CN111760064A - 一种用于治疗糖尿病足的敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及医学技术领域，公开了一种用于治疗糖尿病足的敷料，包括纱布层、自体骨髓间充质干细胞层和自体血小板凝胶层；还公开了一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，包括如下步骤：步骤一：制备自体骨髓间充质干细胞；步骤二：制备自体血小板凝胶；步骤三：制备敷料。本申请中的敷料，使用时一步到位，使用方便，不易发生感染；敷料直接作用于溃疡处，伤口愈合的速度快；敷料包含生长因子的来源更加丰富，可相互补充，具有一定的协同作用，可进一步提高创面愈合的速度。

Description

一种用于治疗糖尿病足的敷料及其制备方法
技术领域
本发明属于医学技术领域。
背景技术
糖尿病足溃疡是糖尿病的一种严重并发症，在糖尿病的治疗中面临着巨大的挑战。据《柳叶刀》报道，2010年全球外周动脉疾病患者超过2亿。糖尿病足溃疡治疗和护理不当易引发截肢，85％以上的糖尿病患者截肢起因于糖尿病足溃疡，该病是糖尿病患者致残的主要原因，且糖尿病足溃疡治疗护理费用高昂，每位患者平均住院费用2.4万元，对患者及其家庭以及社会带来巨大的压力和经济负担。
目前，糖尿病足溃疡患者可能的治疗选择包括药物、清创、敷料等，对于糖尿病足溃疡患者的复杂病变，治疗效果不理想，往往导致截肢、发病率和死亡率等不良结局。糖尿病足溃疡具有不同于普通皮肤溃疡的特殊发病机制，现有的敷料没有对糖尿病足溃疡的特殊性进行针对性治疗，因此其在促进创面愈合方面始终不尽如人意。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗糖尿病足的敷料及其制备方法，以解决糖尿病足溃疡的创面难以愈合、愈合速度慢的问题。
为了达到上述目的，本发明的基础方案提供一种用于治疗糖尿病足的敷料，包括纱布层，所述纱布层上依次涂覆有自体骨髓间充质干细胞层和自体血小板凝胶层。
本基础方案的原理和有益效果在于：
(1)本方案中的敷料，使用时一次消毒后直接敷在溃疡表面即可，一步到位，不需要反复消毒，使用方便，且不易发生感染；且敷料直接作用于溃疡创面处，创面愈合的速度快；同时，由于自体骨髓间充质干细胞与自体血小板凝胶共同作用于溃疡创面，其包含的生长因子、抗炎细胞等的浓度高，促进创面愈合的速度快，生长因子的来源更加丰富，可以相互补充，并具有一定的协同作用，可进一步提高创面愈合的速度。
(2)本方案中的自体骨髓间充质干细胞层，其自体骨髓间充质干细胞属于分化层细胞，具有修复作用，此外，自体骨髓间充质干细胞可分泌生长因子，促进创面皮肤的生长；同时，自体骨髓间充质干细胞可以促进血管内皮细胞的生长，在创面形成血管，增加供血，而且对炎症有平衡作用，对局部炎症的控制有好处。
(3)本方案中的自体血小板凝胶里面包含了多种生长因子，促进创面的愈合和生长，里面的免疫细胞能够起到一定的免疫作用，增强免疫功能，减少炎症，起到抗菌、抗微生物的作用。
可选地，还包括保护膜片层，保护膜片层覆盖在自体血小板凝胶层上，且保护膜片层的边部贴附在纱布层上。
保护膜片层覆盖在自体血小板凝胶层上，且保护膜片层的边部贴附在纱布层上，能够对自体血小板凝胶层和自体骨髓间充质干细胞层起到保护作用，降低自体血小板凝胶层和自体骨髓间充质干细胞层在使用前被污染的几率，使用时将保护膜片层撕下即可，使用方便。
可选地，还提供了一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：制备自体骨髓间充质干细胞，包括：
S1：自体血清的制备：无菌条件下抽取患者静脉血20ml，低温冷凝静脉血3-6h，然后离心10-20min，取上清液，用滤器对上清液过滤除菌，得到血清，将血清冻存于冰箱中；
S2：骨髓采集：确定患者的穿刺进针点，用5ml的2％利多卡因逐层浸润麻醉至患者骨膜，用骨穿针垂直于骨平面缓慢进针，抽出20ml骨髓用于培养，放入含保养液的血袋中；
S3：干细胞的分离培养：用生理盐水稀释采集到的骨髓，吸取骨髓稀释液加入到淋巴细胞分离液上，室温下离心10-30min；吸取离心管中的白膜层并转移到洁净离心管中，加生理盐水洗涤后离心8-15min；细胞沉淀用20ml完全培养基重新悬浮并放入两个培养皿中，将培养皿放置于二氧化碳培养箱培养；去除未贴壁细胞，待贴壁细胞融合80-90％时，用0.25％胰酶消化传代；贴壁细胞体外扩增3代，胰酶消化洗涤后用生理盐水稀释成自体骨髓间充质干细胞悬浮液；
S4：细胞鉴定、安全性检测：取部分自体骨髓间充质干细胞悬浮液进行细胞鉴定、安全性检测，其余供制作敷料用；
步骤二：制备自体血小板凝胶，包括：
S1：无菌条件下抽取患者静脉血8-50ml，放置在含3％柠檬酸钠的真空血管中，进行第一次离心作用；
S2：离心后，吸取上清液、白膜层和白膜层与红细胞之间的上清液并转移到离心管中，进行第二次离心；
S3：弃去上清液3/4，剩余1/4为富血小板血浆；
S4：富血小板血浆中注入10％葡萄糖酸钙溶液，并按1000U凝血酶粉加入1ml的10％葡萄糖酸钙溶液的比例，混合制成自体富血小板凝胶；
步骤三：制备敷料：将自体骨髓间充质干细胞层喷涂在纱布层上，自体血小板凝胶层涂覆在自体骨髓间充质干细胞层上，或者自体骨髓间充质干细胞层喷涂在制成的自体血小板凝胶层上，然后在整体附着在纱布层上，形成敷料。
采用这种制备方法制备所得的敷料，抗炎抗菌效果好，促进创面愈合，提高愈合速度，对糖尿病足溃疡的治疗具有比较显著的疗效。此外，采用这种制备方法制备敷料，制备方法简单可行，所用到的设备、仪器均为医学实验室常用的设备、仪器，容易获取且操作方便，给敷料的制备提供了便利。
可选地，所述步骤一的S1中，冷凝静脉血的时间为4h，冷凝静脉血的温度为3—10℃。
如此冷凝静脉血，其冷凝效果较好。
可选地，所述步骤一的S1中，血清冻存的温度为-15℃—-25℃。
在冻存温度为-15℃—-25℃的条件下，血清的冻存效果较好。
可选地，所述步骤一的S3中，骨髓稀释液与淋巴细胞分离液的混合液的离心速度为1800-2000r/min。
在该离心速度范围下，骨髓稀释液与淋巴细胞分离液的混合液的离心效果较好比较理想。
可选地，所述步骤一的S3中，白膜层的离心速度为1500r/min。
在该离心速度范围下，白膜层的离心效果较好比较理想。
可选地，所述步骤一的S4中，细胞安全性检测包括细菌培养实验、真菌培养试验、支原体检测、内毒素检测。
通过细菌培养实验、真菌培养试验、支原体检测、内毒素检测，能够对细胞进行比较全面的安全性检测。
可选地，所述步骤二的S1中，第一次离心作用为：离心力160xg，离心半径为13cm，离心时间20min。
在该离心条件下，静脉血的离心效果最好。
可选地，所述步骤二的S2中，第二次离心作用为：离心力为400xg，离心半径为13cm，离心时间为15min。
在该离心条件下，上清液的离心效果最好。
附图说明
图1为本发明一种用于治疗糖尿病足的敷料及其制备方法中的敷料的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
说明书附图中的附图标记包括：纱布层1、自体骨髓间充质干细胞层2、自体血小板凝胶层3、保护膜片层4。
实施例
一种用于治疗糖尿病足的敷料，结合附图1所示，主要由依次设置的纱布层、自体骨髓间充质干细胞层2和自体血小板凝胶层3构成，自体骨髓间充质干细胞层2喷涂在纱布层上，而自体血小板凝胶层3则涂覆在自体骨髓间充质干细胞层2上，或者自体骨髓间充质干细胞层2喷涂在制成的自体血小板凝胶层3上，然后在整体附着在纱布层上。自体血小板凝胶层3面向患者溃疡的创面处。可在自体血小板凝胶层3上覆盖一层保护膜片，形成保护膜片层4，保护膜片层4覆盖在自体血小板凝胶层3上，且保护膜片层4的边部贴附在纱布层上，使用时撕下即可使用。
一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：制备自体骨髓间充质干细胞，包括：
S1：自体血清的制备：无菌条件下抽取患者静脉血20ml，3—10℃下冷凝静脉血3-6h，然后离心10-20min，取上清液，用滤器对上清液过滤除菌，得到血清，将血清冻存于冰箱中。
优选地，本实施例采用4℃下冷凝静脉血4h，离心15min，离心力为1800xg，上清液经0.2μm孔径大小的滤器过滤除菌，得到的血清冻存与-20℃冰箱中。
S2：骨髓采集：在手术室患者取俯卧位，选双侧髂后上棘为穿刺进针点；安尔碘局部消毒后，带无菌手套，铺无菌洞巾；2％利多卡因5ml逐层浸润麻醉至骨膜，用16号骨穿针垂直于骨平面缓慢进针，有落空感时拔出针芯，抽出20ml骨髓用于培养，放入含保养液的血袋中送实验室。拔出骨髓穿刺针，拔针后局部压迫止血，未见活动性出血后，穿刺点消毒，无菌纱布包扎，嘱患者保持局部干燥3天。
S3：干细胞的分离培养：在无菌超净台上将采集的骨髓用2倍量的生理盐水稀释,吸取稀释液小心加在淋巴细胞分离液上(骨髓稀释液与淋巴细胞分离液的份例为2∶1)。室温下离心20min,离心速度为1800-2000r/min。小心吸取离心管中白膜层,转移至洁净离心管中,加2倍的生理盐水洗涤2次,离心速度为1500r/min,离心时间10min。骨髓稀释液与淋巴细胞分离液混合后的细胞沉淀用20ml完全培养基(10％的自体血清+α-MEM培养基)重新悬浮并放入两个培养皿(直径10cm)中，放置在二氧化碳培养箱(37℃，5％二氧化碳)培养。2-3天换液一次，去除未贴壁细胞，待贴壁细胞融合80-90％时，用0.25％胰酶消化传代。传代时按4000cells/cm2的密度进行。贴壁细胞体外扩增3代，胰酶消化洗涤后用22ml生理盐水稀释成自体骨髓间充质干细胞悬浮液。
S4：细胞鉴定、安全性检测：取部分自体骨髓间充质干细胞悬浮液进行细胞鉴定、安全性检测，其余供制作敷料用。其中，细胞鉴定采用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原(CD29，CD71，CD90,CD105，CD34，CD45)，安全性检测包括细菌培养实验、真菌培养试验、支原体检测、内毒素检测。
步骤二：制备自体血小板凝胶，包括：
S1：无菌条件下抽取患者静脉血8-50ml，放置在含3％柠檬酸钠的真空血管中，进行第一次离心作用；第一次离心作用为：离心力160xg，离心半径为13cm，离心时间20min。
S2：离心后，吸取上清液、白膜层和白膜层与红细胞之间的上清液并转移到离心管中，进行第二次离心；第二次离心作用为：离心力为400xg，离心半径为13cm，离心时间为15min。
S3：弃去上清液3/4，剩余1/4为富血小板血浆。
S4：富血小板血浆中注入10％葡萄糖酸钙溶液，并按1000U凝血酶粉加入1ml的10％葡萄糖酸钙溶液的比例，混合制成自体富血小板凝胶。
步骤三：制备敷料：将自体骨髓间充质干细胞层2喷涂在纱布层上，自体血小板凝胶层3涂覆在自体骨髓间充质干细胞层2上，或者自体骨髓间充质干细胞层2喷涂在制成的自体血小板凝胶层3上，然后再整体附着在纱布层上，形成敷料。最后在自体血小板凝胶层3上覆盖一层保护膜片，形成保护膜片层4。
本实施例中，选取15名年龄在18-75岁、溃疡创面面积和情况相似的糖尿病足溃疡患者，均分为3组，具体情况如下：
第一组：接受传统的治疗方案。
第二组：患者在接受传统治疗方案的基础上，给予患者自体骨髓充质干细胞(细胞数：1-2×108/L)10ml在创面周边分点肌肉注射，注射完毕后均匀地将制好的血小板凝胶(血小板计数：1100-1200×109/L)敷在溃疡表面，稳定后在表面放置凡士林纱布，每周更换一次。
第三组：患者在接受传统治疗方案的基础上，将本实施例制备所得的敷料，直接贴敷在患者的溃疡创面上，每周更换一次敷料。
三组患者治疗前的数据如下表所示：
表1
Figure BDA0002649370560000061
从表1可以看出，各组之间的所有指标无显著性差异，具有可比性。
连续治疗3个月后的数据如下表所示：
表2
Figure BDA0002649370560000062
Figure BDA0002649370560000071
从表2可以看出，干预3个月后，从白细胞来看，均恢复到正常范围，虽有差异(P<0.05)，但无临床意义；从溃疡面积来看，第三组患者的伤口溃疡面积最小，恢复情况最好(P<0.05)，其次是第二组患者，最后是第一组患者；从经皮氧分压TcPO2的改善情况来看，第三组患者的TcPO2最高，恢复情况最好(P<0.05)，其次是第二组患者，最后是第一组患者，而各组的ABI无显著差异(P>0.05)。由此可见，采用本实施例提供的敷料对糖尿病足患者的溃疡进行治疗，与单纯采用传统治疗方案，或在传统治疗方案的基础上，利用自体骨髓充质干细胞在创面周边分点肌肉注射，再敷上自体血小板凝胶的方案相比，创面愈合速度更快，治疗效果更好，其机制可能是干细胞加上自体血小板凝胶比单纯的自体血小板凝胶和传统治疗方法能更有效的增加局部的经皮氧分压，改善伤口局部缺血缺氧和微循环的重建，从而加速局部伤口的愈合。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种用于治疗糖尿病足的敷料，其特征在于：包括纱布层，所述纱布层上依次涂覆有自体骨髓间充质干细胞层和自体血小板凝胶层。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料，其特征在于：还包括保护膜片层，保护膜片层覆盖在自体血小板凝胶层上，且保护膜片层的边部贴附在纱布层上。
3.一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：制备自体骨髓间充质干细胞，包括：
S1：自体血清的制备：无菌条件下抽取患者静脉血20ml，低温冷凝静脉血3-6h，然后离心10-20min，取上清液，用滤器对上清液过滤除菌，得到血清，将血清冻存于冰箱中；
S2：骨髓采集：确定患者的穿刺进针点，用5ml的2％利多卡因逐层浸润麻醉至患者骨膜，用骨穿针垂直于骨平面缓慢进针，抽出20ml骨髓用于培养，放入含保养液的血袋中；
S3：干细胞的分离培养：用生理盐水稀释采集到的骨髓，吸取骨髓稀释液加入到淋巴细胞分离液上，室温下离心10-30min；吸取离心管中的白膜层并转移到洁净离心管中，加生理盐水洗涤后离心8-15min；细胞沉淀用20ml完全培养基重新悬浮并放入两个培养皿中，将培养皿放置于二氧化碳培养箱培养；去除未贴壁细胞，待贴壁细胞融合80-90％时，用0.25％胰酶消化传代；贴壁细胞体外扩增3代，胰酶消化洗涤后用生理盐水稀释成自体骨髓间充质干细胞悬浮液；
S4：细胞鉴定、安全性检测：取部分自体骨髓间充质干细胞悬浮液进行细胞鉴定、安全性检测，其余供制作敷料用；
步骤二：制备自体血小板凝胶，包括：
S1：无菌条件下抽取患者静脉血8-50ml，放置在含3％柠檬酸钠的真空血管中，进行第一次离心作用；
S2：离心后，吸取上清液、白膜层和白膜层与红细胞之间的上清液并转移到离心管中，进行第二次离心；
S3：弃去上清液3/4，剩余1/4为富血小板血浆；
S4：富血小板血浆中注入10％葡萄糖酸钙溶液，并按1000U凝血酶粉加入1ml的10％葡萄糖酸钙溶液的比例，混合制成自体富血小板凝胶；
步骤三：制备敷料：将自体骨髓间充质干细胞层喷涂在纱布层上，自体血小板凝胶层涂覆在自体骨髓间充质干细胞层上，或者自体骨髓间充质干细胞层喷涂在制成的自体血小板凝胶层上，然后再整体附着在纱布层上，形成敷料。
4.根据权利要求3所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤一的S1中，冷凝静脉血的时间为4h，冷凝静脉血的温度为3—10℃。
5.根据权利要求4所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤一的S1中，血清冻存的温度为-15℃—-25℃。
6.根据权利要求5所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤一的S3中，骨髓稀释液与淋巴细胞分离液的混合液的离心速度为1800-2000r/min。
7.根据权利要求6所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤一的S3中，白膜层的离心速度为1500r/min。
8.根据权利要求7所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤一的S4中，细胞安全性检测包括细菌培养实验、真菌培养试验、支原体检测、内毒素检测。
9.根据权利要求3所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤二的S1中，第一次离心作用为：离心力160xg，离心半径为13cm，离心时间20min。
10.根据权利要求9所述的一种用于治疗糖尿病足的敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤二的S2中，第二次离心作用为：离心力为400xg，离心半径为13cm，离心时间为15min。
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