CN114533060A - 一种自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子cgf的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于自然浓缩生长因子CGF制备技术领域，涉及一种自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法。血液采集后，分别注入紫色无菌防凝试管和无菌真空红色采血管，紫色无菌防凝试管中加入混合防凝剂，摇匀后离心，然后取取中间CGF层，得到液态CGF；无菌真空红色采血管离心后取中间层及中间层、下层交界处凝胶，压膜器压制定型，得到固态CGF。CGF制取量大，操作方便，实用性强，具有较高的市场应用前景。

Description

一种自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法

技术领域

本发明属于自然浓缩生长因子CGF制备技术领域，涉及一种自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法。

背景技术

血浆提取物的研究大致经历了富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP），富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF），浓缩生长因子（Concentrate GrowthFactors，CGF）三个阶段。PRP由于含凝血酶及动物血清，并采用一次离心法，容易被污染及致敏，面临淘汰。PRF与CGF相比，扫描电镜结果显示富血小板纤维蛋白和浓缩生长因子的上部分可见不同直径的胶原纤维排列成三维网状结构，胶原纤维上可见大量颗粒状血小板附着，无细胞结构；富血小板纤维蛋白中的胶原纤维排列成条索状，而浓缩生长因子中的胶原纤维排列成栅栏状；ELISA实验结果表明浓缩生长因子中转化生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子和血管内皮生长因子的含量均高于PRP及PRF。

自体血的CGF是由Sacco首次开发出来的，但是制备过程并不完善，产品的生产过程也得不到很好的保障，影响了其疗效。

自体血CGF比自体血PRP含有更高浓度、更多数量的生长因子、纤维蛋白和大量的CD34+细胞，CGF凝胶质地柔软，富有弹性便于塑形并缓慢释放，由大量纤维蛋白交织成的三维立体网状结构组成，且纤维蛋白网的结构较疏松，具有改善并增强组织再生的功能。因此，保证生长因子的浓度及活性至关重要。自体血取出后需要立即加入一次性真空采血管立即变速连续离心，以制备固态的CGF。但若制备液态的CGF, 由于机器没有配套的防凝剂及试管、试剂和耗材，须另外采购有资质的上述试剂耗材，手续十分繁琐。

国外的Medifuge离心机（Silfradent，意大利塞法登特公司生产）造价为十几万，并需用专用试管配套离心，而国产的变速离心机仅一万左右，但只能制备固态的CGF。制备液态的CGF没有国产配套的试剂耗材，限制了CGF应用于骨性关节炎、整形美容、糖尿病足等疾病。

发明内容

本发明针对传统国产离心机无法同时制备固体和液体CGF的问题中存在的问题提出一种新型的自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种自体血来源的浓缩生长因子套装制备方法，能同时制备固体和液体两种CGF。

固态CGF制备：采集血10毫升，加入无菌真空红色采血管离心，按离心机S1键，自动连续变速四次离心，取得固态CGf，若需要不同形状的固态CGf，在无菌纱布上挤压塑形即可。

液态CGF制作：用采血针抽血10ml，注入紫色无菌防凝试管，摇匀，放入CGF口腔离心机，配平，按键S1，连续变速离心四次，制备成液态CGf。

离心程序如下：加速30s，2700r/min离心2min后，2400r/min离心4min；2 700r/min离心4min；3 000r/min离心3min,最后减速36s停止。离心13min后，血液分为3层，上层为贫血小板血浆（Platelet-poorplasma，PPP），中层为CGF，下层为红细胞（Red bloodcell，RBC）；；离心13min后，血液分为3层，上层为贫血小板血浆（Platelet-poorplasma，PPP），中层为CGF，下层为红细胞（Red bloodcell，RBC）。

防凝液可以自行配制，也可以通过直接抽取一次性使用塑料血袋血液保存袋(100ml)内混合防凝液方式，每0.3ml防凝液内含枸橼酸3.27g，枸橼酸钠26.30g、葡萄糖31.9g，碳酸二氢钠2.22g、腺嘌呤0.275g，经高压蒸汽灭菌、无菌、无热源、开封后一天内可用。

本发明防凝试管经再次添加含枸橼酸钠防凝剂的混合物，使得单位血液制备得到的液态CGF量高于国外离心机制备的量。且其他操作不变的情况下，不添加含枸橼酸钠混合防凝剂时单纯紫色防凝试管制备的CGF数量为每5ml制备1ml，而添加枸橼酸钠混合物的为每5ml血制备至少2mlCGF以上，制备数量及效率有大幅度提高；以上各种生长因子相互作用，相互促进，并且不添加动物血清，避免了交叉感染。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1. 用普通紫色防凝试管运输及添加液态枸橼酸钠等试剂耗材制备后，国产CGF口腔离心机可以生产固态、液态二种形态CGF。本发明所提供的方法，操作方便，实用性强，具有较高的市场应用前景。

2. 制取量大，自体血采集用套装里的紫色防凝试管另加采血袋的混合防凝剂后，应用国产离心管或防凝试管连续变频离心，可以很方便的制备出固态、液态二种CGF，每5ml自体血可以制备2ml以上CGF，多的时候可以制备3-3.5ml。

附图说明

图1为实施例1中得到的固体CGF。

图2为实施例2中得到的液体CGF。

图3为本发明所用到的耗材图。

各附图标记为：1.PPP，2.

PRP，3.CD34+，4.红血球。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

如图1和图3所示，本实施例提供固体CGF制备过程，产物如图1。

（1）试剂耗材准备：准备采血针、一次性5毫升注射器2个、压脉带一个、一次性无菌换药包二个、红色无菌一次性使用真空采血管（EDTK2试管）二个，一次性采血针二个，无添加剂。

（2）采血：将供血者手臂平放于桌面，掌心向上，护士将一个小软垫放于手臂之下，此时手臂平放的高度应与心脏高低位置不相上下。此时护士在肘弯处扎止血带、消毒和静脉穿刺。抽血穿刺时应握紧拳，针头进人血管后可以放开拳头。患者此时应保持安静平稳心态，如对静脉穿刺抽血紧张或有见血恶心及眩晕问题，可闭上双眼或扭转头部。抽血完成后立即用消毒的棉块或其他消毒止血物品压紧穿刺部位，或弯曲手臂夹住棉球，以免血液渗出。此后24小时内尽量保持抽血手臂的清洁卫生。

应用国产的变速离心机和本专利方法，用采血针抽血10ml，注入套装中无菌真空红色采血管，放入CGF口腔离心机，配平，按键S1，连续变速离心四次。具体程序如下: 2700r/min离心2 min，2400 r/min离心4 min, 2700 r/min离心4 min,3000 r/min离心3min。经13 min离心后，试管中的静脉血分离为3层:最上层为血清,中间层为富自体CGF凝胶层，中间层与底层交界处富含CD34+细胞，底层为红细胞及血小板。

无菌操作剪取中间层及中间层、下层交界处凝胶，以专用压膜器压成椭圆形纤维蛋白膜备用。

常规条件下成品被模具压制成薄膜被定型后直接用于临床，本技术可做到成品的长时间保存而保证成分的稳定，适合大量制备及临床分阶段使用以减少患者的二次创伤。

本实施例试剂盒制作的CGF可大量长期保存，可压制成膜用于临床创伤面的辅助愈合，也可剪碎后与生物材料混合用于组织再生且不会引起任何感染。

实施例2

本实施例提供液体CGF制作过程，离心后产品如图2。，其中PPP与

PRP层之间以及

PRP、CD34+层、CD34+与红血球之间构成CGF层。

准备好压脉带、消毒酒精棉球、紫色防凝试管、一次性采血袋。按照实例1抽血方法，估算需要的采血量。抽取10毫升静脉血加入防凝管内，立即按照抽取0.3ml/10ml比例从采血袋中抽取混合防凝剂，置入专用紫色防凝管内摇匀五六次。将试管放入专用离心管内，配平离心机后上盖。

以 2700 r/min离心2 min，2400 r/min离心4 min, 2700 r/min离心4 min,3000r/min离心3min。经13 min连续变速离心后，促使全血分层。用吸管吸取上层PRP层，放置一闲置的无菌红色试管内；选择中间CGF层放入另一无菌红色试管内。若有整形除皱需求、须选择1ml注射器以及34G针头实施注射，一般在患者皮肤的真皮浅层实施注射，注射前需要消毒患者治疗区域，通过点刺或者线性的手法实施注射。完成注射后再次消毒注射部位，及时进行清洁，不需要进行冰敷。每月进行1次注射，1疗程为3次。

实施例1和实施例2的实施前需要对如下器材进行消毒，操作如下：将离心管、紫色防凝管、红色无菌采血管、巴氏吸管、一次性医用换药包组装在一起(详见下图2），外加包装膜，用高温高压蒸汽灭菌，环氧乙烷灭菌法灭菌。

各耗材均为市售，优选以下规格产品和处理方式。

包装膜采用法国STERIMED PROPYPEL Premium 60gsm, 70gsm 进口医用透析纸，具有顶尖的透气性、稳定性及最佳阻菌效果；要求灭菌后指示色标变色清晰准确易判断，灭菌后有效期360天。包装膜采用防爆边三线封边工艺设计，避免产生爆袋，确保产品包装完整。

防凝管：5ml或10ml，由负压储血管、胶塞、塑料胶帽，配合一次性静脉采血针使用，采血后将血立即注入该试管摇匀。

吸管：3ml，比克曼生物。

换药包：一次性，环氧乙烷灭菌，灭菌有效期二年，其基本配置为塑料镊子、选配棉球、一次性使用医用橡胶检查手套、海绵刷、纱布巾、治疗巾。

无菌注射器：5ml或10ml，无菌、无致热源，有效期三年。

一次性使用静脉采血针：环氧乙烷灭菌、无菌、无热源，一次性使用，用后销毁。

无菌医用手套：天然橡胶胶乳，直型或向手掌弯曲型，环氧乙烷灭菌，一次性使用，经表面粉末材料处理过，应在手术前无菌除去粉末。

一次性使用无菌真空采血管：EDTK2试管，无添加剂，制备固态的CGF使用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (3)

1.一种自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法，其特征在于，血液采集后，分别注入紫色无菌防凝试管和无菌真空红色采血管，

紫色无菌防凝试管中加入混合防凝剂，摇匀后离心，然后取中间CGF层，得到液态CGF；

无菌真空红色采血管离心后取中间层、中间层与下层交界处凝胶，压膜器压制定型，得到固态CGF；

紫色无菌防凝试管和无菌真空红色采血管内的血液均采用如下程序离心：

加速30s，2700r/min离心2min后，2400r/min离心4min；2 700r/min离心4min；3 000r/min离心3min,最后减速36s停止。

2.根据权利要求1所述自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法，其特征在于，混合防凝剂由如下重量分数物质组成：枸橼酸3.27份，枸橼酸钠26.30份、葡萄糖31.9份，碳酸二氢钠2.22份、腺嘌呤0.275份。

3.根据权利要求1所述自体血制备固态或液态自然浓缩生长因子CGF的方法，其特征在于，混合防凝剂加入量为0.3ml/10ml自体血。

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