CN110669637A - 基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法，包括由上至下依次连接的上层进样池、上层硅胶胶圈、上层微孔滤膜、上层引流管、上层卡夹、下层进样池、下层硅胶胶圈、下层微孔滤膜、下层引流管以及下层卡夹；上层、下层进样池均为空心圆柱体；上层、下层进样池的底部分别设置有上层、下层进样口；进样池与引流管依靠卡夹紧密连接；上层引流管的下端依次穿过上层卡夹的中部、穿入下层进样池的内部。双层微孔滤膜均具备很好的柔性，可在过滤完之后取下，直接折叠后放入EP管中进行后续检测，与下游检测技术高度兼容。本发明主要依靠真菌孢子与体液中其他细胞之间的物理性质差异，从而针对不同目标进行选择性地分离、富集。

Description

基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法
技术领域
本申请涉及先进制造加工与生物医学技术领域，特别是涉及基于真菌孢子与背景细胞物理性质(如尺寸大小和变形能力)差异的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法。
背景技术
全球范围内侵袭性真菌病每年造成1150万例严重感染，并导致了约150万人的死亡，已经成为严重威胁人民生命安全的重要疾病之一。但到目前为止，对于造成严重后果的侵袭性真菌病，特别是真菌入血后的真菌血症，仍然没有快速、精准的诊断方法。在其它体液，例如尿液、痰液中，也可能存在真菌。
以真菌血症中最常见的念珠菌血症为例，感染2日后，死亡率>40％；但如果当日得到治疗，死亡率可降至15％左右。通常有50％以上的病例无法在患者生前拿到有效的诊断证据(具体可参考如下文献：Matthew Morrell,Victoria J.Fraser and MarinH.Kollef.Delaying the Empiric Treatment of Candida Bloodstream Infectionuntil Positive Blood Culture Results Are Obtained:a Potential Risk Factor forHospital Mortality.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Aug 2005,49(9)3640-364)。由于血液中病原载量很低，真菌血症的确诊仍依赖于血培养，其诊断耗时长，仅培养就需要3-7天，并且阳性率不足10％。基于血清免疫学的方法虽然部分弥补了培养方法敏感性低的问题，但不能鉴定病原至“种”水平，因此无法指导临床精准用药。基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学诊断，虽特异性高，但受限于血液中孢子分离效率低，直接检测的敏感性不足，目前仍难以应用于临床诊断。因此高效、高纯度分离与检测血液中痕量真菌孢子一直是真菌血症诊断的要点和难点。同样的，从其他体液样本中高效、高纯度分离与检测真菌也十分重要。
近年来，随着微米/纳米技术的快速发展，应用微纳加工手段制备出相应的微纳流控器件，以期高效地从各种体液中分离病原体并进行后续分子检测，已成为当前研究的热点方向。许多研究者利用真菌孢子物理参数异于常规细胞(例如白细胞和红细胞)的特点，基于这些物理属性(如尺寸、介电性等)的差异而开发了基于微纳流控芯片的真菌孢子分离与富集技术。由于微流控技术能够精确可控地区分上述物理性质参数而广受关注。麻省总医院的Mehmet Toner教授通过惯性微流控芯片实现了血液中真菌孢子的快速分离与检测，我国中科院微生物所杜文斌研究员与协和医院合作应用微流控技术也成功实现了细菌等病原体的介电电泳分离与PCR检测。
然而，受限于芯片尺寸小、流阻大等因素制约，微纳流控芯片体积操作通量低、耗时长，无法操作较大体积的样品，因此难以解决真菌孢子在体液中载量低的问题，距离临床实际应用仍有较大距离。
发明内容
本申请提供一种基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法，以解决上述提到的问题。
基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，包括由上至下依次连接的上层进样池、上层硅胶胶圈、上层微孔滤膜、上层引流管、上层卡夹、下层进样池、下层硅胶胶圈、下层微孔滤膜、下层引流管以及下层卡夹；
所述上层进样池以及所述下层进样池均为空心圆柱体；所述上层进样池的底部设置有上层进样口；所述下层进样池的底部设置有下层进样口；
所述上层进样池与所述上层引流管依靠所述上层卡夹紧密连接；所述下层进样池与所述下层引流管依靠所述下层卡夹紧密连接；
所述上层引流管的下端依次穿过所述上层卡夹的中部、穿入所述下层进样池的内部；
其中，所述上层微孔滤膜的微孔孔径小于待去除的大细胞的直径，且所述上层微孔滤膜的微孔孔径大于真菌孢子的直径与待去除的小细胞的直径；所述下层微孔滤膜的微孔孔径小于真菌孢子的直径，使得含有待去除细胞的体液在经过所述上层微孔滤膜时避免待去除的大细胞穿过所述上层微孔滤膜，同时使得真菌孢子和待去除的小细胞穿过所述上层微孔滤膜，再使得真菌孢子残留在所述下层微孔滤膜上。
进一步地，所述上层微孔滤膜和所述下层微孔滤膜均采用聚对二甲苯Parylene C制成。
进一步地，所述上层微孔滤膜的微孔与微孔之间的间距和所述下层微孔滤膜的微孔与微孔之间的间距均小于非俘获目标的直径。
进一步地，所述上层微孔滤膜和所述下层微孔滤膜的微孔形状为正六边形或正方形。
进一步地，所述上层硅胶胶圈设置在所述上层进样口的下边缘；所述上层硅胶胶圈用于避免体液在经过所述上层微孔滤膜时从侧面漏出；
所述下层硅胶胶圈设置在所述下层进样口的上边缘；所述下层硅胶胶圈用于避免经过所述上层微孔滤膜过滤后的体液在经过所述下层微孔滤膜时从侧面漏出。
进一步地，所述上层进样池、所述上层引流管、所述下层进样池以及所述下层引流管均采用树脂材料制成。
进一步地，包括基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置和离心管；
所述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置放置在所述离心管中；其中，所述上层进样池、所述上层引流管、所述下层进样池以及所述下层引流管各自的最宽处外径与所述离心管的内径匹配。
进一步地，所述离心管为50mL普通离心管。
进一步地，所述分离方法应用于应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，所述分离方法包括以下步骤：
步骤S11，使用75％乙醇润湿所述上层微孔滤膜；
步骤S12，使用磷酸盐缓冲液冲洗所述上层微孔滤膜，除去所述上层微孔滤膜上残留的75％乙醇；
步骤S13，将体液从所述上层进样池加入所述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置中；
步骤S14，在重力的驱动下，所述体液通过所述上层微孔滤膜；其中，在重力的驱动下，所述体液中的待去除的大细胞被滞留在所述上层微孔滤膜上，而所述体液中的真菌孢子、待去除的小细胞以及其余体液穿过所述上层微孔滤膜，进入所述上层引流管后流入所述下层进样池，并与所述下层微孔滤膜接触；
步骤S15，取出所述上层微孔滤膜，读出结果；
步骤S16，对取下了所述上层进样池、所述上层微孔滤膜、所述上层引流管、所述上层卡夹的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统施加外力，使得所述真菌孢子滞留在所述下层微孔滤膜上，所述待去除的小细胞和其余体液穿过所述下层微孔滤膜，通过所述下层引流管进入所述离心管的底部；
步骤S17，使用磷酸盐缓冲液，冲洗所述下层微孔滤膜；
步骤S18，取下所述下层微孔滤膜，使用钙荧光白对下层微孔滤膜进行染色，在荧光显微镜下检测是否存在真菌孢子；之后将下层微孔滤膜直接折叠放入Eppendorf管中，加入裂解液，进行高温加热提取DNA，再进行多聚酶链式反应进行分子水平检测，所述分子水平检测用于检测真菌孢子的种类和含量数据。与现有技术相比，本申请包括以下优点：
本发明提供的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，基于双层微孔滤膜，对各种体液中的真菌孢子进行富集回收，其主要依靠真菌孢子与体液中其他细胞之间的尺寸差异和变形能力差异，从而针对不同目标进行选择性地分离、富集。
本发明提供的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统具有快速、高效的从各种体液中分离、富集真菌孢子的优点，可为下游的真菌孢子检测鉴定提供高纯度、高浓度的样本，极大地提高了病原体检测的时间和准确性。
本发明提供的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置、应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统及其使用方法，能够高效地去除体液中的较大尺寸细胞(例如白细胞)和较小尺寸细胞(例如红细胞)，从而实现高效、高纯度地分离体液中的真菌孢子，从而高纯度地俘获真菌孢子。
本发明提供的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其中的微孔滤膜具有很好的柔性，可以在过滤完之后取下，折叠后直接放入Eppendorf管中进行裂解和后续的多聚酶链式反应(PCR)检测，与下游的检测技术有高度兼容性。
本发明通过分层设计，将双层滤膜集成到同一个装置中，并与常规50mL离心管兼容，成功实现了“双层过滤-离心辅助”的体液中真菌孢子的高效、高纯度分离方法；同时用硅胶胶圈对滤膜处进行密封，有效地防止液体样本漏出，进一步提高了分离、富集效率。
附图说明
图1是本发明中基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的分解结构示意图；
图2是本发明中的图1的侧面结构示意图；
图3是本发明中上层微孔滤膜的结构示意图；其中，微孔为六边形；
图4是本发明中下层微孔滤膜的结构示意图；其中，微孔为正方形；
图5-a是本发明中应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统结构示意图；
图5-b是本发明中体液(以全血为例)在接触上层微孔滤膜时的结构示意图；
图5-c是本发明中体液(以全血为例)中的待去除的较大尺寸细胞(以白细胞为例)被上层微孔滤膜拦截、真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(以红细胞为例)被下层微孔滤膜拦截时的结构示意图；
图5-d是本发明中在离心后真菌孢子留在下层微孔滤膜上、待去除的较小尺寸细胞(以红细胞为例)脱离下层微孔滤膜时的结构示意图；
图6是本实施例中使用不同微孔孔径的滤膜实现高效、高纯度分离体液(以全血为例)中真菌孢子的回收率结果对比图；
图7是104/mL浓度的白色念珠菌孢子加入磷酸盐缓冲液中回收后的典型荧光照片；
图8是阳性临床样本中回收的真菌孢子的典型荧光照片；
图9是103/mL-107/mL浓度的白色念珠菌孢子加入磷酸盐缓冲液中回收后的典型PCR扩增曲线；
图10是应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统的分离方法流程图。
附图标记为：
1-上层进样池，2-上层进样口，3-上层硅胶胶圈，4-上层微孔滤膜，5-上层出样口，6-上层引流管，7-上层卡夹，8-下层进样池，9-下层进样口，10-下层硅胶胶圈，11-下层微孔滤膜，12-下层出样口，13-下层引流管，14-下层卡夹，15-离心管。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细的说明。
如图1和图2所示，基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，包括由上至下依次连接的上层进样池1、上层硅胶胶圈3、上层微孔滤膜4、上层引流管6、上层卡夹7、下层进样池8、下层硅胶胶圈10、下层微孔滤膜11、下层引流管13以及下层卡夹14；
所述上层进样池1以及所述下层进样池8均为空心圆柱体；所述上层进样池1的底部设置有上层进样口2；所述下层进样池8的底部设置有下层进样口9；
其中，所述上层微孔滤膜4的孔径小于待去除的较大尺寸细胞(即待去除的大细胞，例如白细胞)的直径而大于真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(即待去除的小细胞，例如红细胞)直径，所述下层微孔滤膜11的微孔孔径小于所述上层微孔滤膜4的微孔孔径以及真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)直径，使得体液在经过所述上层微孔滤膜4时避免待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)穿过所述上层微孔滤膜4，同时使得真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)穿过所述上层微孔滤膜4并残留在所述下层微孔滤膜上11。
所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11均采用聚对二甲苯Parylene C制成。所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11是基于微机电系统工艺(Parylene MEMS工艺)采用聚对二甲苯Parylene C制成的，具有柔性，同时具有较高地机械强度。聚对二甲苯Parylene C具有的特征是可耐高温、且化学稳定性好，可以直接兼容后续多聚酶链式反应(PCR)检测技术体系。
本实施例提供所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11是一种具有极高孔隙率(可达91.3％)的高通量微孔滤膜，该微孔滤膜通量可达水性样本>117mL/min，未稀释全血>17mL/min(具体可参考如下文献：Yaoping Liu,Tingyu Li,Mingxin Xu,Wei Zhang,YanXiong,Ligong Nie,Qi Wang,Haichao Li and Wei Wang.A High-throughput LiquidBiopsy for Rapid Rare Cell Separation from Large-volume Samples,Lab chip,2019,19,68-78；以及Yaoping Liu,Han Xu,Wangzhi Dai,Haichao Li and Wei Wang.2.5-Dimensional Parylene C micropore array with a large area and a high porosityfor high-throughput particle and cell separation.Microsyst.Nanoeng,2018,4(1),13)，极大地缩短了检测耗时并增大了可处理样本体积。本实施例基于此提出了一种基于“双层过滤-离心辅助”的真菌孢子分离方式，以实现各种体液中痕量真菌孢子的高效、高纯度分离。
所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11两层滤膜的微孔的孔径不相同，所述上层微孔滤膜4的微孔孔径大于所述下层微孔滤膜11的微孔孔径。其中，所述上层微孔滤膜4的微孔孔径较大，用以根据细胞尺寸俘获去除体液中的待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)，使真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)穿过上层微孔滤膜4；而所述下层微孔滤膜11的微孔孔径较小，用以俘获回收体液中尺寸较小的真菌孢子和待去除细胞(例如红细胞)，使其滞留在所述下层微孔滤膜11上。
滞留在下层微孔滤膜11真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)，使用基于离心的方法(离心转速和时间可调控，以适配不同体积、浓度、粘度、细胞载量的体液样本)，分离出下层微孔滤膜11上已经俘获的、变形能力较差的真菌孢子；在经过离心后，可以对其使用多种染色方法对俘获在滤膜上的真菌孢子进行染色。
其中，体液样本在穿过上层微孔滤膜4时，将待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)残留在上层微孔滤膜4上，该过程中只依靠了重力驱动，无需外加其他驱动力，例如泵、负压等。
所述上层微孔滤膜4是边长为17mm的正方形滤膜；所述下层微孔滤膜11是边长为10mm的正方形滤膜；
所述上层进样口2和所述下层进样口的直径均为6mm，使得所述上层进样池1与所述上层引流管6夹持所述上层微孔滤膜4时，体液通过所述上层微孔滤膜4的工作面积为28.3mm2；同时，使得所述下层进样池8与下层引流管13夹持所述下层微孔滤膜11时，血液通过所述下层微孔滤膜11的工作面积为28.3mm2。本实施例提供的所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11具有较大的工作面积。
所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11可精确调控微孔孔径及微孔-微孔间距，上层微孔滤膜4的微孔孔径小于待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)的直径；下层微孔滤膜11的微孔孔径小于真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)的直径。同时，所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11可精确调控微孔拓扑形状。所述上层微孔滤膜4和所述下层微孔滤膜11具有和微孔特征尺寸相当的滤膜厚度。
本实施例中，上层微孔滤膜4的微孔为正六边形(如图3所示)，正六边形的对角线长度在6μm左右，上层微孔滤膜4的厚度在10μm左右。下层微孔滤膜11的微孔为正方形(如图3所示)，正方形的边长为4μm左右，下层微孔滤膜8的厚度在10μm左右。
所述上层微孔滤膜4的微孔与微孔之间的间距和所述下层微孔滤膜11的微孔与微孔之间的间距均小于非俘获目标的直径(即微孔与微孔之间的间距小于待去除的细胞的直径)，这样可以尽量避免非俘获目标落在微孔与微孔之间的间隙上，形成“非特异性粘附”。非特异性粘附是指：如果微孔与微孔之间间隙过大(主要是指上层微孔滤膜4)，则小于上层微孔滤膜4的微孔的待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)和真菌孢子有较大可能落在间隙上，从而不能通过上层微孔滤膜4，即形成了“非特异性粘附”(因为上层微孔滤膜4本来应该特异性去除待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)，而使待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)、真菌孢子通过)。
关于上述微孔滤膜的微孔间距以及微孔孔径可参考如下文献：
Yaoping Liu,Tingyu Li,Mingxin Xu,Wei Zhang,Yan Xiong,Ligong Nie,QiWang,Haichao Li and Wei Wang.A High-throughput Liquid Biopsy for Rapid RareCell Separation from Large-volume Samples,Lab chip,2019,19,68-78；
Yaoping Liu,Han Xu,Wangzhi Dai,Haichao Li and Wei Wang.2.5-Dimensional Parylene C micropore array with a large area and a high porosityfor high-throughput particle and cell separation.Microsyst.Nanoeng.,2018,4(1),13；
中国发明专利(申请号：201710679586.2)-一种微孔阵列滤膜及其制备方法和应用。
非俘获目标相对于上层微孔滤膜4而言是指：除“待去除的较大尺寸细胞”以外的目标；非俘获目标相对于下层微孔滤膜11而言是指：除“真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞”以外的目标。
为了避免体液样本在经过上层进样池1、上层引流管6、下层进样池8以及所述下层引流管13时从侧面漏出，设置了上层硅胶胶圈3、以及下层硅胶胶圈10，具体设置如下：
所述上层进样口2的下边缘设置有上层硅胶胶圈3；用于避免体液在经过所述上层微孔滤膜4时从侧面漏出；
所述下层进样口9的下边缘设置有下层硅胶胶圈10；用于避免经过上层微孔滤膜4过滤的体液在经过所述下层微孔滤膜11时从侧面漏出。
所述上层进样池1、所述上层引流管6、所述下层进样池8以及所述下层引流管13均采用树脂材料制成。
所述上层进样池1、所述上层引流管6、所述下层进样池8以及所述下层引流管13采用分体结构，可以单独拆装上层微孔滤膜4和下层微孔滤膜11。
本实施例应用上述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置可以对体液(例如全血)样本进行双层过滤。
其中，第一层过滤的过程如下：
上层进样池1和上层引流管6夹持上层微孔滤膜4，将体液样本放入上层进样池1中；在重力驱动下，体液样本在上层进样池1的上层进样口2中往下渗透；由于上层微孔滤膜4的微孔孔径小于待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)的直径，同时上层微孔滤膜4的微孔孔径大于真菌孢子和待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)的直径，因此，待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)会被“拦截”在上层微孔滤膜4上，而真菌孢子、待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)以及其余体液可以穿过上层微孔滤膜4，进入上层微孔滤膜4的下方的上层引流管6中；
第二层过滤的过程如下：
经过上层微孔滤膜4过滤的体液样本进入上层引流管6后，继续向下流入下层进样池8。将上层进样池1、上层引流管6、上层卡夹7和上层微孔滤膜4一并取出后，再将剩余的下层进样池8、下层引流管13、下层卡夹14以及下层微孔滤膜11进行外力(例如离心)操作。由于真菌孢子、待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)在物理性质上的差异(即真菌孢子有细胞壁、杨氏模量高、变形能力弱，在外力(例如离心力)的作用下难以变形；待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)无细胞壁、杨氏模量低、变形能力强，在外力(例如离心力)的作用下可变形通过下层微孔滤膜11的微孔；残余体液属于流体，可以直接通过下层微孔滤膜11的微孔)，真菌孢子会残留在下层微孔滤膜8上，将富集在下层微孔滤膜11的真菌孢子取下进行观测。应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，包括基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置以及离心管15；
所述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置放置在所述离心管15中；其中，所述上层进样池1、所述上层引流管6、所述下层进样池8以及所述下层引流管13各自的最宽处外径与所述离心管15的内径匹配；所述离心管15为50mL普通离心管。本实施例提供的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，将基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置放置在离心管15中。
其中，基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置在进行上述第一层过滤的过程中时，其余体液在经过了上层微孔滤膜4后，会继续穿过下层微孔滤膜11，从而进入下层引流管13。为了避免经过过滤的体液从下层引流管13随意流出，将基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置置于离心管15中，便于收集经过过滤的体液。
基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置在进行上述第二层过滤的过程中时，将残留有待去除的较大尺寸细胞(即待去除的大细胞，例如白细胞)的上层微孔滤膜4取出后，再将离心管15、下层进样池8、下层微孔滤膜8、下层引流管13以及下层卡夹14整体放入离心机中进行离心操作。这样做的目的是为了避免在离心过程中，被上层微孔滤膜4俘获的待去除的较大尺寸细胞(即待去除的小细胞，例如白细胞)变形穿过上层微孔滤膜4混入下层微孔滤膜11上，“污染”下层微孔滤膜11中的富集的真菌孢子，从而保证了富集的真菌孢子的纯度。
本实施例提出的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统具有快速、高效的从各种体液中分离、富集真菌孢子的优点，可为下游的真菌孢子检测鉴定提供高纯度、高浓度的样本，极大地提高了病原体检测的时间和准确性。
本实施例基于双层微孔滤膜，对各种体液(例如全血)中的真菌孢子进行分离、富集，其主要依靠真菌孢子与体液中其他细胞之间的尺寸差异以及其他物理性质差异(例如变形能力差异)，从而针对不同目标进行选择性地分离、富集。其中，上层微孔滤膜4孔径较大，用于过滤除去体液中待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)，同时让尺寸较小的真菌孢子与待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)通过上层微孔滤膜4；下层微孔滤膜11微孔孔径较小，用于俘获已经通过上层微孔滤膜4的真菌孢子与待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)。再基于离心辅助，对残留在下层微孔滤膜11的真菌孢子与待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)进行选择性分离、富集，将变形能力强的待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)从下层微孔滤膜11上过滤去除，将变形能力差的真菌孢子继续残留在下层微孔滤膜11上。
如图10所示，应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统的分离方法，所述分离方法应用于应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，所述分离方法包括以下步骤：
首先，对上层微孔滤膜4进行如下处理：
步骤S11，使用75％乙醇润湿所述上层微孔滤膜4；
步骤S12，使用磷酸盐缓冲液PBS冲洗所述上层微孔滤膜4，除去所述上层微孔滤膜4上残留的75％乙醇；
其次，将上层进样池1、上层硅胶胶圈3、上层微孔滤膜4、上层引流管6、上层卡夹7、下层进样池8、下层硅胶胶圈10、下层微孔滤膜11、下层引流管13以及下层卡夹14按照如图1所示的位置进行组装得到如图5-a中离心管15内部所示的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置。；
最后，执行以下步骤：
步骤S13，将体液样本从所述上层进样池1加入所述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置中(如图5-b所示，其中，a是真菌孢子，b是待去除的较大尺寸细胞(图中以白细胞为例)，c是待去除的较小尺寸细胞(图中以红细胞为例)；
步骤S14，在重力的驱动下，所述体液样本通过所述上层微孔滤膜4；其中，在重力的驱动下，所述体液样本中的待去除的较大尺寸细胞(图中以白细胞为例)被滞留在所述上层微孔滤膜4上，而所述体液样本中的真菌孢子、待去除的较小尺寸细胞(图中以红细胞为例)以及其余体液穿过所述上层微孔滤膜4，进入所述上层引流管6，并最终流入下层进样池8(如图5-c所示，其中，a是真菌孢子，b是白细胞，c是红细胞)；
步骤S15，取出所述上层微孔滤膜4，读出结果；即检测上层微孔滤膜4是否有较大的真菌孢子被非特异性粘附在了上层(可以通过钙荧光白染色的方法在显微镜下观察确定)。
步骤S16，将取下了所述上层进样池1、所述上层微孔滤膜4、所述上层引流管6、所述上层卡夹7的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统放入离心机中，开启所述离心机，调节所述离心机的转速和离心时间；其中，在所述离心机离心后，所述真菌孢子滞留在所述下层微孔滤膜11上，所述待去除的较小尺寸细胞(图中以红细胞为例)和所述其余体液穿过所述下层微孔滤膜11，通过所述下层引流管13进入所述离心管15的底部(如图5-d所示，其中，a是真菌孢子，c是红细胞)；
步骤S17，使用磷酸盐缓冲液PBS，冲洗所述下层微孔滤膜11；
步骤S18，取下所述下层微孔滤膜11，使用钙荧光白对滤膜进行染色，在荧光显微镜下检测是否存在真菌孢子，之后将下层微孔滤膜折叠放入Eppendorf管中，加入裂解液，进行高温加热提取DNA，再进行多聚酶链式反应进行分子水平检测，所述分子水平检测用于检测真菌孢子的种类以及含量数据。
如图6所示，是使用不同微孔孔径的滤膜实现高效、高纯度分离全血中真菌孢子的俘获率。从图中可以看出，对于白色念珠菌孢子，微孔孔径为3μm-4μm是一个较为合适的孔径。对于其他种类的真菌孢子，需要根据孢子的具体尺寸大小调整微孔孔径。
图7是104/mL浓度的白色念珠菌孢子加入磷酸盐缓冲液中回收后的典型荧光照片，其中，a是指白色念珠菌孢子；图8是阳性临床样本中回收的真菌孢子的典型荧光照片，其中，a是真菌孢子，d是下层微孔滤膜8的微孔。图9是103/mL-107/mL浓度的白色念珠菌孢子加入磷酸盐缓冲液中回收后的典型PCR扩增曲线。图9中曲线代表底物浓度随扩增循环数变化的情况。
应用本实施例提供的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置、应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统及其使用方法，能够高效地去除体液中的各种类型的细胞，从而实现体液中的真菌孢子的高效、高纯度分离和富集。
上层微孔滤膜4的微孔对角线的长度小于待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)的直径，以此保证待去除的较大尺寸细胞(例如白细胞)的高去除率去除；同时上层微孔滤膜4的微孔-微孔的间距小于真菌孢子及待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)的直径，保证了真菌孢子及红细胞在滤液流动的过滤过程中更容易被流体带走，减小了真菌孢子及待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)的非特异性粘附。下层微孔滤膜11的微孔的边长小于待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)和真菌孢子直径，以此保证待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)、真菌孢子的高俘获率回收。通过施加外力(例如离心)的方式，将变形能力较强的待去除的较小尺寸细胞(例如红细胞)以外力驱动变形并使之穿过下层微孔滤膜11的微孔，进而纯化下层微孔滤膜11上的真菌孢子。
本实施例通过分层设计，将双层滤膜集成到同一个装置中，并与常规50mL离心管兼容，成功实现了“双层过滤-离心辅助”的液体中真菌孢子的高效、高纯度分离方法；同时用硅胶胶圈对滤膜处进行密封，有效地放防止液体样本漏出，进一步提高了分离、富集效率。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。
以上对本申请所提供的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (9)

1.基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其特征在于，包括由上至下依次连接的上层进样池(1)、上层硅胶胶圈(3)、上层微孔滤膜(4)、上层引流管(6)、上层卡夹(7)、下层进样池(8)、下层硅胶胶圈(10)、下层微孔滤膜(11)、下层引流管(13)以及下层卡夹(14)；
所述上层进样池(1)以及所述下层进样池(8)均为空心圆柱体；所述上层进样池(1)的底部设置有上层进样口(2)；所述下层进样池(8)的底部设置有下层进样口(9)；
所述上层进样池(1)与所述上层引流管(6)依靠所述上层卡夹(7)紧密连接；所述下层进样池(8)与所述下层引流管(13)依靠所述下层卡夹(14)紧密连接；
所述上层引流管(6)的下端依次穿过所述上层卡夹(7)的中部、穿入所述下层进样池(8)的内部；
其中，所述上层微孔滤膜(4)的微孔孔径小于待去除的大细胞的直径，且所述上层微孔滤膜(4)的微孔孔径大于真菌孢子的直径与待去除的小细胞的直径；所述下层微孔滤膜(11)的微孔孔径小于真菌孢子的直径，使得含有待去除细胞的体液在经过所述上层微孔滤膜(4)时避免待去除的大细胞穿过所述上层微孔滤膜(4)，同时使得真菌孢子和待去除的小细胞穿过所述上层微孔滤膜(4)，再使得真菌孢子残留在所述下层微孔滤膜(11)上。
2.根据权利要求1所述的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其特征在于，所述上层微孔滤膜(4)和所述下层微孔滤膜(11)均采用聚对二甲苯Parylene C制成。
3.根据权利要求1所述的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其特征在于，所述上层微孔滤膜(4)的微孔与微孔之间的间距和所述下层微孔滤膜(11)的微孔与微孔之间的间距均小于非俘获目标的直径。
4.根据权利要求1所述的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其特征在于，所述上层微孔滤膜(4)和所述下层微孔滤膜(11)的微孔形状为正六边形或正方形。
5.根据权利要求1所述的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其特征在于，所述上层硅胶胶圈(3)设置在所述上层进样口(2)的下边缘；所述上层硅胶胶圈(3)用于避免体液在经过所述上层微孔滤膜(4)时从侧面漏出；
所述下层硅胶胶圈(10)设置在所述下层进样口(9)的上边缘；所述下层硅胶胶圈(10)用于避免经过所述上层微孔滤膜(4)过滤后的体液在经过所述下层微孔滤膜(11)时从侧面漏出。
6.根据权利要求1所述的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置，其特征在于，所述上层进样池(1)、所述上层引流管(6)、所述下层进样池(8)以及所述下层引流管(13)均采用树脂材料制成。
7.应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，其特征在于，包括权利要求1至6任一所述的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置和离心管(15)；
所述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置放置在所述离心管(15)中；其中，所述上层进样池(1)、所述上层引流管(6)、所述下层进样池(8)以及所述下层引流管(13)各自的最宽处外径与所述离心管(15)的内径匹配。
8.根据权利要求7所述的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，其特征在于，所述离心管(15)为50mL普通离心管。
9.基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统的分离方法，其特征在于，所述分离方法应用于权利要求7或8所述的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统，所述分离方法包括以下步骤：
步骤S11，使用75％乙醇润湿所述上层微孔滤膜(4)；
步骤S12，使用磷酸盐缓冲液冲洗所述上层微孔滤膜(4)，除去所述上层微孔滤膜(4)上残留的75％乙醇；
步骤S13，将体液从所述上层进样池(1)加入所述基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置中；
步骤S14，在重力的驱动下，所述体液通过所述上层微孔滤膜(4)；其中，在重力的驱动下，所述体液中的待去除的大细胞被滞留在所述上层微孔滤膜(4)上，而所述体液中的真菌孢子、待去除的小细胞以及其余体液穿过所述上层微孔滤膜(4)，进入所述上层引流管(6)后流入所述下层进样池(8)，并与所述下层微孔滤膜(11)接触；
步骤S15，取出所述上层微孔滤膜(4)，读出结果；
步骤S16，对取下了所述上层进样池(1)、所述上层微孔滤膜(4)、所述上层引流管(6)、所述上层卡夹(7)的应用基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置的系统施加外力，使得所述真菌孢子滞留在所述下层微孔滤膜(11)上，所述待去除的小细胞和其余体液穿过所述下层微孔滤膜(11)，通过所述下层引流管(13)进入所述离心管(15)的底部；
步骤S17，使用磷酸盐缓冲液，冲洗所述下层微孔滤膜(11)；
步骤S18，取下所述下层微孔滤膜(11)，使用钙荧光白对下层微孔滤膜(11)进行染色，在荧光显微镜下检测是否存在真菌孢子；之后将下层微孔滤膜(11)折叠放入Eppendorf管中，加入裂解液，进行高温加热提取DNA，再进行多聚酶链式反应进行分子水平检测，所述分子水平检测用于检测真菌孢子的种类以及含量数据。
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