CN109200338A - 一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，属于医学美容技术领域，包括以下步骤：步骤一，获取自体成纤维组织；步骤二，传代培养；步骤三，胶原蛋白积累；步骤四，加入玻尿酸；步骤五，凝胶的制备。该技术方案以自体成纤维细胞产生的胶原蛋白为原料，将玻尿酸与交联剂混合制备凝胶产品，该自体胶原蛋白凝胶无毒副作用，具有较好的生物相容性和组织相容性，可以作为医学美容中的机体组织填充物，其中的血管内皮细胞生长因子能够促进填充后皮下血管的愈合生长，促进血液循环，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，属于医学美容技术领域。
背景技术
皱纹是指皮肤受到外界环境影响，形成游离自由基，自由基破坏正常细胞膜组织内的胶原蛋白、活性物质，氧化细胞而形成的小细纹、皱纹。皱纹的发生归结起来有4个原因：自然老化、地心引力作用、阳光中紫外线照射使皮肤发生光老化与光损伤和面部表情肌过多的收缩。其中面部表情肌过多的收缩产生的皱纹称动力性皱纹，主要表现为眶外侧的鱼尾纹，额头纹和眉间纹、鼻唇沟纹和唇上纹和颈阔肌纹。除皱有许许多多的办法，局部外用各种各样的除皱霜、抗皱霜、防晒霜只能改善外观，它对皱纹的消除不会有较大的作用。医用胶原注射充填术有效，但因为是非自身物质，只能存在几个月就会被机体清除，同时注射后会有一定的过敏反应。
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85％，占动物体内蛋白质总量的25％～30％，它广泛存在于动物的结缔组织 (骨、软骨、皮肤、腱、韧等)中，对机体和脏器起着支持、保护、结合，以及形成界隔等作用。人体皮肤下层也有致密排布的胶原蛋白存在，皮肤的厚度和成分会随着年龄增加而改变，老年人的皮肤很容易受伤，且不易愈合，这很可能是因为上层皮肤成纤维细胞缺失所致，若能刺激这些细胞生长，就有可能恢复皮肤的弹性，同样还能刺激毛囊形成，减少疤痕。通过自体胶原蛋白注射的方式去除皱纹，能够显著减少过敏反应，但是单纯的胶原蛋白注射容易被机体降解，不能根本性的解决皱纹问题，为此，对现有的医用胶原注射填充物进行改进，对提高提高对皱纹的去除效果具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明实施例提供了一种自体胶原蛋白凝胶的制备方法，通过结合玻尿酸将自体胶原蛋白制成凝胶，提高其作为组织填充物在人体内的存放时间，减少机体的排异反应。具体技术方案如下：
一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在 25℃～30℃的温度条件下搅拌1h～3h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入交联剂，放入45℃～55℃的恒温水浴锅中3h～6h，然后置于无热源蒸馏水中透析3 天～5天，得到自体胶原蛋白凝胶。
作为上述技术方案的改进，在步骤一和步骤二中，DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％。
作为上述技术方案的改进，在步骤一中，离心速度为1000rpm～ 2500rpm，离心时间为2min～5min。
作为上述技术方案的改进，在步骤二中，胰蛋白酶为质量分数为 0.25％的胰蛋白酶。
作为上述技术方案的改进，在步骤三中，首先取出无血清培养基，然后用50k超滤膜过滤，再用0.22μm的滤膜过滤，得到胶原蛋白。
作为上述技术方案的改进，在步骤五中，交联剂为乙二醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚中的任一种。
作为上述技术方案的改进，在步骤五中，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:1～2:2～9。
作为上述技术方案的改进，在步骤五中，混合溶液中还加入有血管内皮细胞生长因子。
作为上述技术方案的改进，在步骤五中，每10ml混合溶液中加入血管内皮细胞生长因子1mg～5mg。
上述技术方案以自体成纤维细胞产生的胶原蛋白为原料，将玻尿酸与交联剂混合制备凝胶产品，该自体胶原蛋白凝胶无毒副作用，具有较好的生物相容性和组织相容性，可以作为医学美容中的机体组织填充物，其中的血管内皮细胞生长因子能够促进填充后皮下血管的愈合生长，促进血液循环，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为1000rpm～2500rpm，离心时间为2min～5min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液，DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下，5％CO2恒温培养；该步骤中自体成纤维组织可以通过手术从人体皮肤中取出；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；该步骤通过体外培养成纤维细胞，使其生长到一定数量；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在 25℃～30℃的温度条件下搅拌1h～3h后静置；玻尿酸又称糖醛酸、透明质酸，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。与其它粘多糖不同，它不含硫。它的透明质分子能携带500 倍以上的水分，为当今所公认的最佳保湿成分，广泛的应用在保养品和化妆品中；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入交联剂，放入45℃～55℃的恒温水浴锅中3h～6h，然后置于无热源蒸馏水中透析3 天～5天，得到自体胶原蛋白凝胶，交联剂为乙二醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、1， 6-己二醇二缩水甘油醚中的任一种，该步骤中混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:1～2:2～9。
上述技术方案引入自体胶原蛋白制备得到凝胶，得到的产品中交联剂残留量低，对生物体损害较小，且胶原蛋白可提高水凝胶的机械强度，并对产品的细胞粘附性和促进细胞生长性产生积极的影响，从而使该凝胶作为软组织填充材料表现出更大的优势。
成纤维细胞，也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，属于终末分化细胞，这种细胞会制造胶原蛋白等蛋白质。成纤维细胞数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清，具有突起。其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。
在步骤三中，成纤维细胞放入无血清培养基后培养时间为12h～60h，培养的目的是通过成纤维细胞的生长分泌得到胶原蛋白，在成纤维细胞培育完成后，首先取出无血清培养基，然后用超声破碎细胞组织，再用 50k超滤膜和0.22μm的滤膜分别过滤，得到胶原蛋白。
在步骤五中，混合溶液中还加入有血管内皮细胞生长因子，每10ml 混合溶液中加入血管内皮细胞生长因子1mg～5mg。血管内皮生长因子又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，在作为机体组织填充的凝胶注入机体后，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一
采用以下步骤制备具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为1000rpm，离心时间为5min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中 60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液， DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下，5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在25℃的温度条件下搅拌1h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚，放入45℃的恒温水浴锅中6h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天，得到自体胶原蛋白凝胶，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:1:2。按照10ml混合溶液中加入1mg的血管内皮细胞生长因子的添加量进行细胞生长因子的添加。
实施例二
采用以下步骤制备具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为1500rpm，离心时间为4min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中 60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液， DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在25℃的温度条件下搅拌1h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入二甘醇二缩水甘油醚和血管内皮细胞生长因子，放入45℃的恒温水浴锅中4h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天，得到自体胶原蛋白凝胶，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:1:3。按照10ml混合溶液中加入2mg的血管内皮细胞生长因子的添加量进行细胞生长因子的添加。
实施例三
采用以下步骤制备具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为1600rpm，离心时间为3min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中 40min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液， DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在30℃的温度条件下搅拌2h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入聚乙二醇二缩水甘油醚和血管内皮细胞生长因子，放入50℃的恒温水浴锅中4h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天，得到自体胶原蛋白凝胶，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:1:4。按照10ml混合溶液中加入2mg的血管内皮细胞生长因子的添加量进行细胞生长因子的添加。
实施例四
采用以下步骤制备具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为1800rpm，离心时间为3min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中 40min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液，DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在30℃的温度条件下搅拌2h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入聚丙二醇二缩水甘油醚和血管内皮细胞生长因子，放入50℃的恒温水浴锅中5h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天，得到自体胶原蛋白凝胶，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:2:2。按照10ml混合溶液中加入3mg的血管内皮细胞生长因子的添加量进行细胞生长因子的添加。
实施例五
采用以下步骤制备具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为2000rpm，离心时间为2min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中 30min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液， DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在30℃的温度条件下搅拌2h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入1，6-己二醇二缩水甘油醚和血管内皮细胞生长因子，放入50℃的恒温水浴锅中 5h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天，得到自体胶原蛋白凝胶，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:2:4。按照10ml混合溶液中加入3mg的血管内皮细胞生长因子的添加量进行细胞生长因子的添加。
实施例六
采用以下步骤制备具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，离心速度为2500rpm，离心时间为2min，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中 30min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液， DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下， 5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的 DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养20h，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；由于胶原蛋白为自体的成纤维细胞产生的，因此作为注射填充物能有效降低排异反应；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在30℃的温度条件下搅拌2h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入乙二醇二缩水甘油醚和血管内皮细胞生长因子，放入50℃的恒温水浴锅中5h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天，得到自体胶原蛋白凝胶，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:2:5。按照10ml混合溶液中加入5mg的血管内皮细胞生长因子的添加量进行细胞生长因子的添加。
上述自体胶原蛋白凝胶无毒副作用，具有较好的生物相容性和组织相容性，可以作为医学美容中的机体组织填充物，其中的血管内皮细胞生长因子能够促进填充后皮下血管的愈合生长，促进血液循环，滋润肌肤，消除皱纹和预防色斑，具有很好的美容功效。
在上述实施例中，多组份溶液混合在没有特别说明的情况下均按照质量百分比进行混合。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明实施例的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，获取自体成纤维组织，在常温下用生理盐水清洗，将自体成纤维组织剪成小块，向其中加入磷酸缓冲盐溶液混合，室温下离心去除下层液体，用磷酸缓冲盐溶液冲洗后再次离心，去除上清液，加入胶原酶，放置于37℃恒温震荡箱中30min～60min，再次离心去除上清液，然后加入含有胎牛血清的DMEM培养液，用细胞筛过滤后离心去除上清液，再次加入含有胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃温度条件下，5％CO2恒温培养；
步骤二，传代培养，将步骤一的成纤维细胞每隔2天更换胎牛血清的DMEM培养液，待细胞生长至80％融合后用胰蛋白酶消化后传代，在成纤维细胞生长三代以后，从胎牛血清的DMEM培养液重取出；
步骤三，胶原蛋白积累，将成纤维细胞放入无血清培养基，在37℃无血清培养基中培养，使成纤维细胞分泌出胶原蛋白，将成纤维细胞和无血清培养基取出，留存胶原蛋白备用；
步骤四，加入玻尿酸，向步骤三中的胶原蛋白中加入玻尿酸，在25℃～30℃的温度条件下搅拌1h～3h后静置；
步骤五，凝胶的制备，向步骤四中静置后的混合溶液中加入交联剂，放入45℃～55℃的恒温水浴锅中3h～6h，然后置于无热源蒸馏水中透析3天～5天，得到自体胶原蛋白凝胶。
2.如权利要求1所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤一和步骤二中，DMEM培养液中胎牛血清的含量为15％。
3.如权利要求1所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤一中，离心速度为1000rpm～2500rpm，离心时间为2min～5min。
4.如权利要求1所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤二中，胰蛋白酶为质量分数为0.25％的胰蛋白酶。
5.如权利要求1所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤三中，首先取出无血清培养基，然后用50k超滤膜过滤，再用0.22μm的滤膜过滤，得到胶原蛋白。
6.如权利要求1所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤五中，交联剂为乙二醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚中的任一种。
7.如权利要求1所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤五中，混合溶液中胶原蛋白、玻尿酸、交联剂三者的体积比为1:1～2:2～9。
8.如权利要求7所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤五中，混合溶液中还加入有血管内皮细胞生长因子。
9.如权利要求8所述的一种具有玻尿酸的自体胶原蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤五中，每10ml混合溶液中加入血管内皮细胞生长因子1mg～5mg。
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