CN105596372A - 一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗各种严重皮肤损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本文详细提供了一种利用自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）临床治疗各种严重皮肤损伤的新方法，包括BMSCs的分离、提取、培养、扩增和细胞制剂的制备及临床操作方法。本发明基于BMSCs能分泌促使内皮细胞生长的细胞因子和分化成新的皮肤组织细胞的潜能及其消炎作用、再生损伤的皮肤组织的特点；其优势在于BMSCs具有自体来源避免了伦理学争议，无免疫排斥反应、易于操作且无传染风险等。此方法治疗时间短，再生修复效果佳，弥补了目前临床常用治疗方法对严重皮肤损伤治愈率低的缺点。

Description

一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗各种严重皮肤损伤的方法

技术领域

本发明属于再生医学技术领域，涉及体外分离、扩增骨髓间充质干细胞，以及制备生物制剂治疗皮肤损伤等技术。

背景技术

皮肤是人体的第一道天然防御屏障，具有防止体液流失，阻挡外界的细菌病毒和异物等诸多功能，对人体起到保护作用。当皮肤受到损伤时，要立即进行治疗使伤口闭合，否则会产生一系列并发症状如体内电解质紊乱、免疫平衡失调、脓毒症、弥散性血管内凝血等，严重时会危及生命。随着现代医疗水平的提高，目前对于皮肤损伤已有突破性的治疗方法，主要有金属Ag及其衍生制剂、皮肤移植、人造皮肤等，但仍有一半以上的损伤对治疗保持抗性，导致伤口长期不能愈合。一些严重性皮肤损伤，如：糖尿病足、急慢性皮肤溃烂、严重烧伤和创伤及皮肤癌等，目前没有有效的治疗手段。在我国每年新增约70万例严重性皮肤损伤的患者，而患者无法得到有效的治疗，长期处于痛苦之中。

金属Ag及其衍生制剂作为化学药物治疗法，在临床上应用较多。虽然此方法对于抗感染具有较好的疗效，但近年来许多研究表明此方法对皮肤组织有毒性，不利于损伤部位皮肤再生。皮肤移植法虽然能在短时间内使创伤部位闭合，但由于自体皮肤有限，对于较大面积的皮肤损伤仍无能为力，而异体皮肤移植存在免疫排斥，有一定风险。人造皮肤通常是使用动物胶原组织制备人工皮肤，虽然人造皮肤可以批量化生产供应，但其不具有自身皮肤的柔韧性，也不能促进自身皮肤的生长。上述三种常用方法用于皮肤损伤治疗后的复发率较高。目前还有一些利用皮肤细胞体外培养制备的人工皮肤，但存在移植后降解过快、疤痕较重等问题，也限制了其在临床上的应用。因此，寻找一种对于皮肤损伤治疗安全性强、治愈率高，术后副作用小的方法已成为临床上的热门研究课题。

近年来干细胞治疗作为一种新的治疗人类疾病的途径被广泛关注，早在2002年Science就将其列为年度值得关注的六大热门科技领域之首。骨髓间充质干细胞（BoneMarrowStemCells,BMSCs）是一种来自人体骨髓组织中的单核细胞，且具有多种分化潜能。本发明采用自体BMSCs，除具有易于获取、易于体外扩增培养、临床应用安全性高等特点外，更避免了伦理学争端。研究表明BMSCs可分化为血管细胞、成纤维细胞、表皮细胞等皮肤再生的重要组成部分，为干细胞治疗皮肤损伤提供了理论依据。本发明通过将自体扩增的BMSCs涂抹到患者皮肤创伤部位表面或采用喷剂、敷疗的方法作用于伤患处，利用干细胞的趋化性和损伤部位的人体微环境，定向分化为相应皮肤组织，使损伤部位快速愈合。BMSCs与传统方法治疗皮肤损伤相比具有治愈时间短，治疗后损伤部位复原效果好等优势，具有广阔的临床研究价值和市场前景。

发明内容

本发明运用的核心技术为BMSCs的体外分离提取和培养扩增、BMSCs细胞制剂的制备以及临床治疗技术的实施和操作。

骨髓采集：将皮肤消毒后，利用一次性骨髓穿刺针从患者两侧髂后上肌各采集骨髓30毫升，每侧采集三个点，每个点采集10毫升骨髓。在洁净低温下，采集的骨髓样本立即送往GMP实验室进行间充质干细胞的分离和提取。

骨髓有核细胞（BoneMarrowNucleusCells，BNCs）的分离提取：骨髓在450rpm/min下离心6-8min，上半部透明部分转移到新的锥形管。在1500rpm/min下离心6min，沉淀有核细胞。将上清取出与RBCs骨髓液混合后再次离心，得到更多有核细胞。用PBS悬浮有核细胞并进行计数。

自体富含血小板血清（PlateletRichPlasma，PRP）的制备：将患者自体外周血在450rpm/rpm下离心20min。离心后小心取出不含任何红细胞（RedBloodCells，RBCs）的上层血清，获得自体PRP。

自体血小板裂解液（PlateletLysate，PL）的制备：将制备的PRP立刻置于-20℃下进行冷冻，冷冻后立即放入37℃水浴中解冻，获得PL。

自体不含血小板血清（PlateletPoorPlasma，PPP）制备：将制备PRP后剩余的外周血在1500rpm/min条件下离心10min，小心将上清收集，得到PPP后，并立即冷冻保存。

BMSCs的分离提取与培养扩增：将BNCs分离提取步骤中获得的细胞接种到培养瓶中。加入DMEM+10%自体PL的培养液置于37℃、饱和湿度、5%的CO₂浓度的培养箱内开始原代培养，每2～3天更换一次培养液，去除未贴壁的细胞。培养7天左右时，用0.25%胰酶消化后离心收集细胞，重复上述步骤继续传代培养，传代所用培养液为AMEM+10%自体PL。

BMSCs的冻存：自体PPP和99%二甲基亚砜（DMSO）按体积比9:1的比例缓慢混匀配成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min。将细胞悬浮在冻存液中，并分装到冻存管中，利用程序降温仪将细胞降温至-80℃后转移到液氮罐中长期保存。

细胞制剂制备：根据患者的实际需求选取P2或P3代的BMSCs，收集细胞制备成一定比例的细胞制剂。将制备好的细胞制剂于24h内移植于患者损伤部位。

如骨髓采集所述：将皮肤常规消毒后，对患者进行局部麻醉，利用肝素化的骨髓穿刺针从髂骨的顶端采集骨髓，4℃保存，待工作人员取样。

如BMSCs冻存过程所述：以1℃/min降至-4℃，然后以10℃/min降至-20℃，再以1℃/min降至-40℃，最后以10℃/min降至-80℃，取出冻存管迅速放入液氮罐中长期保存。

如细胞制剂制备所述：每1ml细胞制剂组成成分包括：1~3×10⁶个BMSCs、1ml自体PRP、20~50mmol的CaCl₂、10~50单位的凝血酶、10~30ug表皮生长因子，环丙沙星10ug。每平方厘米损伤面积所用细胞制剂量为0.1ml。

与现有技术相比，本发明优点在于：公开了一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗严重皮肤损伤的方法，包括BMSCs的分离、培养和冻存以及BMSCs制剂的制备和临床应用方法。BMSCs取自患者自体，避免了疾病传播的危险和免疫排斥反应。本方法采用移植的方式为患者治疗，其时间短，过程简单，可操作性强。使用该方法治疗各种严重性皮肤损伤，能够更快更好的使伤口愈合，减少患者痛苦。

BMSCs移植到伤口表面后会促进产生转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)、P物质等生物活性物质，能够促进损伤部位组织再生，迅速使伤口愈合。且通过此方法治疗后的再生组织和人工皮肤或药物治疗相比，更接近损伤前的组织形态，提高治疗后患者的生活质量。

附图说明

图1是BMSCs培养第3天图；图2是BMSCs培养第4天图；图3是BMSCs培养第5天图；

图4是BMSCs培养第6天图；图5是BMSCs培养第7天图；图6是临床治疗图1图；图7是临床治疗图2图。

具体实施方式

具体实施方式一：BMSCs的分离提取和培养扩增。

（1）患者骨髓及外周血采集：通过表皮常规消毒和局部麻醉，利用一次性肝素化的骨髓穿刺针在髂后上肌多点采集骨髓30~50ml。同时采集150-200ml外周血，立即于低温条件下送到GMP实验室。

（2）发明所用试剂：DMEM、AMEM和PBS购自GIBCO公司。胰蛋白酶购自Invirogen公司。青霉素和链霉素购自Sigma公司。发明中所用骨髓间充质干细胞培养液比例为：90%的DMEM或者AMEM、10%自体PRP、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。

（3）BMSCs的分离提取：将骨髓450rpm/min离心6-8min，含有有核细胞的上半部应非常透明，下半部分为有血红细胞（RBC）沉淀的骨髓液。上半部转移到新的锥形管，1500rpm/min离心6min后取出有核细胞沉淀。将上清与RBC骨髓液混合，再次离心以得到更多有核细胞。用一定量PBS重悬有核细胞，得到细胞悬液并进行计数。

（4）自体PRP的制备：将患者自体外周血在450rpm/rpm下离心20min。离心后小心取出不含任何RBCs的上层血清，获得自体PRP。

（5）自体PL的制备：将制备的PRP立刻置于-20℃下进行冷冻，冷冻后立即放入37℃水浴中解冻，获得PL。

（6）不含血小板的血清（PPP）制备：将制备PRP后剩余的外周血在1500rpm/min下离心10min，小心将不含有RBCs的上清取出，得到PPP，并立即冷冻保存。

（7）自体BMSCs的分离提取与培养扩增：将BNCs分离提取步骤中获得的细胞接种到培养瓶中。加入DMEM+10%自体PL的培养液置于37℃、饱和湿度、5%的CO₂浓度的培养箱内开始原代培养，每2～3天更换一次培养液，去除未贴壁的细胞。培养7天左右时，用0.25%胰酶消化后离心收集细胞，继续传代培养传代所用培养液为AMEM+10%自体PL。

（8）骨髓间充质干细胞的冻存：将准备冻存的骨髓间充质干细胞于冻存前一日全部换液。将自体PPP和99%二甲基亚砜按体积比9:1的比例缓慢混匀配成冻存液，放入冰水混合物中预冷15～20min。利用冻存液悬浮BMSCs沉淀，并将细胞悬浮液转移到冻存管中，利用程序降温仪将细胞降温至-80℃后转移到液氮罐中长期保存。

具体实施方式二：骨髓间充质干细胞的鉴定。

将第P2或P3代的BMSCs用0.25%胰酶进行消化后，用PBS洗2次，制备成1×10⁶/ml细胞悬液，分别加入荧光标记的CD45、CD34、CD44、CD71、CD105、CD106、CD29、CD90单克隆抗体，4℃下孵育30min，PBS洗2次，加入500μl的PBS混合均匀后进行流式细胞仪检测，同时设立同型IgG对照管。从结果可以分析出，3、4、5代的BMSCs的CD44、CD71、CD105、CD106等成抗原阳性，CD45和CD34成阴性，证明所培养后的细胞为骨髓间充质干细胞。

具体实施方式三：治疗用细胞制剂的制备。

收集P2~P3代BMSCs，每1ml细胞制剂所含物质包括：1~3×10⁶个BMSCs、1ml自体PRP、20~50mmol的CaCl₂、10~50单位的凝血酶、10~30ug表皮生长因子、10ug环丙沙星，制备后的细胞制剂必须在24h内使用。细胞制剂可通过喷涂或将其附着在创伤敷料上作用于患者皮肤损伤部位。

具体治疗实例一：自体BMSCs治疗严重皮肤损伤临床试验。

1.病例选择：选取糖尿病足患者，进行常规检测后，经患者签署知情通知书进行临床治疗。

2.治疗方法：采集患者骨髓并分离提取骨髓间充质干细胞，经体外扩增培养BMSCs后根据患者伤口部位大小及溃烂程度进行对应剂量的细胞制剂的制备。术前取30ul的细胞制剂对患者进行皮试，观察有无异常反应。皮试无异常反应后，用本发明制备的细胞制剂喷涂于患者伤口表面，每1cm²损伤面积使用0.1ml细胞制剂。3小时内观察患者伤口部分是否有疼痛或红肿等异常状况发生。

3.治疗效果分析：患者在接受治疗后的第4周、第8周、第12周、第24周后进行复查，观察伤口部位的愈合情况。结果表明：通过本发明治疗后，患者皮肤损伤部位愈合情况良好。治疗后愈合部位无明显疤痕存在，更接近于治疗前自身皮肤性状。

Claims (14)

1.一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗严重皮肤损伤的方法，其特征在于采集患者自体骨髓进行BMSCs的分离提取和培养扩增，并利用自体血小板裂解液（PL）加入培养液中进行细胞培养，实现完全自体干细胞技术的利用。

2.如权利要求书1所述，临床治疗的皮肤损伤包括：各种急慢性皮肤溃烂，糖尿病足，各种严重大面积皮肤损伤和烧伤，皮肤癌术后的皮肤愈合治疗等。

3.如权利要求书1所述，骨髓MSCs的分离采用直接密度梯度离心方法，在450rpm/min下离心20min。

4.如权利要求书1所述，细胞培养液为90%的DMEM外加10%自体PL和AMEM添加10%自体PL，其中含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。

5.如权利要求书1所述，自体富含血小板的血清（PRP）是通过患者自体外周血在450rpm/min下离心20min后，取上清部分获取。

6.如权利要求书1和5所述，自体PL是将已制备的PRP立刻置于-20℃下进行冷冻，冷冻后立即放入37℃水浴中解冻后获得。

7.如权利要求书1所述，冻存BMSCs所用的冻存液为自体不含血小板的血清（PPP）和二甲基亚砜，比例为9:1。

8.如权利要求书1和7所述，自体PPP制备是由制备PRP后剩余的外周血经1500rpm/min离心10min后获得。

9.一种利用自体骨髓间充质干细胞治疗各种严重皮肤损伤的方法，其特征在于利用扩增的BMSCs制备细胞制剂，并用于皮肤损伤的治疗。

10.如权利要求书9所述，制备细胞制剂所用BMSCs为P2或P3代细胞。

11.如权利要求书9所述，根据损伤面积选择细胞制剂量用于治疗患者，每平方厘米损伤面积所用细胞制剂量为0.1毫升。

12.如权利要求书9所述，每1ml细胞制剂所含物质包括：1~3×10⁶个BMSCs、1ml自体PRP、20~50mmol的CaCl₂、10~50单位的凝血酶、10~30ug表皮生长因子、10ug环丙沙星，制备后的细胞制剂必须在24h内使用。

13.如权利要求书9所述，细胞制剂可利用针管喷涂移植到患者皮肤损伤部位。

14.如权利要求书9所述，细胞制剂也可通过附着于创伤敷料上帖服于损伤处。