CN1584591A - 血液流变全血质控物及其制备方法 - Google Patents

血液流变全血质控物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学临床检验中血液流变检测的全血质控物及其制备方法,全血质控物组分包括全血、输血用营养抗凝液以及细胞培养液,三组分之间的容积比为7.2~8.8∶1~1.1∶1.6~2.4。制备方法包含下列步骤:(1)静脉采集全血;(2)将采集的全血与上述抗凝液和细胞培养液,在无菌条件下按容积比混合均匀;(3)用灭菌真空采血管对以上混合物进行无菌分装,并置1~5℃条件下保存。本发明全血质控物立足国情,填补国内外空白,成本低廉,简便易行,保存时间长(可保存3个月)。可进行高、中、低值监测,能反映仪器对不同浓度测定物的敏感性。在实验中配合应用仪器清洁程序和本底试验,应用于血液流变室内质控结果满意。

Description

血液流变全血质控物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学领域中血液流变指标检测技术,具体涉及一种全血质控物及其制备方法。
背景技术
血流灌注改变是许多疾病,特别是心脑血管发病机理中的原因。血液流变学通过一些血液流变指标的检测可从细胞水平上分析、诊断这类病,目前应用于临床的血流变实验室检测一般含全血粘度、血浆粘度、红细胞压积(HCT)以及红细胞沉降率(ESR)等6项以及基于此6项数据计算出的全血还原粘度、红细胞聚集、刚性、变形、电泳指数和血沉K值等8项指标。为了使所检测的数据具有可靠性,需要质量控制(简称:质控)来保证。1986年国际血液学标准化委员会(ICSH)提出了关于临床血液流变学检测的标准化建议,1988年又推出部分参数测定的指导意见。胡金麟、丛玉隆、廖龙凯、王天佑等学者10余年来对血流变质控进行了多次探讨,目前仍在研究和完善中。
血流变检测的质控是一项系统工程,涉及仪器校准、仪器本底(空白)实验、全血(非牛顿液体)粘度质控、血浆(牛顿液体)质控、红细胞压积(HCT)、红细胞沉降率(ESR)和红细胞聚集性、变形性等。开展血流变检测的质控相当复杂,其中最关键的是需要寻找一种合适的全血质控物,由于这一问题至今尚未解决,所以目前血流变检测是少数几项未开展室内/室间质量控制的检验项目,从某种程度上已影响到其临床应用。因此,研制一种质量可靠、保存时间长的全血质控物是本领域技术人员关注的问题。
以往公知技术中,关于全血质控物制备和保存国内外尚无切实可行的办法。张宁、朱华、汪子伟在2000年第18卷第2期《临床检验杂志》上发表了题为“血液粘度测定质量控制物实验比较”的文章,其中将高低两种浓度的聚乙二醇6000(PEG6000)液作为质控物,应用于血粘度质控。该方法的优点是能方便地获得质控物,及时发现失控,并能可靠地监视血液粘度分析的精密度,但不能检测血浆粘度、红细胞压积(HCT)和红细胞沉降率(ESR),而这几项指标在血流变诊断中缺一不可,故不甚理想。
红细胞保存技术的研究经历了许多波折,添加腺嘌呤、甘露醇和其他添加剂,红细胞保存限制在6周左右。全血仅保存3周。1986年Mergman报道,含有高浓度氨基酸和磷酸盐的低渗介质可以使红细胞保存100天。2001年Greenwalt报道,改良EAS-64配方可保存红细胞11周。实验室常用磷酸盐细胞保养缓冲液保存红细胞。但以上研究均为去血浆稀释法,致血浆粘度(0.6-0.8)低。醛化细胞可保存红细胞2~3个月,广泛用于血液细胞分析仪质控物制备,但不适用样本用量5ml的血流变检测,因为制备过程需多次离心洗涤,一般实验室制备困难,成本较高。此外,1972年美籍生物学家Chien等研究表明,与正常血液粘度曲线比较,无血浆蛋白质的红细胞粘度曲线中红细胞变形性升高、聚集性下降,而硬化(醛化)红细胞粘度曲线中红细胞聚集性下降。故上述两类红细胞保存方法不适用血流变全血质控物制备。
发明内容
本发明目的是提供一种简便易行、保存时间长的血液流变全血质控物及其制备方法,以保证血液流变检测结果的可靠性。
为达到上述目的,本发明血液流变全血质控物采用的技术方案是:一种血液流变全血质控物,包含下列组分:
(1)、全血;
(2)、抗凝液,该抗凝液选择下列三者之一或其混合物:
输血用1号抗凝液、输血用2号抗凝液、输血用3号抗凝液;
(3)、细胞培养液,该细胞培养液选择下列二者之一或其混合物:
RPMI 1640液、M 199液;
以上三组分之间的容积比为:
全血∶抗凝液∶细胞培养液
7.2~8.8∶1~1.1∶1.6~2.4。
上述技术方案中的有关内容和变化解释如下:
1、上述方案中,抗凝液选择输血用1号抗凝液;细胞培养液选择RPMI 1640液效果最佳,其中,全血、抗凝液、细胞培养液三组分之间的容积比为8∶1∶2最佳。
2、上述方案中,为了进一步提高效果,所述全血质控物的组分中还可以添加纤维蛋白,其加入量为2~4克/每升(这里所说的每升是指全血、抗凝液、细胞培养液三组分的容积)。
3、上述方案中,抗凝液采用混合物时包含上述两种混合抗凝液和三种抗凝液混合两种情况。所述输血用1号抗凝液、输血用2号抗凝液和输血用3号抗凝液均为现有公知材料,比如1号抗凝液,每1000ml抗凝液含枸橼酸(H2O)3.27g、枸橼酸钠(2H2O)26.3g、磷酸二氢钠(2H2O)2.51g、葡萄糖(H2O)46.4g、腺嘌呤0.27g。2号抗凝液由血液保存液和红细胞保存液两部分组成,其中,血液保存液每1000ml含枸橼酸(H2O)4.8g、枸橼酸钠(2H2O)13.2g、葡萄糖(H2O)14.7g;红细胞保存液每1000ml含枸橼酸(H2O)0.20g、枸橼酸钠(2H2O)1.50g、葡萄糖(H2O)7.93g磷酸二氢钠(2H2O)0.94g、氯化钠4.97g、腺嘌呤0.14g、甘露醇14.57g。1号抗凝液和2号抗凝液由山东威高集团医用高分子制品股份有限公司生产,也可以由其它生产厂家生产。
4、上述方案中,所述RPMI 1640液和M 199液均为细胞培养液,比如RPMI1640液为美国进口产品,RPMI Medium 1640,商标GIBCOBRL,美国LIFETECHNOLOGIES提供,按说明书配制成1640液。1640液含细胞生理必需氨基酸20余种及10余种维生素等。
为达到上述目的,本发明血液流变全血质控物制备方法采用的技术方案是:一种血液流变全血质控物的制备方法,包含下列步骤:
(1)、静脉采集全血;
(2)、将采集的全血与上述抗凝液和细胞培养液,在无菌条件下按容积比为7.2~8.8∶1~1.1∶1.6~2.4混合均匀;
(3)、用灭菌真空采血管对以上混合物进行无菌分装,并置1~5℃条件下保存。
上述第二步中,可以先将全血与抗凝液,在无菌条件下混合均匀,然后再加入细胞培养液,并在无菌条件下混合均匀。
上述第三步中,保存温度较好的范围是2~4℃,最佳是3℃。
总之,按照以上配方和方法制备全血质控物成本低廉,简便易行,保存时间长(可保存3个月)。可进行高、中、低值监测,能反映仪器对不同浓度测定物的敏感性。在实验中配合应用仪器清洁程序和本底试验,血液流变室内质控结果满意,应用于血液流变室内质控表明该方案切实可行。
附图说明
附图1为中值质控物与正常人全血粘度比较图。
附图2为中值全血10s-1(低切)粘度Westgard多规则质控图。
附图3为中值全血60s-1(中切)粘度Westgard多规则质控图。
附图4为中值全血150s-1(高切)粘度Westgard多规则质控图。
附图5为中值120s-1血浆粘度Westgard多规则质控图。
附图6为中值全血红细胞压积(HCT)Westgard多规则质控图。
附图7为高值全血10s-1(低切)粘度Westgard多规则质控图。
附图8为高值全血60s-1(中切)粘度Westgard多规则质控图。
附图9为高值全血150s-1(高切)粘度Westgard多规则质控图。
附图10为高值120s-1血浆粘度Westgard多规则质控图。
附图11为高值全血红细胞压积(HCT)Westgard多规则质控图。
附图12为低值全血10s-1(低切)粘度Westgard多规则质控图。
附图13为低值全血60s-1(中切)粘度Westgard多规则质控图。
附图14为低值全血150s-1(高切)粘度Westgard多规则质控图。
附图15为低值120s-1血浆粘度Westgard多规则质控图。
附图16为低值全血红细胞压积(HCT)Westgard多规则质控图。
附图17为低值全血红细胞沉降率(ESR)Westgard多规则质控图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例一:采用本发明配方和方法制备高、中、低值质控物,并应用于血流变室内质控,具体内容如下:
1、材料与方法
1.1材料:输血用血袋,内装28ml输血用1号抗凝液,每1000ml抗凝液含枸橼酸(H2O)3.27g、枸橼酸钠(2H2O)26.3g、磷酸二氢钠(2H2O)2.51g、葡萄糖(H2O)46.4g、腺嘌呤0.27g,由山东威高集团医用高分子制品股份有限公司提供。RPMI Medium 1640,商标GIBCOBRL,美国LIFETECHNOLOGIES提供,按说明书配1640液。真空管采用美国BD Vacutainer公司生产灭菌真空采血管。魏氏法ESR管和支撑架。
1.2仪器:北京普利生LBY-N6A型自清洗旋转式粘度计,定期使用标准油校准,应用清洁程序(每天关机前用库尔特清洗液浸泡,水清洗2次,开机后水清洗1次)后测定蒸馏水120s-137℃表观粘度在本底范围(0.695±0.03)内。COULTER STKS血球计数仪,按仪器要求定期校准,每天采用COULTER 5C cell control质控。
1.3全血质控液制备:静脉采血,与输血用1号抗凝液8∶1混合,每100ml全血加入1640液25ml,混匀后采用无菌技术分装真空管,每管3ml,均置2-4℃保存。高、中、低值质控物以取出血浆量来调节(高值质控液每3ml取出1ml血浆,中值取出0.8ml)。
1.4质控物批间重复性测定:高、中、低值全血质控物各取10管,用粘度计测定每管150s-1、60s-1和10s-1切变率下的全血粘度(表观)和120s-1血浆粘度,用血球计数仪测定HCT,用魏氏法测定ESR,计算 x±s和CV%。
1.5全血粘度拟合试验:取正常血液标本,将红细胞压积调至44.0%,测定全血粘度,与中值全血质控物全血粘度曲线比较,比较拟合程度。
1.6连续3个月分别以不同浓度全血质控液作监测,第1月为中值,其后为高值,第3个月低值,随每天标本测定质控液血流变6项数据,测定前须将质控液置室温回温,擦净管内壁上端残血迹。中值/高值先定量取出血浆测定血浆粘度,再充分混匀余液测定全血粘度及其它项目:低值质控液先充分混匀测定全血粘度及其它项目,再分离血浆测定血浆粘度。将结果点入Westgard多规则质控图。
1.7每周用血球计数仪,测定质控液的全血Hbg/L和血浆Hbg/L,计算溶血百分率,计算公式:溶血百分比(%)=(100-HCT)血浆Hb浓度/全血Hb浓度。
1.8统计学处理:数据以 x±s表示,应用Excel软件,统计变异系数(CV%)和t检验。
2实验结果
2.1全血质控液的批间重复性:高、中、低值全血质控液重复测定10管,各项目批\管间CV%见表1。CV%值均<5.0%,表明分装技术稳定,质控液批\管间重复性较好。
表1    不同浓度全血质控液批\管间重复性比较    n=10
      测定            全血粘度(mPa.s)            血浆粘度(mPa.s)  红细胞       血沉
      项目      低切10s-1 中切60s-1 高切150s-1   120s-1       压积(%)     (mm/H)
高值  x±S     13.3±0.4  7.1±0.2   6.1±0.2      1.1±0.1      52.4±1.5    0
      CV(%)    2.9        2.1        3.9           4.8           2.8          0
中值  x±S     9.6±0.2   5.6±0.2   4.6±0.1      1.1±0.1      48.0±0.6    0
      CV(%)    2.2        3.4        3.2           4.8           1.1          0
低值  x±s     5.8±0.3   3.8±0.2   3.3±0.1      1.1±0.1      33.6±0.3    1
      CV(%)    2.3        1.9        1.0           4.5           1.0          0
2.2正常血液标本(HCT44.0%)与中值全血质控物全血粘度曲线比较见图1:两条曲线拟合程度较好,无显著差异。
2.3连续3个月分别以不同浓度全血质控液同每天标本作监测,结果见表2。CV%值均<5.0%,每月第1周与最后1周数据t检验结果均无显著差异(P>0.05);溶血率<1%。表明该全血质控液制备和保存方法较好。室内质控结果满意。
表2      不同浓度全血质控液测定结果
    测定             全血粘度(mPa.s)         血浆粘度(mPa.s)  红细胞       血沉    溶血率
    项目      低切10s-1  中切60s-1  高切150s-1 120s-1     压积(%)     (mm/H)  (%)
    第一周    9.5±0.1    5.5±0.2    4.5±0.1    1.1±0.1    47.9±0.6    0       <0.1
中  第二周    9.5±0.3    5.4±0.2    4.5±0.2    1.1±0.1    47.9±0.6    0       <0.1
    第三周    9.7±0.1    5.6±0.1    4.6±0.1    1.1±0.1    48.1±0.7    0       <0.1
    第四周    9.7±0.2    5.6±0.1    4.7±0.1    1.1±0.1    48.1±0.6    0       <0.1
    x±S     9.6±0.3    5.6±0.2    4.6±0.1    1.1±0.1    48.0±0.6    0
值  CV(%)    3.0         3.4         3.2         4.4         1.4
    P值*      >0.05      >0.05      >0.05      >0.05      >0.05
    第一周    13.3±0.5   6.9±0.2    5.9±0.2    1.1±0.1    52.9±0.6    0       <0.1
高  第二周    13.4±0.2   7.1±0.1    6.0±0.1    1.1±0.1    51.6±1.2    0       <0.1
    第三周    13.4±0.4   7.2±0.1    6.2±0.2    1.1±0.1    52.4±0.5    0       <0.1
    第四周    13.4±0.4   7.1±0.3    6.2±0.2    1.1±0.1    52.4±0.5    0       <0.1
    x±S     13.3±0.5   7.1±0.2    6.1±0.2    1.1±0.1    52.3±0.9    0
值  CV(%)    3.3         2.9         3.4         4.6         1.8
    P值*      >0.05      >0.05      >0.05      >0.05      >0.05
    第一周    5.8±0.2    3.8±0.2    3.2±0.1    1.1±0.1    34.4±0.7    1       <0.1
低  第二周    5.8±0.3    3.7±0.2    3.3±0.2    1.1±0.1    33.6±0.7    1       <0.1
    第三周    5.8±0.2    3.8±0.2    3.2±0.1    1.1±0.1    34.6±0.4    1       <0.1
    第四周    5.8±0.3    3.8±0.2    3.3±0.2    1.1±0.1    33.8±0.6    1       <0.1
值  x±S     5.8±0.3    3.8±0.2    3.3±0.2    1.1±0.1    34.1±0.7    1±0    <0.1
    CV(%)    4.4         4.9         4.7         4.9         2.1
    P值*      >0.05      >0.05      >0.05      >0.05      >0.05
P值*为第1周与最后1周数据t检验结果
2.3室内质控结果:连续3个月分别以不同浓度全血质控液每天临床标本测定,将血流变结果点入Westgard多规则质控图,中值质控图见图2~图6;高值质控图见图7~图11;低值质控图见图12~图17。
3结论
经实验我们发现抗凝全血中加入1640液溶血率明显低于不加1640液,细胞培养使用的1640液含细胞生理必需氨基酸20余种及10余种维生素等,商品供应,配制方便,可保存血浆。实验表明与正常血液全血粘度曲线比较,两条曲线拟合程度较好,无显著差异。
无菌分装技术也制约了全血质控液制备。BD灭菌真空管商品供应,分装简单,取用方便。重复试验表明:高、中、低值质控液各项目批\管间重复性较好,表明分装技术稳定性较好。将质控物置2-4℃,可保存3个月,2个月后轻度溶血,但溶血率<1%,第3个月质控数据t检验无显著差异,表明质控结果不受影响。
进行高、中、低值监测,反映仪器对不同浓度测定物的敏感性是质控的基本要求。我们批量制备低值全血质控物,调节每管质控物血浆量制备高值和低值质控物,定量取出的血浆测定血浆粘度,再混匀质控物测定全血粘度等,此举通过质控结果还可反映所使用的移液器是否精准。
Westgard多规则质控图广泛应用于生化、血凝和血细胞分析等检验质控,我们应用于血流变质控,Westgard图示不同值的质控物3个月质控结果均在范围内。
总之,按照以上配方和方法制备全血质控物成本低廉,简便易行,保存时间长(可保存3个月)。可进行高、中、低值监测,能反映仪器对不同浓度测定物的敏感性。在实验中配合应用仪器清洁程序和本底试验,血液流变室内质控结果满意。
实施例二:一种血液流变全血质控物,由下列组分组成:
(1)、全血;
(2)、输血用2号抗凝液;
(3)、M 199细胞培养液;
以上三组分之间的容积比为:
全血∶抗凝液∶细胞培养液
7.2∶1∶1.6。
其制备方法包含下列步骤:
(1)、静脉采集全血;
(2)、将采集的全血与上述抗凝液和细胞培养液,在无菌条件下按以上容积比混合均匀;
(3)、用灭菌真空采血管对以上混合物进行无菌分装,并置2~4℃条件下保存。
实验过程省略。
实施例三:一种血液流变全血质控物,由下列组分组成:
(1)、全血;
(2)、输血用3号抗凝液;
(3)、RPMI 1640细胞培养液;
以上三组分之间的容积比为:
全血∶抗凝液∶细胞培养液
8.8∶1.1∶2.4。
其制备方法同实施例二,实验过程省略。
实施例四:一种血液流变全血质控物,由下列组分组成:
(1)、全血;
(2)、输血用1和2号抗凝液;
(3)、RPMI 1640细胞培养液和M 199细胞培养液;
以上三组分之间的容积比为:
全血∶抗凝液∶细胞培养液
8.2∶1.05∶2.2。
其制备方法同实施例二,实验过程省略。
实施例五:一种血液流变全血质控物,由下列组分组成:
(1)、全血;
(2)、输血用1号抗凝液;
(3)、RPMI 1640细胞培养液;
以上三组分之间的容积比为8∶1∶2。
所述组分中还包含有纤维蛋白,其加入量为2~4克/每升。
其制备方法同实施例二,实验过程省略。

Claims (6)

1、一种血液流变全血质控物,其特征在于包含下列组分:
(1)、全血;
(2)、抗凝液,该抗凝液选择下列三者之一或其混合物:
输血用1号抗凝液、输血用2号抗凝液、输血用3号抗凝液;
(3)、细胞培养液,该细胞培养液选择下列二者之一或其混合物:
RPMI 1640液、M 199液;
以上三组分之间的容积比为:
全血∶抗凝液∶细胞培养液
7.2~8.8∶1~1.1∶1.6~2.4。
2、根据权利要求1所述的全血质控物,其特征在于:
抗凝液选择输血用1号抗凝液;
细胞培养液选择RPMI 1640液。
3、根据权利要求1所述的全血质控物,其特征在于:
以上三组分之间的容积比为:
全血∶抗凝液∶细胞培养液
8∶1∶2。
4、根据权利要求1所述的全血质控物,其特征在于:所述组分中还包含有纤维蛋白,其加入量为2~4克/每升。
5、一种血液流变全血质控物的制备方法,其特征在于包含下列步骤:
(1)、静脉采集全血;
(2)、将采集的全血与上述抗凝液和细胞培养液,在无菌条件下按容积比为7.2~8.8∶1~1.1∶1.6~2.4混合均匀;
(3)、用灭菌真空采血管对以上混合物进行无菌分装,并置1~5℃条件下保存。
6、根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:上述第二步中,先将全血与抗凝液,在无菌条件下混合均匀,然后再加入细胞培养液,并在无菌条件下混合均匀。
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