CN101624579A - 分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒及其应用。本试剂盒是专门从人类骨髓或脐带血中分离、纯化有核细胞，本发明将代表非干/祖细胞的已知抗体，和骨髓和血浆中的成分混合，使得非干/祖细胞的比重由于细胞凝集而发生改变，然后采用自然沉降的方法，首先除去红细胞、血小板、全部的血浆物质，以及成熟的白细胞、淋巴细胞，保留Lin－细胞。干细胞/祖细胞的回收率≥85％，分离提取的干细胞/祖细胞存活率≥96％，分离、纯化过程能有效保留全部种类的干细胞。200豪升骨髓可获得的细胞总数一般在0.5～5.0×10⁹。200毫升的脐带血可获得的细胞总数在0.2～2.0×10⁹。

Description

分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种人干细胞分离试剂盒。

背景技术

2007年步入岁末，生命科学界再次涌起波涛。日本和美国两个课题组相继运用转基因技术，在普通人的成纤维细胞导入了Oct4，nanog，sox2等基因，发现成纤维细胞重新编程具备了人类胚胎干细胞的特性。这一研究成果引起了全世界的震动。美国政府再接再厉，投入30亿美元资金，继续深入该课题的研究。干细胞研究的这一成果，大大缩短了将人类胚胎干细胞运用于临床的距离。

众所周知，干细胞是一类具有自我更新能力，能够分化为其他种类细胞，本身处于未分化状态的细胞。干细胞目前按照其分化能力可以分为全能，多能和定向干细胞三种。根据其来源，则可分为胚胎干细胞和成体干细胞。人类就是通过受精卵这个全能干细胞不断分化而成。

1998年，美国威斯康辛麦迪逊大学(UW)的汤姆逊教授领导的课题组，成功地建立了人类胚胎干细胞系，这一成果被誉为干细胞研究的里程碑，此后，干细胞领域的研究一直成为生命科学研究的前沿和热点。仁济医院消化所经过多年的努力，于2006年成功地建立了三株人类胚胎干细胞系，同时开始了将成体干细胞运用于肝脏疾病治疗的探索。干细胞的研究，正在成为人类疾病治疗的新曙光。

(一)人类胚胎干细胞研究和临床疾病的治疗

胚胎干细胞，是具有多能性的干细胞，在体外合适的诱导条件下，可以成功地诱导出各种细胞。美国UW的张素春博士，在运动神经元细胞的诱导中取得了突破性的进展。而威斯康辛灵长类研究所的科学家，则将猴子胚胎干细胞诱导所得的神经细胞移植到帕金森氏病猴模型上，整个实验历时10年，终于获得了成功，移植细胞完全治愈了疾患猴子。而明尼苏达大学的丹.考夫曼博士克服了技术上的障隘，在诱导胚胎干细胞获得能够杀伤肿瘤的免疫细胞上取得了突破。仁济医院消化所干细胞实验室的蒯小铃博士运用胚胎干细胞诱导肝脏细胞，取得了成功。在血液细胞的诱导方面，美国，英国，加拿大各国顶尖实验室，都投入了大量的人力，物力，全力以赴地希望获得可供移植的造血细胞。美国UW的麦克西姆博士运用一种名叫OP9的小鼠支持细胞，共培养人类胚胎干细胞，获得了大量的造血细胞。米克巴迪亚教授领导的加拿大McMaster大学肿瘤和干细胞研究所成功地运用人类胚胎干细胞，建立了稳定的体外培养和诱导体系，成功地从胚胎干细胞中获得了具有进一步分化潜力的造血干细胞。仁济医院的科学家在综合上述两大顶尖实验室的技术基础上，建立了可从人类胚胎干细胞大规模获得可供移植的造血干细胞的体外诱导体系，见文献：Z Wang，H Lu，YC Wang et al.2008；9：14-19.的报道。

胚胎干细胞要真正运用到临床，还有遥远的道路，其中，最主要的难点有两点，其一：如何解决免疫排斥的问题。对于这个问题，有着不同的思路，有人提出，可运用核移植的方法，将病人的体细胞去核，移植到去核的卵细胞中，然后再将杂合细胞推动到胚胎的囊胚阶段，从中分离胚胎干细胞。近期克隆猴的成功为这一思路的实现带来了希望。另有学者提出利用孤雌生殖的方式获得人类的胚胎。这方面的成果尚需进一步探讨。而上述的从皮肤细胞获得人类胚胎干细胞，是一个崭新的思路，但获得细胞的过程中导入基因的手段涉及到病毒，对于该细胞未来是否可以真正运用于临床治疗病人，还有待于后续实验的进一步深入。胚胎干细胞运用于临床疾病治疗的另一忧人之处是干细胞本身形成畸胎瘤的特性。虽然分化所得的细胞在移植中尚未发现成肿瘤的现象，但对于胚胎干细胞在体外扩增中是否存在着类似肿瘤的表观遗传学的改变，是一个值得重视的命题。

(二)成体干细胞研究和临床疾病的治疗

成体干细胞运用于临床疾病的治疗，如骨髓干细胞，脐血干细胞移植治疗血液疾病，已经报道很多。但运用骨髓干细胞治疗非造血系统疾病，近年来则越来越受到重视。随着临床研究的迅速发展及安全性的提高，这一技术的应用已经扩展至其他各个领域，包括治疗帕金森氏症，老年性痴呆症，骨折，股骨头坏死，骨质疏松症，心血管病，急性心肌梗塞，I型糖尿病，肌营养失调，糖尿病足，闭塞性脉管炎，肝炎，肝硬化以及肿瘤的放疗、化疗后的支持疗法，都涉及了干细胞的应用。例如，大量的文献报道：由于慢性糖尿病人引起的慢性肢体缺血，在经过了骨髓干细胞的移植治疗后，将近半数的患者肢体出现缺血性溃疡或坏疽的改善，提示这些肢体治疗成功。而植入一种名称为CD133的骨髓干细胞，终末期慢性缺血性心肌病患者的心功能则获得了明显的改善。综合我们的经验和观察，自体骨髓干细胞在肝脏再生和肝纤维化的治疗中同样具有作用。德国多塞多夫的科学家发现骨髓干细胞对于参与肝脏再生起了一定的作用，治疗组的肝的增生速度，在经干细胞移植后，比对照组快了2.5倍，提示这种新的治疗方法在临床上具有提高和促进肝脏再生的潜能，见文献：JS Esch II，WT Knoefel，M Klein et al.Stem Cells 2005；23：463-470.。

众上所述，干细胞在生命科学领域内是当今的研究热点。在移植医学领域，由于同种供体的严重短缺，大量需要移植治疗的患者得不到及时救治，因此，异种动物和干细胞的应用就成为人们的希望。但多种原因造成异种移植未能取得突破性进展，而干细胞的研究则给各种疾病患者，带来了曙光。骨髓干细胞移植已经运用于临床治疗患者，而干细胞研究的深入，使得运用干细胞生成可供移植的多种具有功能的组织和器官成为可能。细胞治疗目前可以治疗各种细胞损伤性疾病已经成为共识。开展新型干细胞分离试剂盒的研究，具有广阔的市场应用前景。

众所周知，传统的分离人类单核细胞的简单而有效的方法最初是由Arne Boyum在1968年报道的，25年来，商品化的淋巴细胞分离液(Lymphoprep^TM又名Ficoll-Isopaque)已经广泛地用于单核细胞的分离。其基本原理在于单核细胞(单核细胞和淋巴细胞)同多形核淋巴细胞(颗粒细胞)和红细胞相比具有较轻的浮力密度。大多数单核细胞的浮力密度是低于1.077g/ml。这些细胞可以通过一种密度在1.077g/ml的等渗溶液来进行分离。通过离心，形成密度梯度，红细胞和多形核淋巴细胞沉淀，而单核细胞集中在分离液等密度的交界面处。普通淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml并且含有一种名为Polysaccharide的成分，可以促进红细胞聚集和分层。但这也带来了两个不利的地方：1)Polysaccharide可以结合在淋巴细胞表面，影响细胞的分裂；2)因为红细胞聚集，所以进一步要处理红细胞的团块就显得十分困难。3)运用淋巴细胞分离液分离单核细胞，需要非常仔细地将稀释的血液样品加在分离液上，并且要保持血样和分离液之间非常清晰的界面。要做到这一步，需要良好的训练并且对于大量的样品来讲是耗时的。在经过繁琐的分离后，将单核细胞在经过免疫磁珠的分离法或者流式细胞分离法来进行干细胞的分离。整个过程耗时，昂贵，细胞损失严重，活力受到明显影响，见文献：HE Feucht，MR Hadan，F Frank et al.J.Immunol.Meth.1980；134，43-51.。

发明内容

本发明的目的是公开一种分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒及其应用，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足有关领域发展的需要。

本发明的分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒由如下的组分构成：

试剂A  500毫升，试剂B  100毫升，试剂C  100豪升；

所说的试剂A为生理盐水；

所说的试剂B由如下体积比的组分组成：

重量浓度6～9％羟乙基淀粉生理盐水溶液    100毫升

混合抗体生理盐水溶液                    100微升

混合抗体生理盐水溶液中，混合抗体的含量为4～12微克/毫升；

所说的混合抗体的组分和重量份为：

抗CD    1份

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)2～4份；

P9抗体或者P9F(ab’)₂抗体片断2～5份

所述的试剂C的组分和含量为：

重量浓度为60％的碘克沙醇水溶液   22.7毫升

PH7.0～7.6的细胞悬浮液           77.3毫升

1)细胞悬浮液(PH7.0～7.6)

氯化钠                  0.85克

100mM三胺储存液         10毫升

加水                    定容至100毫升

2)100mM三胺储存液：     三胺1.79克

                        水100毫升

以碘克沙醇水溶液、细胞悬浮培养液和氯化钠溶液的总体积计，三胺(Tricine)的含量为10mM/毫升。

优选的，所说的混合抗体的组分和重量份为：

抗CD    1份

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)3份；

P9抗体片断4.0份，或者P9F(ab’)₂抗体片断2.72份。

优选的，所说的抗CD选自抗CD2、抗CD3、抗CD14、抗CD16、抗CD19、抗CD24、抗CD56或抗CD66b中的一种以上。

所说的抗CD、P9抗体或者P9F(ab’)₂抗体的详细说明可参阅文献：Slaper-Cortenbach IC，Admiraal LG，van Leeuwen EF，et al.Exp Hematol.1990；18(1)：49-54.，可采用Becton Dickinson Immunocytometry，Mountain View，Calif；DAKO，Carpinteria，CA公司的产品；

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)的详细说明可参阅文献：KarhiKK，Andersson LC，Vuopio P，Gahmberg CG et al.Blood.1981；57(1)：147-51.，可采用(Immunotech，Mardrillr，France)公司的产品；

上述的试剂盒，可用于从人类骨髓或脐带血中分离、纯化有核细胞，应用方法包括如下步骤：

(1)将含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的骨髓或者脐带血与试剂A按2∶1体积比混匀；

收集骨髓和脐带血采用山东威高集团医用高分子制品股份有限公司生产的含输血用1号抗凝液的一次性塑料血袋(国药准字：H20023184)。

其中，内装28毫升输血用1号抗凝液，可收集200毫升血量。

每1000毫升抗凝液含：

枸橼酸(C₆H₆O₈.H₂O)          3.27克

枸橼酸钠(C₆H₅Na₃O₇.2H₂O)    26.3克

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)    2.51克

葡萄糖(C₆H₁₂O₆)             46.4克

腺嘌呤(C₅H₅N₅)              0.27克

(2)将步骤(1)的溶液与试剂B混合，室温静置20～30分钟；

(3)收集上清液，离心转速2000～2500rpm，离心5分钟，收集沉降的细胞；

(4)用10～20mL试剂A洗涤收集的细胞，移到一支新的离心管中，然后再加入10～20mL试剂A，离心2000～2500rpm，离心5～10分钟，收集上清液，加入20毫升试剂A和试剂C，离心1000～1200rpm，离心20～30分钟；

(5)收集离心后的悬浮在离心管中间的细胞层，用10～20mL试剂A洗涤，收集细胞。

所说的混合抗体生理盐水溶液的制备方法如下：

将抗CD与抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)混匀，然后加入P9抗体或者P9F(ab’)₂抗体片断，37C孵育过夜交联，然后溶解在生理盐水中，再加入到重量浓度为6～9％羟乙基淀粉生理盐水溶液中；

本试剂盒是专门从人类骨髓或脐带血中分离、纯化有核细胞，不能用于分离其他组织细胞，每一个试剂盒设计可分离纯化骨髓或者脐带血200毫升，开瓶后必须一次使用，不能多次使用。

本发明的技术原理是：将代表非干细胞的已知抗体，和骨髓和血浆中的成分混合，使得非干细胞的比重由于细胞凝集而发生改变，然后采用自然沉降的方法，首先除去红细胞、血小板、全部的血浆物质，以及成熟的白细胞、淋巴细胞，保留Lin-细胞。

本发明摒弃了将收集血样加入到类似淋巴细胞分离液这类分离液，并通过密度梯度离心收集干细胞的思路，也摒弃了探索出一种高效快捷的可以适用于大样本骨髓和脐带血干细胞分离出造血细胞的理想方法。方法的第一环节就是以羟乙基淀粉(HES HydroxyethylStarch 130/0.4)为主体，结合使用最新的文献：BischoffFZ，Marquéz-Do DA，Martinez DI etal.Clin Genet.2003 Jun；63(6)：483-9.报道的“玫瑰花瓣抗体复合物”技术，采用负选收集法去除包括红细胞以及大部分非干细胞细胞群体。

所谓的“玫瑰花瓣抗体复合物”指的是通过抗体复合物将红细胞和不需要的有核细胞连接起来。具体讲，就是通过抗glycophorin A抗体(a)结合红细胞，另一种抗体(b)结合有核细胞，复合物中的第三种抗体(c)可以结合抗体a和抗体b的Fc部分。这样，一个红细胞周围就会有好多有核细胞和红细胞彼此结合的过程，构成了红细胞-抗体a-抗体c-抗体b-目标细胞(特定的单核细胞)的聚合体，由于这个聚合体呈玫瑰花瓣样结构，所以叫“玫瑰花瓣抗体复合物”。在本发明中，发明人采用的抗体(b)是一种鸡尾酒式样的抗体组合配方，因为干细胞是不均一的细胞群体，缺乏直接的形态学特征，干细胞由于各自的生长阶段不同，其表面抗原性各异。依据表面抗原性的不同，干细胞被分为许多种类，如：CD34，CD133，sca-1，C-kit，Lin阴性等等。

试剂盒保存条件：

保存条件2～8℃，有效期24个月，20℃室温保存有效期一年。

试剂盒对设备和环境的要求：

1、干细胞分离、纯化要求在一万级洁净实验室进行，骨髓和试剂移取要求在局部一百级的环境中操作。

2、要求一台大容量冷冻离心机，转速4000转/分中。

3、试剂加样和骨髓、脐带血移取尽可能使用带过滤膜的移液器移取。

4、分离、纯化所用的，离心管、移液管必须使用一次性无菌产品。分离、纯化后的干细胞检测：

1、细胞存活率的检测：使用台盼蓝染色。

2、所提取的细胞总数的计算：细胞计数板计数法，血球计数仪计数法

3、干细胞定性测定：培养扩增法

流式细胞仪检测法，用已知的抗原标记后测定。CD34+、CD117、CD133、C-kit、Sca-1。

与传统的若干种干细胞分离法相比结果，见下表。

	负选收集法	流式细胞仪法	磁珠法(过柱)	外周血细胞分选仪法	密度梯度离心法
						分离的原理	选择性的除去红细胞，血小板，全部血浆物质，成熟的白细	除去所有未标记的细胞	除去所有未标记的细胞	除去大部分红细胞、血小板。	除去密度≥1.077的有形细胞

	胞，淋巴细胞。保留Lin-细胞
						靶细胞表面标记物	无	有	有	无	无
收集的靶细胞种类	能收集所有Lin-干/祖细胞	选择性的收集CD34、CD133、C-kit、Sca-1等	选择性的收集CD34、CD133、C-kit、Sca-1等。	95％是中性粒细胞。干细胞/祖细胞数量很少，还残留一些淋巴细胞、红细胞	保留所有的单核白细胞、淋巴细胞、干细胞、祖细胞
						最小体积	0.5ml	1.0ml	10ml	50-100ml	1.0ml
动员剂	不需要	不需要		必须使用动员剂，风险很大。WBC可以达到5-10万
						血浆残留	无	有	有	有	无
分选对象	骨髓、脐带血	骨髓、脐带血、外周血	骨髓、脐带血、外周血	外周血	骨髓、脐带血、外周血

细胞回收率	≥85％	依据抗体含量决定，抗体含量足，回收率可达到99％	依据抗体含量决定，抗体含量足，回收率可达到99％	≤70％	≤60％
						细胞存活率	≥98％	≤90％	≤95％	≥98％	≥98％

由此可见，本发明的试剂盒的优点是十分明显的，操作简单，尤其适合于移植实验所需。采用本发明的试剂盒能够有效除去全部的红细胞、血小板、血浆物质、能除去绝大部分成熟的白细胞、淋巴细胞。无任何试剂残留物遗留，干细胞/祖细胞的回收率≥85％，分离提取的干细胞/祖细胞存活率≥96％，分离、纯化过程能有效保留全部种类的干/祖细胞。200豪升骨髓可获得的细胞总数一般在0.5～5.0×10⁹。200毫升的脐带血可获得的细胞总数在0.2～2.0×10⁹。

具体实施方式

实施例1

人骨髓干/祖细胞的分离

本发明的分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒由如下的组分构成：

试剂A  500毫升，试剂B  100毫升，试剂C    100豪升。

试剂A和试剂C均为无色透明液体，试剂B为稍带粘性的澄明液体，有时显轻微乳光。

所说的试剂A为生理盐水；

所说的试剂B由如下体积比的组分组成：

重量浓度为6％羟乙基淀粉生理盐水溶液      100毫升

混合抗体生理盐水溶液                     100微升

混合抗体生理盐水溶液中，混合抗体的含量为4微克/毫升；

所说的混合抗体的组分和重量份为：

抗CD    1份

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)3份；

P9抗体或者P9F(ab’)₂抗体片断4.0份，

所说的抗CD为抗CD2、抗CD3、抗CD14、抗CD16、抗CD19、抗CD24、抗CD56和抗CD66b；抗体为混合物，所加的比例为1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1。

所说的混合抗体生理盐水溶液的制备方法如下：

将抗CD与抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)混匀，然后加入P9抗体或者P9F(ab’)₂抗体片断，37℃孵育过夜交联，然后溶解在生理盐水中，再加入到重量浓度为6％羟乙基淀粉生理盐水溶液中；

所述的试剂C的组分和含量为：

1)100mM三胺储存液：三胺1.79克

                   水100毫升

2)细胞悬浮液(PH7.4)

氯化钠             0.85克

100mM三胺储存液    10毫升

加水               定容至100毫升

3)试剂C：

浓度为60％的碘克沙醇水溶液      22.7毫升

PH7.4的细胞悬浮液               77.3毫升

以碘克沙醇水溶液、细胞悬浮培养液和氯化钠溶液的总体积计，三胺(Tricine)的含量为10mM/毫升。

本试剂盒是专门从人类骨髓或脐带血中分离、纯化有核细胞，不能用于分离其他组织细胞，每一个试剂盒设计可分离纯化骨髓或者脐带血200毫升，开瓶后必须一次使用，不能多次使用。

采用上述试剂盒从人类骨髓或脐带血中分离、纯化有核细胞的操作方法包括如下步骤：

(1)将200mL含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的骨髓与100mL试剂A混匀；

收集骨髓和脐带血采用山东威高集团医用高分子制品股份有限公司生产的含输血用1号抗凝液的一次性塑料血袋(国药准字：H20023184)。

其中，内装28毫升输血用1号抗凝液

每1000毫升抗凝液含：

枸橼酸(C₆H₆O₈.H₂O)         3.27克

枸橼酸钠(C₆H₅Na₃O₇.2H₂O)   26.3克

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)   2.51克

葡萄糖(C₆H₁₂O₆)            46.4克

腺嘌呤(C₅H₅N₅)             0.27克

(2)将步骤(1)的溶液与试剂B混合，室温静置20分钟；

(3)收集上清液，离心转速2000rpm，离心5分钟，收集沉降的细胞；

(4)用10mL试剂A洗涤收集的细胞，移到一支新的离心管中，然后再加入10mL试剂A，离心2000rpm，离心5分钟，收集上清液，加入20毫升试剂A和试剂C，离心1200rpm，离心20分钟；

(5)收集离心后的悬浮在离心管中间的细胞层，用10mL试剂A洗涤，收集细胞。

干细胞/祖细胞的回收率为85％，分离提取的干细胞/祖细胞存活率为96％，分离200毫升骨髓获得的细胞总数为5×10⁹。

实施例2

人脐带血干/祖细胞的分离

本发明的分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒由如下的组分构成：

试剂A  500毫升，试剂B  100毫升，试剂C  100豪升。

试剂A和试剂C均为无色透明液体，试剂B为稍带粘性的澄明液体，有时显轻微乳光。

所说的试剂A为生理盐水；

所说的试剂B由如下体积比的组分组成：

重量浓度为8％羟乙基淀粉生理盐水溶液       100毫升

混合抗体生理盐水溶液                      100微升

混合抗体生理盐水溶液中，混合抗体的含量为12微克/毫升；

所说的混合抗体的组分和重量份为：

抗CD    1份

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)3份；

P9抗体4.份；

所说的抗CD为抗CD56。

所说的混合抗体生理盐水溶液的制备方法如下：

将抗CD与抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)混匀，然后加入P9抗体，37℃孵育过夜交联，然后溶解在生理盐水中，再加入到重量浓度为8％羟乙基淀粉生理盐水溶液中；

所述的试剂C的组分和含量为：

1)100mM三胺储存液：三胺1.79克

                   水100毫升

2)细胞悬浮液(PH7.4)

氯化钠             0.85克

100mM三胺储存液    10毫升

加水               定容至100毫升

3)试剂C：

重量浓度为60％的碘克沙醇水溶液    22.7毫升

PH7.4的细胞悬浮液                 77.3毫升

以碘克沙醇水溶液、细胞悬浮培养液和氯化钠溶液的总体积计，三胺(Tricine)的含量为10mM/毫升。

分离、纯化有核细胞的操作方法：

(1)将200mL含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人脐带血与100mL试剂A混匀；

收集脐带血采用山东威高集团医用高分子制品股份有限公司生产的含输血用1号抗凝液的一次性塑料血袋(国药准字：H20023184)。

其中，内装28毫升输血用1号抗凝液

每1000毫升抗凝液含：

枸橼酸(C₆H₆O₈.H₂O)        3.27克

枸橼酸钠(C₆H₅Na₃O₇.2H₂O)  26.3克

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)  2.51克

葡萄糖(C₆H₁₂O₆)           46.4克

腺嘌呤(C₅H₅N₅)            0.27克

(2)将步骤(1)的溶液与试剂B混合，室温静置30分钟；

(3)收集上清液，离心转速2500rpm，离心5分钟，收集沉降的细胞；

(4)用20mL试剂A洗涤收集的细胞，移到一支新的离心管中，然后再加入20mL试剂A，离心2500rpm，离心5分钟，收集上清液，加入20毫升试剂A和试剂C，离心1200rpm，离心30分钟；

(5)收集离心后的悬浮在离心管中间的细胞层，用20mL试剂A洗涤，收集细胞。

干细胞/祖细胞的回收率为85％，分离提取的干细胞/祖细胞存活率为96％，分离200毫升含有肝素抗凝剂的脐带血获得的细胞总数为2×10⁹。

Claims (5)

1.分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，由如下的组分构成：

试剂A  500毫升，试剂B  100毫升，试剂C  100豪升；

所说的试剂A为生理盐水；

所说的试剂B由如下体积比的组分组成：

重量浓度6～9％羟乙基淀粉生理盐水溶液    100毫升

混合抗体生理盐水溶液                    100微升

混合抗体生理盐水溶液中，混合抗体的含量为4～12微克/毫升；

所说的混合抗体的组分和重量份为：

抗CD    1份

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)2～4份；

P9抗体或者P9F(ab’)₂抗体片断2～5份

所述的试剂C的组分和含量为：

重量浓度为60％的碘克沙醇水溶液          22.7毫升

PH7.0～7.6的细胞悬浮液                  77.3毫升

1)细胞悬浮液(PH7.0～7.6)

氯化钠                                  0.85克

100mM三胺储存液                         10毫升

加水                                    定容至100毫升

2)100mM三胺储存液：三胺1.79克

水100毫升

以碘克沙醇水溶液、细胞悬浮培养液和氯化钠溶液的总体积计，三胺(Tricine)的含量为10mM/毫升。

2.根据权利要求1所述的分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，所说的混合抗体的组分和重量份为：

抗CD    1份

抗血型糖蛋白A(GlycophorinA)抗体(抗红细胞)3份；

P9抗体片断4.0份，或者P9F(ab’)₂抗体片断2.72份。

3.根据权利要求1所述的分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒，其特征在于，所说的抗CD选自抗CD2、抗CD3、抗CD14、抗CD16、抗CD19、抗CD24、抗CD56或抗CD66b中一种以上。

4.根据权利要求1所述的分离人骨髓或脐带血干/祖细胞的试剂盒的应用，其特征在于，用于从人类骨髓或脐带血中分离、纯化有核细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用方法包括如下步骤：

(1)将含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的骨髓或者脐带血与试剂A按2∶1体积比混匀；

收集骨髓和脐带血采用含输血用1号抗凝液的塑料血袋，其中，内装28毫升输血用1号抗凝液，可收集200毫升血量；

每1000毫升抗凝液含：

枸橼酸(C₆H₆O₈.H₂O)      3.27克

枸橼酸钠(C₆H₅Na₃O₇.2H₂O)26.3克

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)2.51克

葡萄糖(C₆H₁₂O₆)46.4克

腺嘌呤(C₅H₅N₅) 0.27克

(2)将步骤(1)的溶液与试剂B混合，室温静置20～30分钟；

(3)收集上清液，离心转速2000～2500rpm，离心5～10分钟，收集沉降的细胞；

(4)用10～20mL试剂A洗涤收集的细胞，移到一支新的离心管中，然后再加入10～20mL试剂A，离心2000～2500rpm，离心5～10分钟，收集上清液，加入20毫升试剂A和试剂C，离心1000～1200rpm，离心20～30分钟；

(5)收集离心后的悬浮在离心管中间的细胞层，用10～20mL试剂A洗涤，收集细胞。