CN111304049A - 一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法 - Google Patents

一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法，属于细胞外囊泡分离技术领域。样品管与循环泵连接，循环泵通过至少一个入口与过滤器连接；过滤器中设置有滤膜，滤膜用于截留大于该滤膜孔径的细胞外囊泡，并用于过滤杂质；滤膜用于将截留的部分通过至少一个上出口返回到样品管中，并用于将过滤的部分通过下出口进入收集管。将含有细胞外囊泡样品注入样品管，经循环泵导入到过滤器中，细胞外囊泡被滤膜截留并通过上出口返回至样品管中，而样品中的杂质及小分子穿过滤膜流至收集管，如此循环，就可以逐步富集浓缩样品中的细胞外囊泡，并有效去除背景杂质。将上述平台串联并加载不同孔径滤膜，可以实现不同尺寸下细胞外囊泡高效分离纯化。

Description

一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法
技术领域
本发明属于细胞外囊泡分离技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是具有双层膜结构的纳米级膜囊泡，来源于细胞分泌或细胞膜脱落，直径约为30-2000nm。细胞外囊泡也广泛存在于各种体液中，如唾液、尿液、血液、乳汁、腹水和脑脊液等。其携带有丰富的细胞来源的生物标志物，如蛋白质、脂类、核酸(DNA、RNA)等，是预后循环生物标志物的重要载体；并参与众多细胞关键过程，如细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等，此外，细胞外囊泡来源于细胞，具有生物相容性好、低免疫原性及易于生物标记优势，有望作为新型药物载体。因此，细胞外囊泡相关研究具有重要科学价值。
传统分离和纯化细胞外囊泡的方法有超速离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、免疫磁珠法、以及聚乙二醇(PEG)沉淀法。上述方法虽然各有优点，但存在耗时长，产量低以及纯度低等缺点，大大限制了其在临床上的进一步应用。前述可知，细胞外囊泡尺寸在30-1000nm范围，采用对应孔径的纳米膜可以对其进行有效全分离和纯化，借助多级过滤可进一步实现细胞外囊泡尺寸分级，可获取不同的亚型细胞外囊泡。比如，Rho等人首次报道了一种过滤辅助微流控装置，能够快速、灵敏地检测红细胞分泌的细胞外囊泡，对其进行靶向磁性纳米颗粒标记，并利用小型核磁共振系统进行检测，使细胞外囊泡精确定量以及关键分子标记(CD44、CD47、CD55)的检测成为可能(Acs Nano,Dec,2013,7(12):11227-11233)。Woo等人进一步集成两个滤膜，提出了一种快速、无标签、高灵敏度的细胞外囊泡分离和定量微流控平台(Exodisc)(Acs Nano,Feb,2017,11(2):1360-1370)，在30分钟内实现了20-600nm大小胞外囊泡的全自动纯化，回收率达到了95％。与金标准的超离心方法相比，此法获取细胞外囊泡内mRNA高达100倍。Dong等人报道了一种借助纳米结构光子晶体(Photoniccrystals,PC)荧光增强特性和双过滤分离单元的微流控集成芯片进行了细胞外囊泡的超敏检测，检测线低至8.9×103细胞外囊泡/mL(Lab on a chip,Sep 7,2019,19(17):2897-2904)。最近，Utkan Demirci等人则报道了一种基于纳米膜过滤的全细胞外囊泡分离分析平台(Exosome total isolation chip，ExoTIC)，具有简单、易用、模块化等优点，便于快速从体液(包括血浆、尿液和灌洗液等)中分离得到高纯度的细胞外囊泡，同时可以根据大小对不同种类的癌细胞系细胞外囊泡进行分类(Acs Nano,Nov,2017,11(11):10712-10723)。与传统的超速离心相比，该平台获取细胞外囊泡产量高至1000倍。但上述方法大多借助单一过滤方式，对小体积(5毫升以内)比较有效。一旦样品体积增大至几十毫升甚至几百毫升时，随着过滤时间的延长，滤膜上累积的细胞外囊泡越来越多，过滤效率大大降低，过滤压力也逐步增大，导致滤膜破裂。而载药用的细胞外囊泡，使用量都比较大，目前大多还是借助传统的超速离心法。因此开发一种简单高效，低成本的超高通量，大体积样品下的细胞外囊泡分离及纯化方法尤为必要。在此基础上进一步实现细胞外囊泡尺寸分级，并获取不同的亚型细胞外囊泡对研究潜在信号分子机制及生物标记物都至关重要。
发明内容
本发明解决了现有技术中细胞外囊泡分离纯化平台纯化细胞外囊泡耗时长，纯度和产量比较低以及难以有效实现大体积样品分离纯化的缺点，提供了一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法。将含有细胞外囊泡样品注入样品管，经循环泵导入到过滤器中，由于滤膜尺寸效应，细胞外囊泡被截留并通过上出口返回至样品管中，而样品中的杂质及小分子穿过滤膜流至收集管，如此循环，就可以逐步浓缩样品中的细胞外囊泡，并有效去除背景杂质；将上述装置串联并加载不同孔径滤膜，可以实现不同尺寸细胞外囊泡高效分离纯化。本发明中的方法纯度和产量相对于现有技术均提高了，且耗时更短，能实现大体积样品中细胞外囊泡的分离纯化。
按照本发明的第一方面，提供了一种细胞外囊泡循环分离纯化平台，包括样品管、循环泵、过滤器、流速阀和收集管；所述样品管与循环泵连接，所述循环泵通过至少一个入口与过滤器连接，所述循环泵用于将待分离样液通过所述至少一个入口泵入过滤器；所述过滤器中设置有滤膜，所述滤膜用于截留大于该滤膜孔径的待分离样液中的细胞外囊泡，并用于过滤待分离样液中的杂质；所述滤膜用于将截留的部分通过至少一个上出口返回到样品管中，所述上出口与样品管之间连接有流速阀，所述流速阀用于控制滤膜截留的部分返回样品管的速度；所述滤膜用于将过滤的部分通过下出口进入收集管。
优选地，所述滤膜的孔径为30nm-1000nm，所述滤膜为亲水聚碳酸酯膜或多孔氧化铝膜。
优选地，所述入口的数量为2-5个，所述上出口的数量为2-5个。
按照本发明的另一方面，提供了一种多级细胞外囊泡循环分离纯化平台，包括依次连接的至少两级细胞外囊泡循环分离纯化平台；任一级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台包括样品管、循环泵、过滤器和流速阀，所述样品管与循环泵连接，所述循环泵通过至少一个入口与过滤器连接，所述循环泵用于将待分离样液通过所述至少一个入口泵入过滤器；所述过滤器中设置有滤膜，所述滤膜用于截留待分离样液中大于该滤膜孔径的细胞外囊泡，并用于过滤待分离样液中的杂质；所述滤膜用于将截留的部分通过至少一个上出口返回到样品管中，所述上出口与样品管之间连接有流速阀，所述流速阀用于控制滤膜截留的部分返回样品管的速度；
第一级至倒数第二级中任一级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的下出口与下一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管连接，最后一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的下出口与收集管连接；各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜的孔径逐级减小。
优选地，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜的孔径均为30nm-1000nm，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜均为亲水聚碳酸酯膜或多孔氧化铝膜。
优选地，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的入口的数量均为2-5个，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的上出口的数量均为2-5个。
按照本发明的另一方面，提供了运用任一所述的细胞外囊泡循环分离纯化平台进行分离纯化细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
S1：将待分离样液加入样品管中，所述待分离样液通过循环泵从入口泵入过滤器中；
S2：所述待分离样液中孔径小于滤膜孔径的杂质通过滤膜，并通过下出口进入收集管中；所述待分离样液中孔径大于滤膜孔径的细胞外囊泡被截留，并通过上出口流经流速阀，然后返回至样品管中，进行循环纯化，得到纯化浓缩的细胞外囊泡。
优选地，所述步骤S1中待分离样液通过循环泵的速度大于步骤S2中细胞外囊泡流经流速阀的速度。
按照本发明的另一方面，提供了运用任一所述的多级细胞外囊泡循环分离纯化平台进行分离纯化细胞外囊泡的方法，具体包括以下步骤：
S1：将待分离样液加入到首级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管中，所述待分离样液通过循环泵从入口泵入过滤器中；
S2：所述待分离样液中孔径大于该首级细胞外囊泡循环分离纯化平台中滤膜孔径的细胞外囊泡被截留，并通过上出口流经流速阀，然后返回至样品管中，进行循环纯化，得到大于该首级细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜孔径的细胞外囊泡；所述待分离样液中孔径小于该首级细胞外囊泡循环分离纯化平台中滤膜孔径的细胞外囊泡和杂质通过滤膜，并通过下出口进入下一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管中，进行循环纯化，得到大于该下一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜孔径的细胞外囊泡；按照前一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的下出口中的样液进入相邻后一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管中，进行多级分离纯化，由此逐步浓缩样品中的细胞外囊泡，得到不同尺寸的细胞外囊泡。
优选地，所述步骤S1中待分离样液通过循环泵的速度大于步骤S2中细胞外囊泡流经流速阀的速度。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)相较于传统超速离心法存在耗时长(10-20小时)，背景杂质比较高，成本高缺点，本发明能有效缩短细胞外囊泡处理时间(以200mL为例，整个过程在5小时内完成)；同时本发明采用的循环过滤方式进行细胞外囊泡分离和纯化，即边过滤边浓缩，在此过程中，一方面能实现细胞外囊泡逐步浓缩；另一方面，每一次过滤也是一个去除杂质的过滤，能有效提高所分离细胞外囊泡的纯度；超速离心法需要专业离心机，仪器比较昂贵，本发明中只需简单循环泵、流速阀及过滤器等即可，成本低，操作方便；此外，相较于超速离心(十万离心力)过程中对细胞外囊泡的损害，本发明纯化细胞囊泡过程比较轻柔，能够获得比较完整的细胞外囊泡。
(2)相较于单一膜过滤法或传统膜过滤方法，因其只有单一入口和对应单一出口，当处理样品体积大时(>5mL)，随着过滤的进行，滤膜上累积的细胞外囊泡逐渐增多累积，会导致滤膜阻塞，过滤压力增大，进而增大滤膜破裂的风险，本发明借助径向流和侧向流特点，在过滤过程中，通过侧向流的作用，能有效冲刷累加在膜表面的细胞外囊泡，降低滤膜阻塞风险，提高细胞外囊泡分离纯化效率，实现大体积下细胞外囊泡的分离纯化。
(3)相较于前述超速离心或过滤法，其实现的是对总的细胞外囊泡分离，包含各个尺寸大小，本发明提出的循环过滤串联方法，可以实现不同尺寸下细胞外囊泡的有效纯化。
附图说明
图1是本发明细胞外囊泡循环分离纯化平台示意图；
图2是本发明细胞外囊泡循环分离纯化平台示意图；
图3是本发明细胞外囊泡循环分离纯化平台示意图；
图4是本发明多级细胞外囊泡循环分离纯化平台示意图；
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1-样品管、2-循环泵、3-过滤器、4-流速阀、5-收集管、6-入口、7-滤膜、8-上出口、9-下出口。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
如图1所示，过滤器3由上层和下层组成，上层和下层之间有滤膜7，上层有一个入口6和一个上出口8，下层有一个下出口9，滤膜7为孔径30nm亲水聚碳酸酯膜，循环泵2选为蠕动泵；
将含有细胞外囊泡混合样品注入样品管1，经循环泵2导入到过滤器3的入口6中，借助流速阀4调节上出口8的流速低于入口6，由于滤膜7尺寸效应，大于30nm细胞外囊泡被截留并通过其中上出口8返回至样品管1中，而样品中的杂质及小分子穿过滤膜7经下出口9流至收集管5，如此循环，就可以逐步浓缩样品中的细胞外囊泡，并有效去除背景杂质。
实施例2
如图2所示，过滤器3由上层和下层组成，上层和下层之间有滤膜7，上层有一个入口6和两个上出口8，下层有一个下出口9，滤膜7为孔径200nm亲水聚碳酸酯膜，循环泵2选为蠕动泵；
将含有细胞外囊泡混合样品注入样品管1，经循环泵2导入到过滤器3的入口6中，由于滤膜7尺寸效应，200nm以上的细胞外囊泡被截留并通过同一侧的两个上出口8返回至样品管1中，而样品中的杂质及小分子穿过滤膜经下出口9流至收集管5，如此循环，就可以逐步浓缩样品中的细胞外囊泡，并有效去除背景杂质。
实施例3
如图3所示，过滤器3由上层和下层组成，上层和下层之间有滤膜7，上层有两个入口6和一个上出口8，下层有一个下出口9，滤膜7为孔径500nm多孔阳极氧化铝膜，循环泵2选为蠕动泵；
将含有细胞外囊泡混合样品注入样品管1，经循环泵2导入到过滤器3的两个入口6中，由于滤膜7尺寸效应，200nm以上的细胞外囊泡被截留并通过上出口8返回至样品管1中，而样品中的杂质及小分子穿过滤膜经下出口9流至收集管1，如此循环，就可以逐步浓缩样品中的细胞外囊泡，并有效去除背景杂质。
实施例4
如图4所示，包括三级细胞外囊泡循环分离纯化平台，每一级平台中，过滤器3由上层和下层组成，上层和下层之间有滤膜7，上层有一个入口6和一个上出口8，下层有一个下出口9；第一级平台中过滤器3中滤膜7孔径为500nm，能有效纯化500纳米以上的细胞外囊泡，第二级平台中过滤器3中滤膜7孔径为200nm，能有效纯化200-500纳米尺寸的细胞外囊泡，第三级平台中过滤器3中滤膜7孔径为30nm，能有效纯化30-200nm纳米尺寸的细胞外囊泡；三级平台中的滤膜7为亲水聚碳酸酯膜，循环泵2选为隔膜泵。
将含有细胞外囊泡混合样品注入样品管1，经循环泵2导入到过滤器3入口6，由于滤膜7尺寸效应，粒径大于500纳米细胞外囊泡被截留并通过其中上出口8返回至样品管1中，而500纳米以下的细胞外囊泡及样品中的杂质及小分子穿过滤膜7经下出口9流至第二级平台的过滤器3，并由于第二级平台滤膜7尺寸效应，粒径大于200纳米细胞外囊泡被截留并通过第二级平台的上出口8返回至第二级平台的样品管1中，而200纳米以下的细胞外囊泡及样品中的杂质及小分子穿过第二级平台的滤膜7经下出口9流至第三级平台的过滤器3，并由于第三级平台的滤膜7尺寸效应，粒径大于30纳米细胞外囊泡被截留并通过第三级平台的上出口8返回至第三级平台的样品管1中，而30纳米以下的细胞外囊泡及样品中的杂质及小分子穿过滤膜经第三级平台的下出口9流至最后收集管5，实现纯化不同纳米尺寸的细胞外囊泡。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞外囊泡循环分离纯化平台，其特征在于，包括样品管(1)、循环泵(2)、过滤器(3)、流速阀(4)和收集管(5)；所述样品管(1)与循环泵(2)连接，所述循环泵(2)通过至少一个入口(6)与过滤器(3)连接，所述循环泵(2)用于将待分离样液通过所述至少一个入口(6)泵入过滤器(3)；所述过滤器(3)中设置有滤膜(7)，所述滤膜(7)用于截留大于该滤膜(7)孔径的待分离样液中的细胞外囊泡，并用于过滤待分离样液中的杂质；所述滤膜(7)用于将截留的部分通过至少一个上出口(8)返回到样品管(1)中，所述上出口(8)与样品管(1)之间连接有流速阀(4)，所述流速阀(4)用于控制滤膜(7)截留的部分返回样品管(1)的速度；所述滤膜(7)用于将过滤的部分通过下出口(9)进入收集管(5)。
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡循环分离纯化平台，其特征在于，所述滤膜(7)的孔径为30nm-1000nm，所述滤膜(7)为亲水聚碳酸酯膜或多孔氧化铝膜。
3.如权利要求1所述的细胞外囊泡循环分离纯化平台，其特征在于，所述入口(6)的数量为2-5个，所述上出口(8)的数量为2-5个。
4.一种多级细胞外囊泡循环分离纯化平台，其特征在于，包括依次连接的至少两级细胞外囊泡循环分离纯化平台；任一级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台包括样品管(1)、循环泵(2)、过滤器(3)和流速阀(4)，所述样品管(1)与循环泵(2)连接，所述循环泵(2)通过至少一个入口(6)与过滤器(3)连接，所述循环泵(2)用于将待分离样液通过所述至少一个入口(6)泵入过滤器(3)；所述过滤器(3)中设置有滤膜(7)，所述滤膜(7)用于截留待分离样液中大于该滤膜(7)孔径的细胞外囊泡，并用于过滤待分离样液中的杂质；所述滤膜(7)用于将截留的部分通过至少一个上出口(8)返回到样品管(1)中，所述上出口(8)与样品管(1)之间连接有流速阀(4)，所述流速阀(4)用于控制滤膜(7)截留的部分返回样品管(1)的速度；
第一级至倒数第二级中任一级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的下出口(9)与下一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管(1)连接，最后一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的下出口(9)与收集管(5)连接；各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜(7)的孔径逐级减小。
5.如权利要求4所述的多级细胞外囊泡循环分离纯化平台，其特征在于，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜(7)的孔径均为30nm-1000nm，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜(7)均为亲水聚碳酸酯膜或多孔氧化铝膜。
6.如权利要求4所述的多级细胞外囊泡循环分离纯化平台，其特征在于，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的入口(6)的数量均为2-5个，各级所述细胞外囊泡循环分离纯化平台的上出口(8)的数量均为2-5个。
7.运用权利要求1-3任一所述的细胞外囊泡循环分离纯化平台进行分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将待分离样液加入样品管(1)中，所述待分离样液通过循环泵(2)从入口(6)泵入过滤器(3)中；
S2：所述待分离样液中孔径小于滤膜(7)孔径的杂质通过滤膜(7)，并通过下出口(9)进入收集管(5)中；所述待分离样液中孔径大于滤膜(7)孔径的细胞外囊泡被截留，并通过上出口(8)流经流速阀(4)，然后返回至样品管(1)中，进行循环纯化，得到纯化浓缩的细胞外囊泡。
8.如权利要求7所述的分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述步骤S1中待分离样液通过循环泵(2)的速度大于步骤S2中细胞外囊泡流经流速阀(4)的速度。
9.运用权利要求4-6任一所述的多级细胞外囊泡循环分离纯化平台进行分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1：将待分离样液加入到首级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管(1)中，所述待分离样液通过循环泵(2)从入口(6)泵入过滤器(3)中；
S2：所述待分离样液中孔径大于该首级细胞外囊泡循环分离纯化平台中滤膜(7)孔径的细胞外囊泡被截留，并通过上出口(8)流经流速阀(4)，然后返回至样品管(1)中，进行循环纯化，得到大于该首级细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜(7)孔径的细胞外囊泡；所述待分离样液中孔径小于该首级细胞外囊泡循环分离纯化平台中滤膜(7)孔径的细胞外囊泡和杂质通过滤膜(7)，并通过下出口(9)进入下一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管(1)中，进行循环纯化，得到大于该下一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的滤膜(7)孔径的细胞外囊泡；按照前一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的下出口(9)中的样液进入相邻后一级细胞外囊泡循环分离纯化平台的样品管(1)中，进行多级分离纯化，由此逐步浓缩样品中的细胞外囊泡，得到不同尺寸的细胞外囊泡。
10.如权利要求9所述的分离纯化细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述步骤S1中待分离样液通过循环泵(2)的速度大于步骤S2中细胞外囊泡流经流速阀(4)的速度。
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