CN109846902A - 一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法：(一)脐带血采集；(二)第一次离心：将血样离心，离心参数为1500r/min，10min；离心后吸取上清层、中间层及红细胞层上端0.5～1mm，进行第二次离心；(三)第二次离心：离心参数为2800r/min，10min；离心后，吸取上层液体，直至下层剩余5ml，此即为富血小板因子；(四)将富血小板因子与氯化钙‑牛凝血酶溶液以体积比1:8～10的比例混合，混匀，静置2分钟以上，即得富血小板因子凝胶。利用本发明的方法制备的异体源富血小板凝胶因子可用于异体治疗，且浓度可达原全血浓度的9倍，可用于急慢性创伤修复，可作为复合人工骨用于骨折不愈合的治疗。

Description

一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法

技术领域

本发明涉及一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法，属于血液制品技术领域。

背景技术

富血小板因子是自体全血经过梯度离心、分离得到的血小板浓缩物，血小板含量丰富。人体血液中正常血小板浓度为100,000μl～350,000μl，平均为200,000μl，富血小板因子中血小板浓度一般为全血的3～10倍。当血小板激活时，能释放多种生长因子，它们在促进骨细胞和成骨细胞的增殖、生长、分化和组织的形成过程中起着重要的作用。自1998年Marx等首次用富血小板因子复合移植骨修复下颌骨缺损以来，富血小板因子已逐渐应用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神经外科等领域的组织修复中。

到目前为止，国际上尚无统一标准化的富血小板因子提取方法。现有技术中，富血小板因子的制备方法主要分为两种，一种是机器制备，机器制备富血小板因子相对于手工制备而言血小板含量和生长因子浓度都要高，而且机器制备富血小板因子简便、快速、安全、高效，但价格昂贵。目前常用的设备有Curasau系统、Platelet concemtratecollection系统、Smat PRe P系统、Trissee系统等。由于机器制备富血小板因子的成本很高，且制备的血小板不易保存，目前很难广泛应用于临床之中，仅限于实验室研究使用。另一种方法是手工制备,经过几年的探索研究，目前主要制备方法有：1Anitua法；2Landesberg法；3Aghaloo；4Petrungaro法。手工制备富血小板因子步骤简单、操作容易、对设备要求低。

目前应用较为广泛的手工制备方法是二次离心法，首先使用柠檬酸盐作为抗凝剂螯合血液中的钙离子防止血液凝固。第1次离心通常使用较低的转速，目的主要是利用血液中不同细胞的沉降速度不同，将红细胞(直径约7um)和白细胞(直径约7-15um)与血小板(约2um)分离。第2次离心的目的是通过较高的转速使血浆中的血小板更加浓缩，并最终将富血小板血架与贫血小板血梁分离。得到之后，在应用之前，还要对其进行激活。血小板在激活剂的作用下，会引起a颗粒(致密颗粒)的脱颗粒作用，释放出其内部储存的多重生长因子，发挥生物学效应。血小板被激活剂激活后，在短时间内会释放大量的生长因子。

现有技术中提取制备的富血小板因子及方法，尚存在以下不足之处：

1、富血小板因子一般都是从患者的自身血液中分离获得，不能进行异体使用。

2、自体来源的富血小板因子，因采集于自体外周血，青壮年期采集的样本活力较强，效果较好。但对于自身患有某些疾病或年龄较大的人群来说，使用效果较差。从自身患有某种疾病或年龄较大的人体来抽取血液，本身对个体存在着一定损害，进一步加重病情的衍化。另外，自身患有某种疾病时或随着年龄的增加，血小板活性变差，血小板释放生长因子能力降低，进一步影响富集血小板的治疗效果。

3、一步离心法，由于离心的转速和时间的限制，血小板不能被充分离心，收集的富血小板因子中血小板的浓缩倍数有限，一般约为3～4倍；血浆中仍残留有一定量的红细胞，导致最终制备的富血小板因子中也含有一定量的红细胞。

4、常规的两步离心法，将全血以313g，离心4分钟，用巴氏吸管吸取上部血浆及靠近界面约1mm的红细胞转移至另一离心管中，再以1252g，离心6分钟，巴氏吸管吸取上部大部分血浆，剩余所需要血浆及血细胞成分，静止30分钟后振摇离心管，即得富血小板因子。此种方法，收集的富血小板因子中血小板的浓缩倍数一般约为5～7倍，因此制备的富血小板因子中含有一定量的红细胞。

发明内容

针对上述现有技术，为解决现有技术中提取制备的富血小板因子仅用于自体治疗的局限，为解决现有技术中提取制备的富血小板因子浓度较低的缺陷，本发明提供了一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法。利用本发明的方法制备的富血小板因子及凝胶可用于异体治疗，且浓度可达原全血浓度的9倍。而且，本发明还解决了富血小板因子局部注射的局限，通过制备成富血小板因子凝胶后，仅较现有技术来源的富血小板活性更高，释放的生长因子可用性更强。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法，包括以下步骤：

(一)脐带血采集：新生胎儿脐带取血，获得脐带血，并与抗凝剂充分混匀；

(二)第一次离心：将血样置于50ml离心管中，离心，离心参数为1500r/min，10min；离心后血样分为上清层、中间层及红细胞层，吸取上清层、中间层及红细胞层上端0.5～1mm，移入新的50ml离心管中，轻轻摇匀，进行第二次离心；

(三)第二次离心：离心参数为2800r/min，10min；离心后，吸取上层液体(取样做微生物检测)，直至下层剩余5ml，此即为富血小板因子；混匀下层富血小板因子，从中抽取1.0ml样本于1个EP管中，做内毒素检测和血小板浓度检测；

(四)将富血小板因子与氯化钙-牛凝血酶溶液以体积比1:8～10的比例(优选1:9)混合，混匀，静置2分钟以上，即得富血小板因子凝胶；其中，氯化钙-牛凝血酶溶液是由氯化钙、牛凝血酶和水组成的，其中，氯化钙的浓度为10％(重量百分数)，牛凝血酶的浓度为1000U/ml。

利用本发明的方法制备得到的富血小板凝胶因子，不仅有利于创口的愈合生长，为创口的愈合提供湿润的条件，还可以延长生长因子在创口处的作用时间，减少流失、蒸发等造成的损失，降低治疗效果。本发明的富血小板凝胶因子，可用于急慢性创伤修复，具有较好的治疗效果，可降低患者的疼痛，减少疤痕的形成，降低感染的风险。本发明的富血小板凝胶因子，可作为复合人工骨用于骨折不愈合的治疗，可起到较好的效果，为骨折不愈合及其它骨科类疾病的治疗提供了新的思路。

本发明具有以下优点：

1.本发明的血样来源于新生胎儿的脐带血，由脐带血制备得到脐带血富血小板因子，免疫排斥反应弱，可进行异体应用。而现有技术中的富血小板因子一般都是从患者的自身血液中分离获得，不能进行异体应用。而且，本发明的血液来源为新生儿脐带血，未受到放射、药物、毒物、病菌或其他环境污染，使用时安全性更高，且不会因采血而给患者造成二次伤害。脐带血因其自身来源的原始化，血小板活性较高，对年龄较大患者使用比使用自身的富血小板因子效果更加明显。

2.离心力及离心时间：本发明通过对离心力及离心时间的优化，富集的富血小板因子中血小板的浓缩倍数可达9倍，时间为20min，提高了浓缩倍数，同时缩短了制备时间，提高了工作效率。现有技术中富集的富血小板因子中血小板的浓缩倍数一般为3～7倍，制备时长为30min以上。

3.本发明将脐带血富血小板用激活剂激活后，制备成了脐带血富血小板凝胶(目前仅有外周血来源的富血小板凝胶，暂未有脐带血来源的富血小板凝胶)，呈粘性胶状，不仅可以粘合组织缺损处，还可以防止血小板的流失，使血小板在局部长时间分泌生长因子，保持较高的生长因子浓度，同时解决了富血小板凝胶仅限于自体使用的难题。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1制备富血小板凝胶因子

步骤如下：

(一)脐带血采集：

1)胎儿娩出后，助产士用二个血管钳，夹住脐带，从二钳之间用剪刀剪断脐带，抱走新生儿。

2)采样本者立即进行脐带消毒：下方铺一块无菌巾，放置于固定好的无菌巾上，自然垂下；用无菌纱布自下而上均匀擦洗；用2％碘伏纱布自上而下均匀消毒三遍。

3)左手固定脐带准备穿刺采样本；在文氏钳上端2～3cm处，使针尖与脐带平面呈15度角，斜面向下快速刺入脐静脉，伸拉脐带，并让样本采集袋自然垂直，使脐带血缓慢流入样本采集袋中，随时轻轻摆动血袋使脐带血与抗凝剂(本实施例所用抗凝剂为柠檬酸钠)充分混匀。

4)当脐带血全部进入血袋后，缓慢取出针头，并使管内脐带血流入血袋。

5)采集完毕5分钟内先拔针再关小卡，5分钟后先关小卡后拔针(关卡位置距血袋根部10cm处)，回套针帽，胶布固定，注明信息。

6)采集完毕，把所有资料，连同血袋放入恒温箱内，运送至实验室。

(二)离心：

(1)实验室将所接收的脐带血，用75％酒精擦拭采血袋，将血样混匀5min后(抗凝剂与血液的体积比例为1:9)，转移到生物安全柜内。

(2)在生物安全柜中，用50ml注射器将血袋内样本缓慢均匀注射到50mL离心管中，每管不多于45ml。取其中1ml混匀血样进行血细胞计数，检测制备前的血小板浓度。

(3)设置离心参数，开始第一次离心，离心参数：1500r/min，升9降7，10min。

(4)离心后分为上清层、中间层及红细胞层，吸取上清层、中间层及红细胞层上端0.5～1mm，移入新的50ml离心管中，轻轻摇匀。

(5)设置离心参数，开始第二次离心，离心参数：2800r/min，升9降7，10min；

(6)离心完毕后，用电动助吸器抽取上层液体至一新的50m离心管中，直至下层剩余5ml，即为富血小板因子，混匀下层富血小板因子，从中抽取1.0ml样本于1个EP管中，做内毒素检测和血小板浓度检测(制备后的血小板浓度为制备前血小板浓度的7～9倍)；将离心完毕后剩余的上层液体混匀，取样做微生物检测。

(三)将富血小板因子与氯化钙-牛凝血酶溶液以体积比1:9的比例混合，混匀，静置2分钟以上，即得富血小板因子凝胶；其中，氯化钙-牛凝血酶溶液是由氯化钙、牛凝血酶和水组成的，其中，氯化钙的浓度为10％(重量百分数)，牛凝血酶的浓度为1000U/ml。

应用实例1：应用上述制备成的异体源富血小板凝胶因子对急慢性创伤患者30例进行了有效性试验研究，结果如表1所示，结果表明：参加试验的30例患者，创面肉芽增生满意，窦道封闭良好，感染控制良好，术后复查无死腔。

表1

类型	急性外伤创面	骨质外漏	糖尿病足创面
				参加例数	10例	10例	10例
平均愈合时长	10±3.5d	20±6.5d	15±4.6d
				感染控制	良好	良好	良好

应用实例2：应用上述制备成的异体源富血小板凝胶因子复合人工骨对8例骨折不愈合患者进行了有效性试验研究，结果表明：参加试验的8例患者，骨折均愈合，愈合时间4～9个月，可恢复正常工作。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (10)

1.一种异体源富血小板凝胶因子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)脐带血采集：新生胎儿脐带取血，获得脐带血，并与抗凝剂充分混匀；

(二)第一次离心：将血样置于50ml离心管中，离心，离心参数为1500r/min，10min；离心后血样分为上清层、中间层及红细胞层，吸取上清层、中间层及红细胞层上端0.5～1mm，移入新的50ml离心管中，轻轻摇匀，进行第二次离心；

(三)第二次离心：离心参数为2800r/min，10min；离心后，吸取上层液体，直至下层剩余5ml，此即为富血小板因子；

(四)将富血小板因子与氯化钙-牛凝血酶溶液以体积比1:8～10的比例混合，混匀，静置2分钟以上，即得富血小板因子凝胶；其中，氯化钙-牛凝血酶溶液是由氯化钙、牛凝血酶和水组成的，其中，氯化钙的浓度为10％，牛凝血酶的浓度为1000U/ml。

2.根据权利要求1所述的异体源富血小板凝胶因子的制备方法，其特征在于：所述步骤(一)的具体操作方式为：

1)胎儿娩出后，助产士用二个血管钳，夹住脐带，从二钳之间用剪刀剪断脐带，抱走新生儿；

2)采样本者立即进行脐带消毒：下方铺一块无菌巾，放置于固定好的无菌巾上，自然垂下；用无菌纱布自下而上均匀擦洗；用2％碘伏纱布自上而下均匀消毒三遍；

3)左手固定脐带准备穿刺采样本；在文氏钳上端2～3cm处，使针尖与脐带平面呈15度角，斜面向下快速刺入脐静脉，伸拉脐带，并让样本采集袋自然垂直，使脐带血缓慢流入样本采集袋中，随时轻轻摆动血袋使脐带血与抗凝剂充分混匀；

4)当脐带血全部进入血袋后，缓慢取出针头，并使管内脐带血流入血袋；

5)采集完毕5分钟内先拔针再关小卡，5分钟后先关小卡后拔针，回套针帽，胶布固定，注明信息；

6)采集完毕，把所有资料，连同血袋放入恒温箱内，运送至实验室。

3.根据权利要求1所述的异体源富血小板凝胶因子的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)中，吸取上层液体后，对上层液体取样做微生物检测。

4.根据权利要求1所述的异体源富血小板凝胶因子的制备方法，其特征在于：所述步骤(三)中，得到富血小板因子后，混匀下层富血小板因子，从中抽取1.0ml样本于1个EP管中，做内毒素检测和血小板浓度检测。

5.根据权利要求1所述的异体源富血小板凝胶因子的制备方法，其特征在于：所述步骤(四)中，富血小板因子与氯化钙-牛凝血酶溶液的体积比为1:9。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的异体源富血小板凝胶因子的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(一)脐带血采集：

1)胎儿娩出后，助产士用二个血管钳，夹住脐带，从二钳之间用剪刀剪断脐带，抱走新生儿；

2)采样本者立即进行脐带消毒：下方铺一块无菌巾，放置于固定好的无菌巾上，自然垂下；用无菌纱布自下而上均匀擦洗；用2％碘伏纱布自上而下均匀消毒三遍；

3)左手固定脐带准备穿刺采样本；在文氏钳上端2～3cm处，使针尖与脐带平面呈15度角，斜面向下快速刺入脐静脉，伸拉脐带，并让样本采集袋自然垂直，使脐带血缓慢流入样本采集袋中，随时轻轻摆动血袋使脐带血与抗凝剂充分混匀；

4)当脐带血全部进入血袋后，缓慢取出针头，并使管内脐带血流入血袋；

5)采集完毕5分钟内先拔针再关小卡，5分钟后先关小卡后拔针，回套针帽，胶布固定，注明信息；

6)采集完毕，把所有资料，连同血袋放入恒温箱内，运送至实验室；

(二)离心：

(1)实验室将所接收的脐带血，用75％酒精擦拭采血袋，将血样混匀5min后，转移到生物安全柜内；

(2)在生物安全柜中，用50ml注射器将血袋内样本缓慢均匀注射到50mL离心管中，每管不多于45ml。取其中1ml混匀血样进行血细胞计数，检测制备前的血小板浓度；

(3)设置离心参数，开始第一次离心，离心参数：1500r/min，升9降7，10min；

(4)离心后分为上清层、中间层及红细胞层，吸取上清层、中间层及红细胞层上端0.5～1mm，移入新的50ml离心管中，轻轻摇匀；

(三)设置离心参数，开始第二次离心，离心参数：2800r/min，升9降7，10min；

离心完毕后，用电动助吸器抽取上层液体至一新的50m离心管中，直至下层剩余5ml，即为富血小板因子；

(四)将富血小板因子与氯化钙-牛凝血酶溶液以体积比1:9的比例混合，混匀，静置2分钟以上，即得富血小板因子凝胶；其中，氯化钙-牛凝血酶溶液是由氯化钙、牛凝血酶和水组成的，其中，氯化钙的浓度为10％，牛凝血酶的浓度为1000U/ml。

7.利用权利要求1～6中任一项所述的异体源富血小板凝胶因子的制备方法制备得到的异体源富血小板凝胶因子。

8.权利要求7所述的异体源富血小板凝胶因子在制备急、慢性创伤修复的药物中的用途。

9.权利要求7所述的异体源富血小板凝胶因子在作为/制备复合人工骨中的用途。

10.权利要求7所述的异体源富血小板凝胶因子在或在制备促进骨折愈合的药物中的用途。