
本发明是这样实现的，一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法包括以下步骤：
步骤一，皮肤成纤维细胞分离、培养；包括：标本处理；分离培养；培养；
步骤二，自体高浓度胶原蛋白液的制备；
步骤三，自体血小板富集血浆的制备。
进一步，所述步骤一具体包括：
(1)标本处理：皮肤标本放于无钙镁磷酸缓冲液(DPBS)瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×DPBS5ml浸润15min，用1ml移液枪吸弃，再用1×DPBS同样反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用DPBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪碎，后面相同；
(2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h～2h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm3～0.3mm3大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS-IMEM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；
(3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm2培养瓶中，加入1ml完全培养基，注意切勿使培养物浮起，置37℃5％CO2培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，Tryple select无动物源性消化液，200目过滤去除组织块，按照1：2比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；从P2代开始，以1:5的比例传代，培养至第四代，获得2×108～3×108成纤维细胞。
进一步，所述步骤二具体包括：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白等蛋白质，在换液时，将所有含胶原蛋白上清全部收集，放于无菌试剂瓶内以备制备浓缩胶原蛋白液用，超滤除去培养上清液中的无机盐，获得浓缩的以自体胶原蛋白为主的分泌蛋白，然后再用冷冻浓缩技术浓缩，获得高浓度胶原蛋白大于1500ug/ml，放于4℃冰箱无菌保存。
进一步，所述步骤三具体包括：
(1)将无菌采集的200ml静脉血从采血袋或注射器中移入到离心管中，全血离心450g，10min；
(2)全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆；
(3)将获得的血浆离心3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉；
(4)轻轻吸出上层少血小板血浆，放于无菌试剂瓶中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩血小板，可获得全血中80％以上的血小板。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法获取的自体活细胞注射液。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述蛋白液制备的修复皮肤瘢痕、除皱产品。
本发明提供的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，针对皮肤衰老、疤痕形成的主要原因而设计制备的，制剂的三种成分——自体皮肤成纤维细胞、自体生长因子即PRP、自体胶原蛋白，保证了制剂的有效性，维持时间长的特点。而且三种成分全部都是自体的。保证了制剂的安全性，这较市场上单纯使用自体成纤维细胞移植的效果好。本发明主要内容是分泌的胶原蛋白为主的上清浓缩液制备的方法。
附图说明
图1是本发明实施例提供的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法包括以下步骤：
S101：人皮肤成纤维细胞分离、培养；
S102：自体高浓度胶原蛋白液的制备；
S103：自体血小板富集血浆的制备。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
(一)人皮肤成纤维细胞分离、培养
取材：在医院手术室无菌取耳后4块3mm2大小皮肤组织置于事先装有培养基的冻存管中；
(1)标本处理：皮肤标本放于无钙镁磷酸缓冲液(DPBS)瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×DPBS5ml浸泡15min，用1ml移液枪吸弃，再用1×DPBS同样反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用DPBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪碎；
(2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h～2h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm3～0.3mm3大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS-IMEM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；
(3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm2培养瓶中，加入1ml完全培养基，注意切勿使培养物浮起，置37℃5％CO2培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，Tryple select无动物源性消化液，200目过滤去除组织块，按照1：2比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；从P2代开始，以1:5的比例传代，培养至第四代，获得2×108～3×108成纤维细胞。
(二)自体高浓度胶原蛋白液的制备：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白等蛋白质，在换液时，将所有含分泌蛋白上清全部收集，放于无菌试剂瓶内以备制备浓缩胶原蛋白液用，采用超滤浓缩技术浓缩分泌蛋白，去除上清中的无机盐，然后再用冷冻浓缩技术浓缩，获得高浓度以胶原蛋白大于1500ug/ml为主的分泌蛋白，放于4℃冰箱无菌保存。
(三)自体血小板富集血浆的制备
1.将无菌采集的200ml静脉血从采血袋或注射器中移入到离心管中。全血离心450g，10min。
2.全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，为保证吸取到全部血小板，可尽量取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆。
3.将获得的血浆离心3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉。
4.轻轻吸出上层少血小板血浆，放于无菌试剂瓶中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清(使用时需要灭活)，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩血小板，约可获得全血中80％以上的血小板。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法包括以下步骤：
步骤一，皮肤成纤维细胞分离、培养；包括：标本处理；分离；培养和传代；
步骤二，自体高浓度胶原蛋白液的制备；
步骤三，自体血小板富集血浆的制备。
2.如权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：
(1)标本处理：皮肤标本放于磷酸缓冲液PBS瓶中，4℃保存，带回GMP级实验室；将取回的标本置于生物安全柜，标本移入平皿内，首先用1×磷酸盐缓冲液PBS 5ml浸泡15min，用1ml移液枪吸弃浸泡液，再用1×PBS反复冲洗，然后用500u/ml氨苄青霉素和500mg/ml硫酸链霉素的PBS溶液中浸泡消毒10min后，用PBS液用力反复冲洗5次，直至标本发白，轻度发胀，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，将标本剪粹，后面相同；
(2)分离：用1mg/ml的混合胶原酶MNP-S在37℃条件下消化1h，分离表皮与真皮；去除表皮，真皮组织剪成约0.1mm3～0.3mm3大小，加入Tryple select无动物源性消化液，37℃条件下继续消化15min；当成纤维细胞大部分从组织中分离出来时，加入10％FBS高糖-IMDM培养基终止消化，移入离心管，1000r/min离心5min，收集沉淀；
(3)培养和传代，将获得的细胞及剩余的组织块一并接种于75cm2培养瓶中，加入1ml完全培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养；于培养24h后补充培养液，此后隔3d半定量换液；原代细胞融合至70％时，0.1％胰蛋白酶消化，去除组织块，按照1：5比例转入T175传代，培养基改为加含10％自体血清培养基；在培养至第四代，获得2×108～3×108成纤维细胞。
3.如权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：自体真皮成纤维细胞在体外培养扩增过程中，分泌胶原蛋白、纤连蛋白蛋白质，在换液时，将所有含胶原蛋白上清全部收集，放于离心管，超滤浓缩技术除去分泌液中的无机盐，获取浓缩分泌蛋白液，然后再采用冷冻浓缩技术浓缩，采用超滤浓缩除盐结合冷冻浓缩方法，获得高浓度胶原蛋白>1500ug/ml，放于4℃冰箱无菌保存。
4.如权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
(1)将血液从采血袋或注射器中移入到离心管中，全血离心450g，10min；
(2)全血分层为无明显界限的两层，取上层液体，取到红细胞层以上的包括白细胞在内的上层部分血浆；
(3)将获得的血浆离心3000g离心15min，温度22℃±2℃，使血小板下沉；
(4)轻轻吸出上层少血小板血浆，放于另一无菌离心管中，作为制备培养成纤维细胞培养基的血清，余下5ml～10ml血浆沉淀，即为浓缩血小板，可获得全血中80％以上的血小板。
5.一种利用权利要求1～4任意一项所述自体皮肤成纤维细胞、PRP及胶原蛋白液的获取方法获取的蛋白液。
6.一种利用权利要求5所述蛋白液制备的护肤品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710725703.4A CN107523533A (zh) | 2017-08-22 | 2017-08-22 | 自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710725703.4A CN107523533A (zh) | 2017-08-22 | 2017-08-22 | 自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107523533A true CN107523533A (zh) | 2017-12-29 |
Family
ID=60681823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710725703.4A Pending CN107523533A (zh) | 2017-08-22 | 2017-08-22 | 自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107523533A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108486045A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-09-04 | 广东颜值科技有限公司 | 一种人成纤维细胞的培养组合物 |
| CN108486044A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-09-04 | 北京多赢时代科技有限公司 | 自体成纤维细胞的制备方法和应用 |
| CN108771769A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-11-09 | 白晋 | 一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法 |
| CN109078219A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-25 | 白晋 | 一种配合面部线雕的自体胶原蛋白组织填充物的制备方法 |
| CN109200338A (zh) * | 2018-08-15 | 2019-01-15 | 白晋 | 一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法 |
| CN109988742A (zh) * | 2017-12-30 | 2019-07-09 | 西安洛威塔生物科技有限责任公司 | 自体成纤维细胞培养方法 |
| CN113528426A (zh) * | 2021-05-27 | 2021-10-22 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法 |
| CN114344454A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-15 | 郑州市金水区蕾娜斯医疗美容门诊部 | 自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法 |
| CN115947790A (zh) * | 2022-11-15 | 2023-04-11 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物 |
-
2017
- 2017-08-22 CN CN201710725703.4A patent/CN107523533A/zh active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109988742A (zh) * | 2017-12-30 | 2019-07-09 | 西安洛威塔生物科技有限责任公司 | 自体成纤维细胞培养方法 |
| CN108486045A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-09-04 | 广东颜值科技有限公司 | 一种人成纤维细胞的培养组合物 |
| CN108486044A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-09-04 | 北京多赢时代科技有限公司 | 自体成纤维细胞的制备方法和应用 |
| CN108771769A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-11-09 | 白晋 | 一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂的制备方法 |
| CN109078219A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-25 | 白晋 | 一种配合面部线雕的自体胶原蛋白组织填充物的制备方法 |
| CN109200338A (zh) * | 2018-08-15 | 2019-01-15 | 白晋 | 一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法 |
| CN113117148A (zh) * | 2018-08-15 | 2021-07-16 | 白晋 | 一种结合肉毒杆菌的自体胶原蛋白注射剂 |
| CN113528426A (zh) * | 2021-05-27 | 2021-10-22 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | 一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法 |
| CN114344454A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-15 | 郑州市金水区蕾娜斯医疗美容门诊部 | 自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法 |
| CN115947790A (zh) * | 2022-11-15 | 2023-04-11 | 诺赛联合(北京)生物医学科技有限公司 | 成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107523533A (zh) | 自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法 | |
| Llames et al. | Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin | |
| CN103074298B (zh) | 一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法 | |
| CN102872478B (zh) | 一种全生物化组织工程血管的构建方法 | |
| CN108823156A (zh) | 用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法 | |
| CN107354129B (zh) | 一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法 | |
| CN107362391A (zh) | 一种自体三联皮肤成纤维细胞制剂的制备方法 | |
| CN100384987C (zh) | 一种三维条件下扩增造血干细胞的方法 | |
| CN102586182A (zh) | 人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备与应用 | |
| CN106190967A (zh) | 一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法 | |
| CN104673745A (zh) | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 | |
| CN106038598A (zh) | 人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法 | |
| CN109627315A (zh) | 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 | |
| CN103898049A (zh) | 一种活细胞精华液产品及其制备方法和应用 | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| CN109260227A (zh) | 一种用于治疗阿尔茨海默症的自体脂肪间充质干细胞注射液制备方法 | |
| CN108396007B (zh) | 体外构建奶牛血乳屏障三维模型的方法 | |
| CN105013014A (zh) | 一种无细胞基质生物材料的制备方法和用途 | |
| CN104399125A (zh) | 表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法 | |
| CN105861432A (zh) | 人源脐带血造血干细胞体外高效扩增方法 | |
| CN108456655A (zh) | 间充质干细胞悬浮液及其制备方法与应用 | |
| CN106566803A (zh) | 一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN104971382B (zh) | 一种用无血清和牛垂体提取物培养液构建的创口贴式人工活性组织及其构建方法 | |
| CN106540334A (zh) | 一种组合物及其应用 | |
| CN101525596A (zh) | 一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171229 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |