CN103205395A - 白细胞的纯化 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于纯化白细胞的方法。该方法还能包括回收被纯化的白细胞或溶解被纯化的白细胞。

Description

白细胞的纯化
技术领域
白细胞（也称为白血球）在很多应用（包括细胞疗法和诊断）中是有益的。白细胞能从例如（从供血者获得的）脐带血或血液获得。
背景技术
通常，包括白细胞的脐带血浓缩液和干细胞浓缩液被存放在液氮环境下，其中，这些浓缩液包括冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO），以在存放过程中保护白细胞免受损害。包括DMSO的浓缩液能对患者使用（administer），但是由于DMSO能被看作杂质，一些方案包括离心分离和洗涤浓缩液，以在给患者使用之前减少存在于浓缩液产品中的DMSO。这些方案是费力的而且费时。
用于获得白细胞的一些方法包括：使血液或血液制品经过多孔的白细胞滤除介质（meidium）；和洗脱来自介质的白细胞（这是通过使洗脱液从介质的下游表面经过上游表面而进行的），或者溶解在介质上的白细胞（这是在迫使盐水从上游表面穿过下游表面而经过介质或迫使空气从上游表面穿过下游表面而经过介质之后进行的）。但是，这些方法导致所含杂质（例如存在红细胞（也称为红血球））的程度不理想，和/或导致白细胞的产生量低于希望。
本发明提供了对现有技术中的至少一些缺陷的改进。根据下面描述的说明书，本发明的这些和其他优点将变得明显。
发明内容
本发明的实施例提供了用于纯化白细胞的方法，该方法包括：（a）使包含白细胞的生物体液（biological fluid）经过具有上游表面和下游表面的多孔的白细胞滤除介质，该生物体液从上游表面穿过下游表面，其中白细胞被白细胞滤除介质保留；（b）使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质；和（c）使洗涤液借助重力从上游表面穿过下游表面而经过白细胞滤除介质。
另一实施例提供了用于纯化白细胞的方法，该方法包括：（a）使包含白细胞的冷冻保护液经过具有上游表面和下游表面的多孔的白细胞滤除介质，该冷冻保护液从上游表面穿过下游表面，其中白细胞被白细胞滤除介质保留；（b）使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质；和（c）使洗涤液借助重力从上游表面穿过下游表面而经过白细胞滤除介质。
在这些方法的一些实施例中，用另外的洗涤液重复（b）和（c）至少一次。
在这些方法的一些实施例中还包括：通过使洗脱液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质来从白细胞滤除介质洗脱白细胞，和回收（recover）被洗脱的白细胞，或在白细胞被白细胞滤除介质保留的同时溶解白细胞。
如果希望的话，能利用多井（multiwell）装置或单独的过滤装置来实现该方法的实施例。
附图说明
图1描述并示意性地示出了根据本发明的方法的实施例。
图2示出了适于实现根据本发明的方法的实施例的示意性的系统。
图3示出了适于实现根据本发明的方法的实施例的另一示意性的系统，其中该方法在保持封闭系统的同时被实现。
具体实施方式
如图1示出的：
1、空的注射器筒（其被连接至注射器式过滤器的入口，该注射器式过滤器包括白细胞滤除介质）被设置成使注射器式过滤器的出口与接收容器流体连通。含有白细胞的生物体液放置在筒中，且通过过滤器借助重力而排出，其中白细胞被白细胞滤除介质捕获。
2、注射器筒与注射器式过滤器的入口脱离连接，注射器柱塞被插入筒中，注射器再次与入口连接。注射器式过滤器的出口布置成与含有洗涤液的洗涤容器流体连通。柱塞被抽回，从洗涤容器抽取洗涤液，并使其进入注射器筒。
3、再次抽回注射器柱塞直到其被拉出注射器筒。洗涤液通过过滤器借助重力排入洗涤容器。白细胞被白细胞滤除介质再次捕获，不希望的材料（例如，红血球）进入废物容器。
4、能用新鲜的洗涤液重复洗涤。
根据本发明的实施例，提供了用于纯化白细胞的方法，该方法包括：（a）使包含白细胞的生物体液经过具有上游表面和下游表面的多孔的白细胞滤除介质，该生物体液从上游表面穿过下游表面，其中白细胞被白细胞滤除介质保留；（b）使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质；和（c）使洗涤液借助重力从上游表面穿过下游表面而经过白细胞滤除介质。
另一实施例提供了用于纯化白细胞的方法，该方法包括：（a）使包含白细胞和冷冻保护剂（例如DMSO）的液体经过具有上游表面和下游表面的多孔的白细胞滤除介质，该液体从上游表面穿过下游表面，其中白细胞被白细胞滤除介质保留；（b）使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质；和（c）使洗涤液借助重力从上游表面穿过下游表面而经过白细胞滤除介质。
在这些方法的一些实施例中，用另外的洗涤液重复（b）和（c）至少一次。
在一些实施例中，生物体液或冷冻保护剂借助重力或真空穿过多孔的白细胞滤除介质。使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质包括在上游表面的上游形成负压（真空），或包括在下游表面的下游形成正压。
有利地，在减少红血球和/或血小板的存在的同时能获得白细胞。使红血球和血小板的存在最小化对于应用细胞疗法是特别有利的。可选地或额外地，使DMSO的存在最小化对于应用细胞疗法是特别有利的，特别是对包括新生儿、婴儿和儿童的患者来说。
在这些方法的一些实施例中还包括：通过使洗脱液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质来从白细胞滤除介质洗脱白细胞，和回收被洗脱的白细胞，或在白细胞被白细胞滤除介质保留的同时溶解白细胞。在包括溶解白细胞的一个实施例中，该方法还包括分析被溶解的白细胞的成分，例如，包括分析来自被溶解的白细胞的核酸。
在该方法的一个优选实施例中，向一对象（例如患者）使用被洗脱的白细胞。
如果希望的话，能利用多井装置或单独的过滤装置来实现该方法的实施例。例如，使用具有多个井部件的多井装置，井部件在其中具有白细胞滤除媒介（media），生物体液和洗涤液的各自部分穿过在各井部件中的白细胞滤除介质。
能利用来自多种源，特别是哺乳动物的生物体液（在冷冻保护液中的细胞也能来自多种源）来实现本发明。优选地，哺乳动物来自：食肉目（order），包括猫科（猫）和犬科（狗）；和偶蹄目，包括牛科（牛）和猪科（猪）；或奇蹄目，包括马科（马）。通常，哺乳动物是灵长类、四足猴类（Ceboids）或猴类（Simoids）（猴），或是类人猿（人和猿）。特别优选的哺乳动物是人。
根据本发明的实施例，任何合适量的生物体液或冷冻保护液都能被处理，且多种白细胞滤除介质和白细胞滤除过滤器结构都是合适的，例如直径范围为从例如约0.3英寸（约7mm）或更小到约5英寸（约12cm）或更大的介质或过滤器。
在根据本发明的实施例白细胞被纯化（且优选地被洗脱）之前，根据本发明所使用的脐带血浓缩液和干细胞浓缩液能通过现有技术中已知的多种技术被生产（例如，获得与冷冻的和解冻的冷冻防护剂结合的、富含白细胞的片段（enriched white cell fraction））。
现在将在下面更详细地描述本发明的每一构件，其中相同的构件具有相同的附图标记。
多种多孔的白细胞滤除媒介适于在本发明中使用。合适的白细胞滤除媒介包括在商业中能获得的媒介，例如，能从颇尔公司（PallCorporation）（华盛顿港，纽约）得到的媒介。
多种洗涤液适于在本发明中使用。通常，洗涤液是与所希望的细胞在生理学上可相容的，且基本不影响细胞。示例性的液体包括，例如，盐水（如磷酸盐缓冲液（PBS））。
洗涤能以任何合适的流体流速完成。通常，使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质包括：例如通过抽回注射器筒内的柱塞而在上游表面的上游形成负压，其中注射器筒被连接至过滤装置的入口；或者在多井装置的（一个或多个）井部件内形成真空。优选地，借助重力完成使洗涤液从上游表面穿过下游表面而经过白细胞滤除介质。
在包括洗脱的那些实施例中，被过滤器保留（例如被捕获和/或吸收）的希望保留的细胞，例如白细胞（在一些实施例中是干细胞）通过从多孔的白细胞滤除介质反洗（即，通过使洗脱液沿着从下游侧向上游侧的方向经过多孔介质）而被释放，并经过进入端口，以便含有细胞的洗脱液从进入端口进入与进入端口连通的细胞收集容器。
反洗能以任何合适的流体流速完成，例如约0.1-15L/min/m2，虽然也能使用明显大于或小于这一范围的流速。例如，反洗能以约0.5-10L/min/m2（如约1-8L/min/m2）的流体流速完成，更优选的流速是约1.5-7L/min/m2（如约2-6L/min/m2或，甚至约2.5-5L/min/m2（如约3-4L ml/min/m2））。最优选的流速可取决于洗脱液的粘性和/或温度，和过滤介质的性质。因此，在一些应用中，例如当希望更柔和的处理时，反洗能以约1-100ml/min/m2（如约15-85ml/min/m2）的流速完成；更优选地，流速是约30-70ml/min/m2或甚至40-60ml/min/m2（如约50ml/min/m2）。
多种洗脱液适于在本发明中使用。通常，洗脱液是与所希望的细胞在生理学上可相容的，且基本不影响细胞。示例性的液体包括，例如，盐水，以及那些包括更有粘性的流体的流体，如在美国专利6544751和7291450中公开的。
在那些实施例（其中白细胞是根据本发明被纯化且在白细胞滤除介质中或在白细胞滤除介质上被大体溶解（而不是从介质洗脱））中，多种试剂和方案适于处理和溶解白细胞，以及纯化和/或分离从白细胞释放的核酸（优选，RNA，但本发明的实施例包括纯化和/或分离DNA），并且是现有技术中已知的。如果希望的话，白细胞能被处理，以便在溶解之前稳定细胞。被稳定的细胞能在溶解之前保持在白细胞滤除介质中或白细胞滤除介质上一段合适的时间，或者细胞能在稳定之后迅速或立即溶解。优选地，利用溶液来作用（disputed）白细胞，以便RNA被快速释放同时不激活核酸酶。示例性的试剂和方案（其包括纯化总RNA（total RNA）、分离总RNA和从纯化的RNA滤除球蛋白RNA（globin RNA））在例如“LeukoLOCKTM总RNA分离系统，球蛋白mRNA-从全血液样本滤除总RNA（LeukoLOCKTM Total RNAIsolation System,Globin MRNA-Depleted Total RNA from Whole BloodSamples）”指导手册，目录＃AM1923、AM1933、AM1934（手册1923M修订版B）Ambion公司，奥斯汀，德克萨斯（2007）中公开。
多种容器和包括容器的装置适于在本发明中使用，其中容器能设置在白细胞滤除媒介的上游和/或下游。合适的容器在本领域中是已知的。通常，一个或多个容器是与生物体液、希望的细胞、洗涤液和/或洗脱液在生理学上可相容的，且基本不影响细胞。由于在本发明的实施例中能使用多个容器，不要求单个的容器是与生物体液、希望的细胞、洗涤液和/或洗脱液在生理学上可相容的。例如，一个容器能用于使生物体液或冷冻保护液穿过白细胞滤除介质（因此不需要与洗涤液和/或洗脱液在生理学上可相容），另一容器能用于接收穿过白细胞滤除介质的洗涤液和使洗涤液穿过白细胞滤除介质，且另一容器能用于接收被洗脱的细胞和洗脱液。
在一些实施例中，用于使生物体液或冷冻保护液穿过白细胞滤除介质和接收穿过白细胞滤除介质的洗涤液以及使洗涤液穿过白细胞滤除介质的（一个或多个）容器是大体非柔性的，例如非柔性容器（如注射器筒）。但是，本发明的实施例不限于此。例如，用于使生物体液或冷冻保护液穿过白细胞滤除介质和接收穿过白细胞滤除介质的洗涤液以及使洗涤液穿过白细胞滤除介质的容器能包括柔性容器，例如血袋（如增塑的血袋），其具有柔性侧壁，通常，其中该容器具有至少两个端口，如进入端口和排出端口。柔性侧壁能被压缩或能形成真空，以便当空气和/或液体进入袋子且袋子受压时，空气和/或液体从容器和/或柔性侧壁经过，和/或使柔性侧壁膨胀；并且当排出端口被打开时，顺从（compliant）的容器将空气和/或液体引导出来。
本发明的实施例适于在开放的系统中使用，且本发明的实施例能在保持系统封闭的同时被实现。
根据本发明使用以下限定。
生物体液。生物体液包括：与生物体有关的任何处理过的或未经处理的液体，特别是血液，包括全血、温血或冷血、脐带血和存放血或新鲜血；处理过的血，例如用至少一种生理溶液（包括但不限于盐水、营养液，和/或阻凝剂溶液）稀释的血液；血液成分，例如血小板浓缩液（PC）、富血小板血浆（PRP）、贫血小板血浆（PPP）、无血小板血浆、血浆、新鲜冷冻血浆（FFP）、从血浆获得的成分、红细胞压积（PRC）、过渡区材料（transition zone material）或白细胞层（BC）；由血液或血液成分获得或从骨髓获得的血液制品；干细胞；从血浆分离和在生理溶液或冷冻保护液中悬浮的红细胞；以及从血浆分离的和在生理溶液或冷冻保护液中悬浮的红细胞。生物体液也包括包含骨髓抽吸物的生理溶液。生物液体可能是已经被处理过的，以在根据本发明进行处理之前去除一些白细胞。如在这里所使用的，血液制品或生物体液指的是上述成分和类似的、用其他方式获得的具有类似性质的血液制品或生物体液。
“冷冻保护液”能包括，例如，冷冻保护剂和其混合物，例如但不限于二甲亚砜（DMSO）、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤丝草醇（I-erythritol）、D核糖醇（D-ribitol）、D甘露醇（D-mannitol）、山梨糖醇（D-sorbitol）、无旋光肌醇、D乳糖（D-lactose）、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油醇，和无机盐。示例性的处理溶液包括实在国际公开号WO96/17514中公开的那些溶液。通常，在实施例中，使用DMSO，其低浓度下对细胞是无毒的。应该理解，作为小分子，DMSO自由地渗透细胞，并通过与水结合而改变其耐冻性从而保护细胞内细胞器，并防止因形成冰而造成损害。添加血浆（例如约20-25%的浓度）能增强DMSO的保护作用。
“单位”是来自供血者或从一个单位的全血获得的生物体液的量。它也可以指在一次献血期间抽取的量。通常，单位体积是变化的，该量因患者与患者以及献血与献血而不同。一些血液成分（特别是血小板和白细胞层）的多个单位可以是共用的或组合的，通常通过结合4或5个单位。
如这里所使用的，术语“封闭”指的是这样的系统，即，其允许冷冻保护液或生物体液（例如，供血者血液、血液样品，和/或血液成分）被收集和处理（以及如所希望的操纵，例如，部分的分离、分离成组分、过滤、存放，和保存），而无需对系统进行完全消毒。封闭的系统能是原始制成的，或源自系统组件的连接（利用被称为“无菌对接（sterile docking）”的装置）。示例性的无菌对接装置在例如美国专利4507119、4737214和4913756中公开。
能使用多种材料（包括合成聚合物材料）来生产根据本发明的过滤元件的多孔的白细胞滤除媒介（优选地是，含纤维的多孔白细胞滤除媒介）。合适的合成聚合物材料包括，例如，聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚偏二氟乙烯、聚砜、聚苯醚砜、尼龙6、尼龙66、尼龙6T、尼龙612、尼龙11、和尼龙6的共聚物，其中聚酯例如PBT和PET是更优选的。通常，含纤维的多孔媒介由熔喷纤维制备。例如，美国专利4880548、4925572、5152905和6074869公开了由熔喷纤维制备的多孔的白细胞滤除过滤器和过滤元件。
白细胞滤除过滤元件能具有任何合适的多孔结构，例如孔的尺寸（例如，由泡点或由如美国专利4340479中所描述的KL来表明，或由毛细凝缩流动空隙测量技术表明）、孔容量（pore rating）、孔径（例如，当其特征在于使用如在美国专利4925572中描述的改进的OSU F2测试时），或去除率（其在流体经过元件时减小所关注的一个或多个材料的通过或允许所关注的一个或多个材料的通过）。虽然应该理解白细胞主要通过吸附被去除，但白细胞也能通过过滤被去除。孔结构能被选择成去除至少一定程度的白细胞，同时允许其他组分（例如，血浆、血小板和红血球）经过该孔结构。所使用的孔结构取决于待处理的流体的成分和待处理的流体的所希望的流出物的程度。
过滤元件能具有任何希望的临界润湿表面张力（CWST，如在美国专利4925572中限定的）。CWST能选择在现有技术中已知的，例如，也在如美国专利5152905、5443743、5472621和6074869中公开的。通常，过滤元件具有大于约53dynes/cm（约53×10-5N/cm）的CWST，更常见的是大于约58dynes/cm（约58×10-5N/cm）的CWST，并且能具有约66dynes/cm（约66×10-5N/cm）的CWST。在一些实施例中，元件具有约75dynes/cm（约75×10-5N/cm）或更大的CWST，例如范围为约80至约100dynes/cm（约80至约100×10-5N/cm）。
通过湿法氧化或干法氧化、通过在表面上涂覆或布置聚合物或通过移植反应（grafting reaction）聚合物，能改变元件的表面特征（例如，影响CWST、包括表面电荷（如正电荷或负电荷）、和/或改变表面的极性或亲水性）。这种改变包括例如辐射、极性单体或带电单体（charged monomer），用带电聚合物涂覆和/或固化（curing）表面，以及实现化学改变在表面上附加功能团。通过暴露于能量源（例如气体等离子、水蒸气等离子、电晕放电、加热、范德格拉夫起电机、紫外线、电子束），或暴露于其他形式的辐射，或通过利用等离子体处理进行表面蚀刻或沉积，可激活移植反应。
过滤器和/或过滤元件能包括另外的元件、层或组件，其能具有不同的结构和或功能，例如预过滤、支撑、排出、定距（spacing）和缓冲中的至少一个。
过滤元件（在一些实施例中过滤器包括多个过滤元件）能设置在壳体中，壳体包括至少一个入口和至少一个出口并限定在出口和入口之间的至少一个流体流路，其中过滤元件跨过流体流路，以提供过滤装置。通常，过滤装置是可消毒的。可使用任何形状合适并提供至少一个入口和至少一个出口的壳体。
可选地，过滤元件或包括一个或多个过滤元件的过滤器能布置在多井部件或过滤板中，其中过滤元件或包括一个或多个过滤元件的过滤器布置在井部件中。合适的装置和过滤板是本领域已知的并且在商业中能获得，例如，从颇尔公司（华盛顿港，纽约）的商标为ACROWELLTM和ACROPREPTM和/或如在国际公开号WO2002/096563中所描述的商品获得。
壳体能由任何合适的刚性的防渗材料构成，包括任何防渗的热塑性材料，该材料与正处理的生物体液是相容的。通常，壳体是由聚合物构成。在一些实施例中，聚合物是透明的或半透明的聚合物（如丙烯酸、聚丙烯、聚苯乙烯或聚碳酸酯树脂）。这种壳体容易制造且廉价，并允许观察流体经过壳体。
如所希望的，利用例如粘接剂、溶剂、激光焊、射频密封、超声密封和/或热封，壳体能如本领域已知地被密封。额外地或选择性地，壳体能借助注塑被密封。
下面的实例进一步示出了本发明，当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实例1
该实例显示，在根据本发明的实施例保持红血球污染最小化的同时，白细胞能被纯化并且被大量地回收。
过滤装置是具有Leukosorb型白细胞滤除媒介（颇尔公司，华盛顿港，纽约）的25mm的
Figure BDA00002531046500101
注射器筒过滤器。该装置的入口端口连接至空的5mL注射器筒，输出端口连接至通向废物容器的管状件，9mL的从供血者新鲜收集的血液样品用EDTA或CP2D抗凝血剂处理、借助重力排出、经过过滤器。过滤后的血液被丢弃。
新的5mL注射器筒（包括柱塞）被连接至该装置的输入端口，连接至该装置的输出端口的管状件被放置在含有8μL磷酸盐缓冲液（PBS）的容器（废物容器）中。如图1所示，注射器柱塞被抽回，以从废物容器拉取PBS，（PBS）穿过白细胞滤除媒介的下游表面和上游表面，并进入注射器筒。如图1所示，在PBS被拉入注射器筒之后，注射器柱塞被拉出注射器筒，同时该装置的出口保持与在废物容器中的PBS接触。在每个注射器筒中的PBS随后被排出，借助重力穿过上游表面和下游表面，并进入废物容器。当另一体积的PBS被拉动穿过媒介并被允许排出时（如上所述），洗涤被重复。
如在美国专利6544751中一般地描述的，在PBS中包括6%的葡聚糖（dextran）70的5mL的洗脱液从每个装置的入口经过出口，被洗脱的白细胞被回收。
流入的、流出的且被洗脱的白细胞和红血球被计数。结果如下：
Figure BDA00002531046500111
表1
在每个实例中，与控制组相比，超过85%的白细胞被捕获；与控制组相比，超过60%的白细胞被回收；与控制组相比，1%或更少的红血球存在于被洗脱的白细胞中。
实例2
该实例显示，在根据本发明的实施例纯化和回收白细胞的同时，红血球污染减小。
用于实现该实例的系统100在图2中示出，示出了具有入口端口2和出口端口3的过滤装置1、源袋（血袋）4、废物袋6、白细胞取样袋9、注射器7、注射端口8和夹紧件10－13。
过滤装置是具有白细胞滤除媒介（颇尔公司，华盛顿港，纽约）的用于成分血小板输注的
Figure BDA00002531046500121
PXLA高效去白细胞过滤器。过滤装置1的入口端口2通过管状件和Y形连接器连接至血袋4和白细胞取样袋9，装置的出口端口3连接至管状件（其将另一Y形连接器导通至废物袋6）并连接至注入端口8（其连接至注射器7）。
注射器充满洗脱液并附连至端口8，同时夹紧件12闭合。
为了控制流体，夹紧件布置在位于入口端口、血袋和样品袋之间（夹紧件10和11），并且布置在出口端口、废物袋和注入端口之间（夹紧件12和13）。所有的夹紧件初始是闭合的。
根据标准的血库规程，血袋含有50mL从供血者收集的并混有抗凝血剂的血液。系统被竖直地设置，夹紧件10和13打开，血液借助重力被过滤，进入废物容器6，白细胞被捕获在过滤装置1中的白细胞滤除介质上。
夹紧件13闭合，夹紧件12打开，20mL的PBS洗涤液借助注射器7通过注入端口8被注入，以便洗涤液经过白细胞滤除介质的下游表面和上游表面、进入血袋4。夹紧件10和13被再次打开，洗涤液被允许借助重力排出、经过过滤装置、进入废物袋6。
用新鲜的PBS再一次重复洗涤程序。
注射器7充满洗脱液（PBS中有6%的葡聚糖）并被连接至注入端口8。
夹紧件10和13闭合，夹紧件11和12打开，24μL的洗脱液从注射器7注入注射端口8，以便白细胞利用洗脱液被洗脱并进入取样袋9。
对于一个实验来说，洗涤液没有被排入废物袋，对于另一实验来说，洗涤液被排入废物袋6。另外，白细胞被回收而没有使用洗涤液，对各种过滤的结构进行比较。
结果如下（回收进入洗脱缓冲液的百分比）：
洗涤 白细胞 淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 红细胞 血小板
没有 59 75 77 50 15 25
2次（2X） 65 77 86 56 3.6 18
2次，排入废物袋 62 70 80 56 3.4 19
该结果示出，与不洗涤相比，利用洗涤红血球污染减少超过66%。
实例3
该实例显示，根据本发明的实施例，白细胞能被纯化和溶解，且白细胞核酸能被分析。
过滤装置是具有Leukosorb型白细胞滤除媒介（颇尔公司，华盛顿港，纽约）的25mm的
Figure BDA00002531046500131
注射器式过滤器。
9mL的从供血者新鲜收集的血液样品用EDTA抗凝血剂处理，过程如下。对流入和流出的白细胞进行计数。
对于第一实验，装置的入口端口连接至空的5mL注射器筒，出口端口连接至通向废物容器的管状件，9mL的从供血者新鲜收集的血液样品用EDTA抗凝血剂处理、借助重力排出、经过过滤器。过滤后的血液被抛弃。
新的5mL注射器筒（包括柱塞）被连接至该装置的输入端口，连接至该装置的输出端口的管状件被放置在含有约8μL磷酸盐缓冲液（PBS）的废物容器中。注射器柱塞被抽回，以从容器拉取PBS，（PBS）穿过白细胞滤除媒介的下游表面和上游表面，并进入注射器筒。在PBS被拉入注射器筒之后，注射器柱塞被拉出注射器筒，同时该装置的出口保持与在废物容器中的PBS接触。在每个注射器筒中的PBS随后被排出，借助重力穿过上游表面和下游表面，并进入废物容器。当另一体积的PBS被拉动穿过媒介并被允许排出时（如上所述），洗涤被重复。
2.5mL的PH调节后的裂解液/结合液利用注射器穿过介质，并收集在溶解产物收集管中。溶解产物添加有2.5mL的血清水（nuclease-free water）和蛋白酶K。如在“LeukoLOCKTM总RNA分离系统，球蛋白mRNA-从全血液样本滤除总RNA”指导手册，目录＃AM1923、AM1933、AM1934（手册1923M修订版B）Ambion公司，奥斯汀，德克萨斯（2007）（LeukoLOCKTM总RNA分离系统手册）中描述的，总RNA被分离。
在第二实验中，按照如在LeukoLOCKTM总RNA分离系统手册中描述的过程血液穿过过滤器，白细胞被分离、稳定、溶解，且按照如在LeukoLOCKTM总RNA分离系统手册中的描述总RNA被分离。
白细胞的捕获效率、RNA的产生量，和在260和280nm处的吸光度的光密度比（A260/280）在每个实验中都被测定（determine）。
结果如下：
Figure BDA00002531046500141
该实施例显示，根据本发明的实施例，白细胞的纯化和总RNA的生产量（yield）得到改进。
实例4
该实例显示了，根据本发明的实施例，白细胞能被纯化和溶解，且白细胞基因组DNA能被分析。
如在实例1中描述的，白细胞被纯化和回收。
200μL等分（aliquot）的洗脱后的白细胞被处理，以利用酚/氯仿提取物分离基因组DNA，如本领域已知的。分离的DNA借助紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法和PCR（聚合酶链反应）法被分析。
结果如下（其中K=1000）：
白细胞样品 白细胞浓缩液k/μL DNA生产量，μg/样品 OD 260/280
1 2.95 2.9 1.94
2 2.65 2.5 1.98
3 3.00 3.1 1.82
所获得的DNA的琼脂糖凝胶电泳法示出了高分子量DNA从回收的白细胞分离。DNA是完整的和可扩增的，并通过利用PCR和釉原蛋白引物扩增而示出。
实例5
该实例显示，利用多层白细胞滤除媒介，根据本发明的实施例，白细胞能被纯化和溶解，且白细胞核酸能被分析。
过滤装置是具有4层或8层的Leukosorb型白细胞滤除媒介（颇尔公司，华盛顿港，纽约）的25mm的
Figure BDA00002531046500151
注射器式过滤器。
9mL的从供血者新鲜收集的血液样品用EDTA抗凝血剂处理，被抽入10μL的注射器，处理过程如下。对流入和流出的白细胞进行计数。
装置的入口端口连接至充满的注射器，出口端口连接至通向废物容器的管状件，注射器柱塞被按压，血液样品以3-5滴每秒的流速经过过滤器。过滤后的血液被抛弃。
新的5mL注射器筒（包括柱塞）被连接至该装置的输入端口，连接至该装置的输出端口的管状件被放置在含有8μL磷酸盐缓冲液（PBS）的废物容器中。注射器柱塞被抽回，以从废物容器拉取PBS，（PBS）穿过白细胞滤除媒介的下游表面和上游表面，并进入注射器筒。在PBS被拉入注射器筒之后，注射器柱塞被拉出注射器筒，同时该装置的出口保持与在废物容器中的PBS接触。在每个注射器筒中的PBS随后被排出，借助重力穿过上游表面和下游表面，并并进入废物容器。当另一体积的PBS被拉动穿过媒介并被允许排出时（如上所述），洗涤被重复。
2.5mL的PH调节后的裂解液/结合液利用注射器穿过介质，并收集在溶解产物收集管中。溶解产物添加有2.5mL的血清水和蛋白酶K。如在“LeukoLOCKTM总RNA分离系统，球蛋白mRNA-从全血液样本滤除总RNA”指导手册，目录＃AM1923、AM1933、AM1934（手册1923M修订版B）Ambion公司，奥斯汀，德克萨斯（2007）（LeukoLOCKTM总RNA分离系统手册）中描述的，总RNA被分离。
白细胞的捕获效率、RNA的产生量，和在260和280nm处的吸光度的光密度比（A260/280）被测定。
结果如下：
Figure BDA00002531046500161
实例6
该实例显示，在根据本发明的实施例纯化和回收白细胞的同时，红血球和血小板污染被减少。
图2中示出了用于实现该实例的系统。
过滤装置是具有白细胞滤除媒介（颇尔公司，华盛顿港，纽约）的用于成分血小板输注的
Figure BDA00002531046500162
PXLA高效去白细胞过滤器（Leukocyte Reduction Filter）。过滤装置1的入口端口2通过管状件和Y形连接器连接至血袋4和白细胞取样袋9，装置的出口端口3连接至管状件（其将另一Y形连接器导通至废物袋6）并连接至注入端口8（其连接至注射器7）。该系统被水平地设置在台式部件上，废物袋从台部件的侧部垂挂。
含有50mL的全血（其混有抗凝血剂）和10mL的空气的源袋放置在盒式部件上，以便袋高于台式部件上的过滤器2英寸。废物袋被悬挂在台式部件下面，以防止倒流。夹紧件打开，允许血液从源袋经过过滤器并进入废物袋。在过滤器下面的管状件被夹紧，通过注入端口利用PBS或PBS/葡聚糖溶液（在PBS中含有6%的葡聚糖70），采取总洗涤液20、40、60mL以20mL增量的方式或采取单独40mL或60mL增量的方式，过滤器被反洗，而且洗涤液进入源袋。对于控制组，过滤器不反洗。
洗涤液和细胞在源袋中混合，该系统再次放置在台式部件上，以便源袋高于过滤器2英寸，洗涤袋从台部件的侧部垂挂。混合物从源袋经过过滤器并进入废物袋。
洗涤过程被重复直至达到特定的洗涤体积。
分析结果。不反洗产生约14%的红血球污染，20mL的PBS反洗产生约6.5%的红血球污染，2次20mL的PBS反洗将其降至约3.4%，3次20mL的PBS反洗将其降至约1.8%。
白细胞的回收在不反洗时是约61%，在20mL以及2次20mL的PBS反洗时为约66%，在3次20mL的PBS反洗时为约63%。
相对于PBS/葡聚糖，不反洗时产生约14%的红血球污染并回收约69%的白细胞，以及产生约22%的血小板污染。
使用PBS/葡聚糖减小了红血球污染（20mL的PBS/葡聚糖时为约8%；2次20mL的PBS/葡聚糖时为约3%）和血小板污染（20mL的PBS/葡聚糖和2次20mL的PBS/葡聚糖时均为约9%）。但是，相比于不反洗，使用PBS/葡聚糖减少了白细胞的回收（不反洗时为约69%，20mL的PBS/葡聚糖时为约66%；2次20mL的PBS/葡聚糖时为约56%）。
在另一实验中，比较控制组、2次20mL的PBS反洗、40mL的单独反洗、和60mL的单独反洗的结果，这些结果对于三个反洗来说基本类似（都示出了相对于控制组白细胞回收增加、红血球和血小板污染减小），虽然2次20mL的反洗产生约18%的红血球污染，另一反洗产生约8%红血球污染（相比于控制组的约22%）。
实例7
该实例显示，根据本发明的实施例，在回收白血球的同时DMSO浓度减小。
从供血者收集的血液进入含有EDTA抗凝血剂的
Figure BDA00002531046500181
管（Becton Dickinson公司，富兰克林湖，新泽西）。血液被处理以获得并分离白细胞层（buffy coat）。
含有10%DMSO和90%同一供血者血浆的冷冻保护液被制备、冷冻并与白细胞层混合。获得两个6mL的混合有冷冻保护液的白细胞层的样品。
样品被过滤，白细胞被洗涤并洗脱（如在实例1中大体描述的），但在本实例中白细胞用PBS洗脱，而不是使用包括葡聚糖的洗脱液。
对流入和流出的白细胞进行计数。此外，因为蛋白浓度的变化与DMSO浓度的减小相关，所以原始的总蛋白浓度被测定，因而含有白细胞的洗脱液的中的总蛋白浓度测定。结果如下：
样品 回收白细胞的百分比 剩余DMSO的浓度百分比
1 65 0.11
2 62 0.14
该结果示出在回收白细胞的同时DMSO浓度能下降90%。
实例8
该实例显示，根据本发明的实施例，在使血小板污染最小化的同时，白血球被纯化和回收。
利用如大体在实例1中描述的装置，血液样品被过滤，且白细胞被洗涤和洗脱。
对流入和流出的白细胞和血小板进行计数。结果如下：（其中K=1000）
Figure BDA00002531046500191
实例9
该实例显示，根据本发明的实施例，在纯化和回收白细胞且保持封闭系统的同时，红血球的污染减小。
用于实现该实例的系统100在图3中示出，示出了具有入口端口2和出口端口3的过滤装置1、源袋（血袋）4、废物袋6、白细胞取样袋9、含有洗涤液的注射器7、含有洗脱液的注射器8和夹紧件10－14。
过滤装置是具有白细胞滤除媒介（颇尔公司，华盛顿港，纽约）的用于成分血小板输注的
Figure BDA00002531046500192
PXLA高效去白细胞过滤器。过滤装置1的入口端口2通过管状件和Y形连接器连接至血袋4和白细胞取样袋9，装置的出口端口3通过Y形连接器连接至通向废物袋6的管状件并连接至通向注射器7和8的Y形连接器。
为了控制流体，夹紧件10-14布置在位于入口端口、血袋和样品袋之间（夹紧件10和11），并且布置在出口端口、废物袋以及洗涤注射器和洗脱注射器之间（夹紧件12-14）。所有的夹紧件初始是闭合的。
根据标准的血库规程，血袋含有50mL从供血者收集的并混有抗凝血剂的血液。夹紧件10和13打开，血液借助重力被过滤，进入废物容器6，白细胞被捕获在过滤装置1中的白细胞滤除介质上。
夹紧件13闭合，夹紧件12打开，20mL的PBS洗涤液借助注射器7被注入，以便洗涤液经过白细胞滤除介质的下游表面和上游表面，并进入血袋4。夹紧件12闭合而夹紧件13被再次打开，洗涤液被允许借助重力排出、经过过滤装置进入废物袋6。
用新鲜的PBS再一次重复洗涤程序。洗涤液被排入废物袋6。
夹紧件10和13闭合，夹紧件11和14打开，24μL的洗脱液从注射器8被注入，以便白细胞借助洗脱液被洗脱并进入取样袋9。
类似于实例2中所示出的，该结果示出了，相比于不洗涤，洗涤减小了红血球的污染。此外，该实例示出了，在保持封闭系统的同时能实现本方法的实施例。
所有的参考文献，包括这里引用的公开文献、专利申请、和专利都通过参考而被并入到相同的范围，就像每个文献独立且具体地被涉及以通过参考被并入，并在这里被完整地说明。
在说明本发明的上下文（特别是下面的权利要求中的上下文）中使用的术语“一”和“该”及类似指代都解释为覆盖单数和复数，除非这里有相反的说明或上下文明显有矛盾。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”都解释为开放性术语（即，表示“包括但不限于”），除非有相反提示。这里引用的数值范围只希望用作分别表示落入该范围的每单个数值的简便方法，除非这里有相反的说明，并且每单个数值都被并入说明书中，就像每单个数值在这里被单独引用。这里描述的所有方法能以任何合适的顺序实现，除非这里有相反的说明或上下文明显有矛盾。这里提供的任何和所有实例或示例性表述（如“例如”）只用于更好地说明本发明，不是对本发明的范围进行限制，除非有相反的要求。说明书中的表述不应解释为指代任何没要求保护的对于本发明的实践很重要的元件。
这里描述了本发明的优选实施例，包括发明人已知的用于实现本发明的最佳模式。当阅读前述的说明时，这些优选实施例的变型对于本领域的技术人员将变得明显。发明人希望本领域技术人员使用合适的变型，发明人希望本发明以不同于这里的详细说明来实现本发明。因此，本发明包括专利法所允许的这里所附的权利要求中记载的主题的所有的改变和等价物。而且，上述元件以其所有可能的变型进行的任意结合都被本发明涵盖，除非这里有相反的说明或上下文明显有矛盾。

Claims (16)

1.一种用于纯化白细胞的方法，该方法包括：
（a）使包含白细胞的生物体液或包含白细胞的冷冻保护液经过具有上游表面和下游表面的多孔的白细胞滤除介质，该生物体液或冷冻保护液从上游表面穿过下游表面，其中白细胞由白细胞滤除介质保留；
（b）使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质；和
（c）使洗涤液借助重力从上游表面穿过下游表面而经过白细胞滤除介质。
2.根据权利要求1所述的方法，包括使生物体液或冷冻保护液借助重力穿过多孔的白细胞滤除介质。
3.根据权利要求1所述的方法，包括使生物体液或冷冻保护液借助真空穿过多孔的白细胞滤除介质。
4.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，还包括利用另外的洗涤液重复（b）和（c）至少一次。
5.根据权利要求1－4中任一项所述的方法，其中冷冻保护液包括DMSO。
6.根据权利要求1－5中任一项所述的方法，其中使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质包括在上游表面的上游形成真空。
7.根据权利要求1－5中任一项所述的方法，其中使洗涤液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质包括在下游表面的下游形成正压。
8.根据权利要求1－7中任一项所述的方法，还包括通过使洗脱液从下游表面穿过上游表面而经过白细胞滤除介质来从白细胞滤除介质洗脱白细胞，和回收被洗脱的白细胞。
9.根据权利要求1－7中任一项所述的方法，还包括溶解被保留的白细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括处理来自被溶解的白细胞的核酸。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括纯化来自被溶解的白细胞的核酸。
12.根据权利要求10或11所述的方法，还包括分析来自被溶解的白细胞的核酸。
13.根据权利要求12所述的方法，包括测定来自被溶解的白细胞的总RNA。
14.根据权利要求12所述的方法，包括滤除来自被溶解的白细胞的mRNA。
15.根据权利要求1－14中任一项所述的方法，利用多井装置来实现该方法，所述多井装置具有多个井部件，每个井部件中具有多孔的白细胞滤除介质，其中生物体液和洗涤液的各自部分穿过在各井部件中的白细胞滤除介质。
16.根据权利要求8所述的方法，还包括向一对象使用被洗脱的白细胞。
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