CN112336748A - 从脐带血制备prp的方法及制备prp在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用 - Google Patents

从脐带血制备prp的方法及制备prp在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从脐带血制备PRP的方法及制备PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用，包括如下步骤：使用优选的离心力对脐带血进行第一次离心，去除下层的细胞层，使用优选的离心力将上层的血浆层进行第二次离心，用第二次离心后的上清(乏血小板血浆)调整血小板浓度为(1000±100)×109/L，即得PRP，加凝血酶制备成凝胶使用，或PRP和第二次离心后上清(乏血小板血浆)分别于‑20±2℃保存，使用时可根据需要调整血小板浓度。本制备方法在保证血小板高回收率的前提下降低了对离心力的要求，将制备好的脐带血PRP应用到糖尿病性难愈合创伤修复作用的实验研究中，能够很好地促进糖尿病性难愈合创伤的修复。

Description

从脐带血制备PRP的方法及制备PRP在制备糖尿病性难愈合创 伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种脐带血PRP的制备方法，尤其是利用低离心力获得高回收率脐带血富血小板血浆(PRP)的离心制备方法及PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用。
背景技术
富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是将新鲜全血通过特定离心方式得到的含高浓度血小板的血浆，是一种血小板浓缩物，通常为人体正常血小板浓度的3-5倍，含有大量的多种生长因子[Mussano F,Genova T,Munaron L,et al.Platelets. 2016；27(5):467-471]。1984年，Okuda等首先发现从血浆中提取出来的PRP中含有多种生长因子[Umeno Y,Okuda A,Kimura G.Cell Sci.1989；94:567-575]。随着PRP的研究的深入，1997年Whitman等率先将自体PRP制成血小板凝胶与自体骨或异体骨相结合用于口腔颌面外科手术得到了良好的临床疗效[Whitman DH,Berry RL,Green DM.Oral MaxillofacSurg.1997；55(11):1294-1299]。2018年，王泽蓉等应用同种异体PRP制成血小板凝胶治疗难愈合性创面患者也取得了良好的效果，愈合率达到86％[王泽蓉,范娅涵,张红等.临床血液学杂志.2018；31(12):895-897]。
PRP富含多种生物活性蛋白，较为经典的包括多种生长因子和抗菌肽等，用在创伤修复过程中的不同阶段可发挥不同的作用，促进伤口愈合及组织再生，因此已被广泛应用于临床领域，包括整形外科[Wang D,Rodeo SA.JBJS Rev.2017；5(9):e7]、骨科[FotouhiA,Maleki A,Dolati S,et al.Biomed Pharmacother.2018；104:652-660]、心肌再生[Spartalis M,Tzatzaki E,Nikiteas N,et al.Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017；21(18):3983-3984]和运动医学[Kaux JF,Emonds-Alt T.Platelets. 2018；29(3):213-227]等的治疗；加之PRP无论在体内或体外都具有一定的抑菌活性，并已经证明其对黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌等细菌均有抑制作用[Li T,Ma Y,Wang M,etal.Infect Drug Resist.2019；12:297-309]，特别是对慢性难愈性创面的愈合有促进作用[Ahmed M,Reffat SA,Hassan A,et al.Ann Vasc Surg.2017；38:206-211]，更使得PRP的应用越来越受到了临床的重视和关注。PRP技术已经成为治疗再生医学相关疾病的治疗手段。自体PRP技术已经成为医院临床治疗的收费项目。异基因PRP技术在广州军区总医院已经进行临床试验，得到非常好的治疗效果 [Umeno Y,Okuda A,Kimura G.J CellSci.1989；94:567-575]。
研究发现，脐带血PRP中的血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)这两种生长因子含量高于外周血PRP，而这两种生长因子正是促进组织再生的最重要的生长因子，脐血PRP具有更好的再生医学领域利用价值[Parazzi V,Lazzari L,Rebulla P. 2010；21(7):549-554]。国外相关研究如：2014年，Lorenzo等首次尝试用脐带血PRP治疗胸膜损伤[Rosso L,Parazzi V,Damarco F,et al.Blood Transfus.2014；12Suppl 1:s235-242]；2015年，Gelmetti等使用脐血血小板治疗表皮松懈症[Parazzi V,Lavazza C,Boldrin V,et al.Cell Transplant.2015；24(12):2573-2584]；2017年，Sindici 等应用脐血血小板治疗放化疗后口腔黏膜炎的治疗，都得到非常好的治疗效果[Piccin A, Rebulla P,Pupella S,et al.Transfusion.2017；57(9):2220-2224]。为此，意大利脐带血应用委员会成立了脐带血血小板胶应用小组，专门开发和应用脐带血的PRP[Paolo Rebulla,Simonetta Pupella,Michele Santodirocco,et al.Blood Transfus 2016；14:73-79]。在国内还没有相应的研究。
PRP的制备通常采用离心法，即通过改变对新鲜全血的离心次数和离心力大小，进而改变富血小板血浆凝胶的体外凝固时间和血块凝缩率，从而获得所需富血小板血浆的一种制备方法。通常手工离心制备富血小板血浆的方法根据盛装容器的不同，可以分为血袋离心法和离心管离心法，但是相比于离心管离心法，血袋离心法会使红细胞和白细胞的清除率大大降低而直接影响PRP的临床应用效果，因此手工离心制备PRP常采用离心管离心法。此外，根据离心次数的不同，又可分为一次离心法、二次离心法和三次离心法。一次离心法操作简单，但血小板回收率不足；三次离心法相比二次离心法而言，操作繁琐，也会导致回收率下降，因此，二次离心法更适合制备PRP。经典的二次离心法包括：①AGHALOO法：第1次215g离心10min，第2次863g离心10min；②PARAZZI法：第1次550g离心10min,第2次2000g离心15min；③PETRUNGARO法：第1次1500g离心6min，第2次1000g离心6min。[PetrungaroPS.Compend Contin Educ Dent.2001； 22(9):729-732,734,736,746；Parazzi V,LazzariL,Rebulla P.Platelets.2010； 21(7):549-554；康健,袁文.中国组织工程研究.2014；18(3):476-481]。但是，目前采用的二次离心法也存在血小板损伤严重、血小板回收率偏低和浪费资源等问题。血小板的损伤程度会影响制备出的PRP凝胶中VEGF和PDGF等因子的释放而影响PRP的功能，回收率偏低造成资源浪费的同时又限制了PRP产品的开发与应用。因此，需要一种在尽量清除掉血液中的红、白细胞的同时，又能在保持较高回收率的前提下降低血小板损伤的离心管分离脐带血PRP的方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种离心管两步离心法制备脐带血PRP的方法，本方法制备的脐带血PRP回收率高且保持了血小板较好的完整性。
本发明的第二目的在于从脐带血制备PRP的方法制得脐带血PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用，使用后能够很好地促进糖尿病性难愈合创伤的修复。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种从脐带血制备PRP的方法，包括以下步骤：
步骤1，第一次离心：脐带血以450±50g离心10min，得到的全血分为下层血细胞层和上层血浆层；
步骤2，第二次离心：取上层血浆层以1500±50g离心15min，离心后管底的白色沉淀为浓缩血小板，上清为乏血小板血浆；将第二次离心的上清全部吸出至一个新离心管中充分混匀，再将部分上清吸回到白色沉淀的浓缩血小板的离心管内，调整血小板浓度为(1000±100)×109/L，即得脐带血PRP。
还包括
步骤3，将制得的脐带血PRP和剩余的乏血小板血浆分别于-20±2℃保存，使用时根据血小板的浓度需求用同一人的乏血小板血浆调整血小板浓度。
或，还包括
步骤3，在制备好的1mL浓度为(1000±100)×109/L的脐带血PRP中加入100μL的PRP激活剂，静置1min后制备成脐带血PRP凝胶。
所述PRP激活剂为牛凝血酶和氯化钙混合物，其中，氯化钙终浓度为40mM，牛凝血酶终浓度为100U/mL。
上述的从脐带血制备PRP的方法制得脐带血PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明制备方法在保证血小板高回收率的前提下降低了对离心力的要求，将制备好的脐带血PRP应用到糖尿病性难愈合创伤修复作用的实验研究中，能够很好地促进糖尿病性难愈合创伤的修复。
附图说明
图1为本发明制备的脐带血PRP凝胶图。
图2为本发明制备的脐带血PRP凝胶修复糖尿病性难愈合创伤效果图。
图3为本发明制备的脐带血PRP凝胶修复糖尿病性难愈合创伤再上皮化率比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明从脐带血制备PRP的方法，包括以下步骤：脐带血以450±50g离心10min，得到的全血分为下层血细胞层和上层血浆层；取上层血浆层以1500±50g离心15min，离心后分为管底的白色沉淀(浓缩血小板)和上清(乏血小板血浆)；将第二次离心的上清(乏血小板血浆)全部吸出至一个新离心管中充分混匀，再将部分上清(乏血小板血浆)加入含有白色沉淀(浓缩血小板)的离心管内，调整血小板浓度为(1000±100) ×109/L，即得PRP，并将同一人的PRP和剩余乏血小板血浆分别于-20±2℃保存，使用时可根据血小板的浓度需求用同一人的乏血小板血浆调整血小板浓度。
本发明制备的脐带血PRP保存时血小板浓度均为(1000±100)×109/L，该浓度满足治疗需求，且同时保存第二次离心后的上清(乏血小板血浆)，使用时可根据需要调整浓度。
本发明还可以在制备好的1mL浓度为(1000±100)×109/L的脐带血PRP中加入100μL的PRP激活剂，静置1min后制备成脐带血PRP凝胶(如图1)。
所述PRP激活剂为牛凝血酶和氯化钙混合物，其中氯化钙的终浓度为40mM，牛凝血酶的终浓度为100U/mL。
本发明提供的生物制剂(脐带血PRP凝胶)新鲜使用，用于修复糖尿病大鼠模型的糖尿病性难愈合创伤(如图2、3)，效果显著。糖尿病对照组的创口的愈合速度在各个时间点均低于正常对照组；第21天时，正常对照组和脐带血PRP治疗糖尿病组创口再上皮化率分别达到89.8％和92.8％，而糖尿病组只有69.9％。脐带血PRP治疗糖尿病组创口愈合速度显著快于糖尿病对照组，能与正常对照组达到相似的愈合效果。
实施例1：新鲜脐血：PLT：183×109/L，RBC：3.47×1012/L，WBC：9.9×109/L，HCT：0.382
1)脐血袋置于室温水平摇床上混匀，用注射器从血袋中抽取脐血，以12mL/管分装于15mL离心管中，用封口膜封口，配平后放入离心机中，以22℃，400g，10min离心。
2)将离心后的上层血浆层全部取出于新离心管中，封口膜封口，配平后以22℃，1450g，15min离心。
3)将第二次离心后的上清(乏血小板血浆)转移到新的离心管中，混匀后吸回1mL溶解白色沉淀(浓缩血小板)。两次离心后的回收率及红、白细胞清除率如表1。
表1实施例1细胞清除率及回收率
Figure RE-GDA0002867620340000041
实施例2：新鲜脐血：PLT：183×109/L，RBC：3.47×1012/L，WBC：9.9×109/L，HCT：0.382
1)脐血袋置于室温水平摇床上混匀，用注射器从血袋中抽取脐血，以12mL/管分装于15mL离心管中，用封口膜封口，配平后放入离心机中，以22℃，500g，10min离心。
2)将离心后的上层血浆层全部取出于新离心管中，封口膜封口，配平后以22℃，1550g，15min离心。
3)将第二次离心后的上清(乏血小板血浆)转移到新的离心管中，混匀后吸回1mL溶解白色沉淀(浓缩血小板)。两次离心后的回收率及红、白细胞清除率如表2。
表2实施例2细胞清除率及回收率
Figure RE-GDA0002867620340000051
实施例3：新鲜脐血：PLT：183×109/L，RBC：3.47×1012/L，WBC：9.9×109/L，HCT：0.382
1)脐血袋置于室温水平摇床上混匀，用注射器从血袋中抽取脐血，以12mL/管分装于15mL离心管中，用封口膜封口，配平后放入离心机中，以22℃，450g，10min离心。
2)将离心后的上层血浆层全部取出于新离心管中，封口膜封口，配平后以22℃，1500g，15min离心。
3)将第二次离心后的上清(乏血小板血浆)转移到新的离心管中，混匀后吸回1mL溶解沉淀，吹打混匀/震荡混匀，取出100uL检测血小板浓度，其细胞清除率和回收率如表3。
4)根据检测结果用第二次离心后上清(乏血小板血浆)将其浓度稀释为(1000±100) ×109/L，即得到PRP。
5)取制备好的1mL浓度为(1000±100)×109/L的脐带血PRP中加入100μL的PRP 激活剂(牛凝血酶和氯化钙混合物：氯化钙浓度为40mM，牛凝血酶浓度100U/mL)，静置1min后制备成脐带血PRP凝胶。
6)得到的脐带血PRP凝胶新鲜使用，用于修复糖尿病大鼠模型的糖尿病性难愈合创伤，观察修复效果并计算再上皮率(如图2、3)。糖尿病对照组创口的愈合速度在各个时间点均低于正常对照组创口，治疗组创口愈合速度显著快于糖尿病对照组；第21天时，正常对照组、外周血PRP治疗组和脐带血PRP治疗组创口再上皮化率分别达到89.8％、 91.3％和92.8％，而糖尿病组只有69.9％。
表3实施例3细胞清除率及回收率
Figure RE-GDA0002867620340000052
对比例1：使用本发明方法与从经典方法中优选出的PARAZZI法(第1次550g离心10min；第2次2000g离心15min)进行对比
新鲜脐血：PLT：262×109/L，RBC：2.94×1012/L；WBC：4.3×109/L，HCT：0.312
1)脐血袋置于室温水平摇床上混匀，用注射器从血袋中抽取脐血，以12mL/管分装于15mL离心管中，分装4管，用封口膜封口。
2)配平后分别以本发明方法和PARAZZI法(第1次22℃，550g离心10min；第2 次22℃，2000g离心15min)离心。
3)将第二次离心后的上清(乏血小板血浆)转移到新的离心管中，混匀后吸回1mL溶解沉淀，吹打混匀/震荡混匀，取出100uL检测血小板浓度，其细胞清除率和回收率如表4。
4)本发明方法与从经典方法中优选出的PARAZZI法(第1次550g离心10min；第2 次2000g离心15min)在血小板回收率和细胞清除率上无明显差别。
表4对比例1细胞清除率及回收率
Figure RE-GDA0002867620340000061
本发明提供的脐带血PRP制备方法在较低的离心力要求下，能保证68％±3％的血小板回收率，红细胞清除率为99.85％±0.04％，白细胞清除率为99.20％±0.34％，与从经典方法(三种经典的二次离心管离心法优选见表5，①AGHALOO法血小板回收率为 30％±7％；②PARAZZI法血小板回收率为71％±5％；③PETRUNGARO法血小板回收率为 33％±4％。)中优选出的PARAZZI法的回收率无明显差别(P>0.05)。
表5三种经典方法制备PRP红、白细胞清除率及血小板回收率
Figure RE-GDA0002867620340000062
Figure RE-GDA0002867620340000071
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (5)

1.一种从脐带血制备PRP的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，第一次离心：脐带血以450±50g离心10min，得到的全血分为下层血细胞层和上层血浆层；
步骤2，第二次离心：取上层血浆层以1500±50g离心15min，离心后管底的白色沉淀为浓缩血小板，上清为乏血小板血浆；将第二次离心的上清全部吸出至一个新离心管中充分混匀，再将部分上清吸回到白色沉淀的浓缩血小板的离心管内，调整血小板浓度为(1000±100)×109/L，即得脐带血PRP。
2.根据权利要求1所述从脐带血制备PRP的方法，其特征在于，还包括
步骤3，将制得的脐带血PRP和剩余的乏血小板血浆分别于-20±2℃保存，使用时根据血小板的浓度需求用同一人的乏血小板血浆调整血小板浓度。
3.根据权利要求1所述从脐带血制备PRP的方法，其特征在于，还包括
步骤3，在制备好的1mL浓度为(1000±100)×109/L的脐带血PRP中加入100μL的PRP激活剂，静置1min后制备成脐带血PRP凝胶。
4.根据权利要求3所述从脐带血制备PRP的方法，其特征在于，所述PRP激活剂为牛凝血酶和氯化钙混合物，其中，氯化钙终浓度为40mM，牛凝血酶终浓度为100U/mL。
5.如权利要求1所述的从脐带血制备PRP的方法制得脐带血PRP在制备糖尿病性难愈合创伤药物中的应用。
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