JP4234486B2 - Ｄｎａ或いは電荷をもつ線状の分子のトラップ・リリース装置とその方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、健康状態の判断や、感染症の早期発見、早期治療、及び治療中の検査を行うために、血液等に含まれる、白血球、病原菌、ウイルスのＤＮＡのみを、分離、抽出、濃縮し、ＤＮＡの情報に基づく診断を行うための分離手段ならびにその装置に関する。特に必要な機能、構造の一部が一つの板状のチップに集積されており、必要な検体が微量ですみ、携帯性、即時性、使い捨て、安価などを特徴とする微小流体力学やｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐといわれる分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人体から取り出した、組織や血液等に含まれるＤＮＡを分析する技術は非常に重要である。白血球や体細胞からは本人の遺伝子情報が判り、生活習慣病や遺伝病の診断、オーダーメード医療に重要である。また、血液等に含まれる病原菌やウイルスのＤＮＡを取り出して特定することにより、感染症の診断ができる。
【０００３】
精製されたＤＮＡを特定する方法としては、ＤＮＡチップや、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法を用いて特定配列を持ったＤＮＡだけを増幅するような手法と組みあわせることにより、高感度で選択性の高い検出が原理的に可能である。このような検出方を用いるには、採取した細胞やウイルスが含まれているであろう液体から、ＤＮＡに有害な物質を除外し、細胞膜やウイルス壁を破砕してＤＮＡを取り出し、その後の反応や検出を阻害するような物質を除外し、ＰＣＲやＬＡＭＰ法に適当なＤＮＡ濃度、塩濃度、ｐＨを調整する前処理が必要である。前処理は試薬の混合、反応、ＤＮＡの回収処理の繰り返しからなる。この回収処理の形態としては、ＤＮＡの濃縮、分離、ＤＮＡのみを残した溶液の交換、溶液の交換によるＤＮＡの洗浄などがある。即ち、介在物が存在する溶液から、できるだけ選択的にＤＮＡのみを一箇所に集め、他の介在物と分けて回収することが必要であり、またＤＮＡを１まとめにしたまま、溶液内を移動する、あるいは逆に溶液の方を移動することにより、溶液の交換や洗浄が実現できれば、より簡単に前処理を実現できる。このようなＤＮＡの回収を行う方法としては、遠心分離法、磁気ビーズを用いてＤＮＡを絡め取った磁気ビーズを磁石により移動する方法等がある。
【０００４】
一方で、現在ウイルス性の病気の診断には、ウイルスに免疫が応対し、産出された抗体を検出する方法がとられている。これは、血液中のウイルスが余りに微量なため、検出が困難であるからである。しかし、この方法には、感染から免疫が応答し抗体ができるまでの期間、診断ができないという欠点がある。また、Ｂ型肝炎など、ウイルスが除去されても抗体だけ残ったり、また重症患者では、新たな感染があっても、抗体を産出できず、誤診される欠点があった。もし、血液中の微量なウイルス由来のＤＮＡを濃縮することができれば、これら抗原の直接検出でき、早期発見、早期治療に大きく貢献する。現在、石英など特定の材料の表面にＤＮＡを固定し洗い流す方法等を用いて濃縮が試みられているが、この要求レベルを満たすようなものはまだない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡの回収処理で用いられる、遠心分離は、手による上澄みや中間層、沈殿物の取り分け作業に依存しており、微量なサンプルに適用困難である。近年、ｍｉｃｒｏＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐという技術分野が立ち上がりつつあり、従来の分析技術や化学合成法を、一つのチップの上に集積化することで、システムの小型化、必要な試薬や検体量の縮小化、低コスト化、高速化、高機能化を実現している。この技術を用いると、一滴の血液、数個の細胞やウイルスからＤＮＡ分析が可能と期待される。しかしながらこれを実現するには、遠心分離に代わり、チップの中で実現できるＤＮＡの回収技術が必要である。磁気ビーズに絡め取る方法は、チップ上でも実現可能であるが、磁場の移動は煩雑であり、また集めたＤＮＡを、次の処理が行えるように再び溶液中に解放すること（即ちリリース）も、単純な緩衝液ではリリースされないなど、一般性に欠ける。診断を目的とした、ＤＮＡの前処理では、前に述べたように抗原である血中ウイルスを検出できるレベルの濃縮が可能なものはまだない。細胞や細菌レベルでは、いろいろな手法が開発されているが、煩雑で、完全チップ化に不向きであったり、感度が犠牲になったりする。また、ＤＮＡの濃縮や回収を行わず、細胞が含まれている溶液に混ぜるだけで前処理が完了するような薬品のキットが開発されているが、精製する方法に比較すると、感度や精度は悪い。
【０００６】
これらの要求に答えるべく、チップ上に形成した簡単な機構を用いて、流路を流れるたんぱく質やさまざまな試薬類を含む液体から、ＤＮＡあるいはそれに類するものを選択的に捕捉保持（即ちトラップ）し、ＤＮＡの回収、或いはＤＮＡの濃縮を行い、またトラップされたＤＮＡを簡単な操作で、リリースし、次の処理に用いることができるような、安価で単純な原理・装置はまだない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
図１は課題を解決する手段の説明である。流路１０１の中にＤＮＡ１０２を含む溶液を流す。溶液には、圧力差と電界を同時に印加する。即ち、溶液中のＤＮＡ１０２には、圧力流れによる力の方向１０３で示される方向の力と、電界による力の方向１０４で示される方向の力が、図１に示されるように互いに逆向きになるように同時に働かせる。流路１０１には、一つ以上の流路幅の広い部分１０５と、一つ以上の流路幅の狭い部分１０６が存在する。流路１０１の具体的な形状やその向きは後述するように様々であるが、電界と圧力流れの強さを調節することによりＤＮＡ１０２を、選択的に、幅が狭い部分の近辺に、トラップすることができる。また電界や圧力の強さを調節することにより、流れてきたＤＮＡを次々にトラップすることができる。この時トラップされるもの以外の溶液中の物質は、電界あるいは圧力流れにより流れ去るので、ＤＮＡの回収や濃縮が実現できる。また、ＤＮＡはトラップされたまま、溶液は流れているので、溶液の交換や洗浄にもちいることができる。狭い部分は、トラップするＤＮＡの大きさにより、０．０１ミクロンから、５０ミクロン、広い部分は、狭い部分に比べて断面積で２倍以上である。本発明のトラップ能力は、ＤＮＡのサイズにより異なる。流路径や形状を変えたり、電圧や圧力を変えることにより、トラップできるＤＮＡのサイズを変化させることが可能である。
【０００８】
トラップされたＤＮＡは、電界もしくは圧力のどちらかを強める、或いは弱めることにより、入り口側、あるいは出口側に放出される。これにより、簡単にリリース、回収でき、次の処理に用いることができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
図２に本発明に基づきＤＮＡをトラップ、リリースする最も基本的な形態を示す。トラップ機構２０１は本発明による、広い部分と狭い部分を持った流路である。入り口（リザーバ）２０２はＤＮＡの入り口でありここにＤＮＡが含まれた液体を入れる。液体は流路２０４、トラップ機構２０１を通り、出口（ウエステ）２０３へ流れる。入り口２０２と出口２０３のどちらかまたは両方から圧力源につながった管をもちいて圧力を加える。また入り口２０２と出口２０３には電極などをもちいて同時に電界を加える。圧力により入り口２０２から出口２０３へ液を搬送し、同時に入り口２０２に正、出口２０２に負の電圧を加える。これにより入り口２０２の液のうちＤＮＡだけがトラップ機構２０１にトラップされる。入り口２０２の液が大部分出口２０３に流れたあと、電界を強める、或いは圧力を弱めるまたは切る或いは逆転することにより。入り口２０２側に濃縮されたＤＮＡを取り出すことができる。あるいは圧力を強める、または電界を弱めるか切るか反転することにより、出口２０３側に濃縮されたＤＮＡを取り出すことができる。
【００１０】
図３の上の図は、本発明の形態であり、図２に加え、入り口３０１側に、濃縮されたＤＮＡ回収流路３０２と、電極を加えるリザーバを兼ねるＤＮＡ回収口３０３が設けられている。入り口３０１からＤＮＡを圧力によって、トラップ機構２０１へ流し、ＤＮＡ回収口３０３に正、出口２０３に負の電圧を印加する。十分トラップされたあと、圧力を弱めることにより、濃縮されたＤＮＡを流路２０４を経由して、ＤＮＡ回収流路３０２、ＤＮＡ回収口３０３に回収することができる。回収路が、２０３出口側にあっても同様に回収できる。
【００１１】
図３の下図は、本発明の利用形態であり、ＤＮＡ回収流路３０２の先に、検出部３０４が取り付けられている。検出部３０４はＰＣＲやＬＡＭＰチャンバーや、ＤＮＡチップが考えられる。また、各種電気泳動カラムであってもよい。電気泳動を行う場合は、電気泳動開始時に、プラグ状にサンプルを開始点につめる必要がある。通常、十字路などを用いてこれを実現するが、本発明によりリリースされたＤＮＡはプラグ状に固まってリリースされるため、この作業を省略してもよい。また、検出部３０４は、検出以外の後処理を行う要素に置き換えられる。
【００１２】
図１８は、図３下段の構成に、液体供給装置１８０１を付加したものである。圧力により入り口２０２から出口２０３へＤＮＡが含まれた液を搬送し、同時に入り口２０２に正、出口２０２に負の電圧を加える。これにより入り口２０２の液のうちＤＮＡだけがトラップ機構２０１にトラップされる。十分ＤＮＡがトラップされた後、ＤＮＡが圧力流れから受ける力と、電界から受ける力を保ったまま、入り口２０２からの液の供給を中止し、液体供給装置１８０１から、交換液リザーバ１８０２に格納されている交換液を供給することにより、ＤＮＡをトラップしたまま、ＤＮＡの周囲の液を交換できる。また、交換液を必要な時間連続して流すことにより、交換液によるＤＮＡの処理や、ＤＮＡの洗浄を行うことができる。その後、電界を強める、或いは圧力を弱めるまたは切る或いは逆転することにより、液交換し、処理あるいは洗浄されたＤＮＡを回収し、同様に次の処理に移すことが可能である。
【００１３】
図４は、本発明トラップ機構を構成する流路１０１の流路幅の狭い部分と流路幅の広い部分を実現するさまざまな形態であり、上段の図は、単純に幅の異なる流路を連結することに実現される。幅は、チップの水平方向でもよいし、深さ方向でも、その両方でもよい。中段の図は、流路の幅を変える代わりに、流路壁４０１内にビーズなど障害物４０２の詰め物をすることにより、トラップ機構を構成する。図４の下段の図は、多孔質の膜や樹脂等の多孔質物質４０３を流路壁４０１内に形成することによりこれを実現した例である。光硬化樹脂などを用いることにより簡単に実現できる。
【００１４】
図５は、本トラップ機構を複数並列に接続するための形態であり、スループットやトラップ量を向上することが可能である。上段の２つは、平面上に複数集積化する方法の形態であり、本トラップ機構は非常に微小なため、集積化により１００００倍程度の能力向上は容易に得られる。また、下段は、板状のものにあけられた孔とそれに隣接する空間によりトラップ機構を実現するものであり、さらに高い集積度が簡単に得られる。
【００１５】
図６は、トラップできるサイズの異なるトラップ機構６０１を直列に接続路６０２を介して、あるいは介さずに直接、直列に接続した形態であり、これにより異なるサイズのＤＮＡを異なるトラップ機構にトラップすることができる。これにより簡単にサイズによる分離が実現でき、分析やＤＮＡのフィルタリングに応用できる。接続路６０１に回収路６０３を接続した場合は、サイズごとに異なるＤＮＡを分けて回収したり、後処理を行うことが可能である。
【００１６】
図７は、本機構を用いたＤＮＡ分析装置の構成である。入り口７０１に注入された微量な血液、血清、大腸菌のような検体を含む液は、前処理部７０２により、酵素の非活性化処理、アルカリや酵素を用いた細胞壁やウイルス壁の破砕が行われる、次に既に述べた様々な形態の本発明を利用したＤＮＡトラップ機構７０３に注入され、破砕された細胞壁や淡白質、イオン類からＤＮＡのみを濃縮し、回収する。リリースされたＤＮＡは検出部７０４により選択的検出される。検出部７０４はＰＣＲ法やＬＡＭＰ法や電気泳動カラムなどが考えられる。これにより、血液や細胞、菌類、或いは、血清中に薄まったウイルス中のＤＮＡを濃縮して、チップ上で、高感度に検出可能である。
【００１７】
【実施例】
〔第一の実施例〕
図８は、本発明を用いてＤＮＡをトラップした実施例のひとつである。ＹＯＹＯ１で染色したＤＮＡ８０１は、蛍光顕微鏡で１分子観察が可能である。ここではＴ４−ＤＮＡ（大きさ１６０ｋＢＰ）あるいはλ−ＤＮＡ（大きさ４８ｋＢＰ）を用いた。ＤＮＡは、０．５ＴＢＥバッファーに、メルカプトエタノール、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースと一緒に含まれており、溶存酸素によって観察中にＤＮＡが切れるのを抑えてある。また電気浸透流をおさえるために、ポリビニルピロリドンが含まれている。電源８０２により電圧を印加する。圧力計８０３は、シリンジ８０４を用いて加えた圧力を計測する。白金線８０５を用いて入り口と出口に電圧を印加する。８０６はガラス板であり、８０７はシリコンゴムであり、両者は入り口と出口を密閉するために用いられる。８０８は、石英製のチップであり、図１のようなクサビ型が連続したようなトラップ機構が、図２のように配置されている。クサビの最も細い部分は０．６ミクロンであり、太い部分は５ミクロン、クサビの周期は５０ミクロン、繰り返し回数は、８回である。深さは０．５ミクロンである。８０９はレンズであり、ＤＮＡの様子を拡大観察する。８１０はダイクロイックミラー、８１１はミラー、８１３は励起光（４９０ｎｍ）であり、蛍光観察のための光学系である。ＤＮＡからの蛍光を８１４、高感度ＣＣＤカメラ８１２によって観察する。
【００１８】
図９は、まず圧力だけをかけてＤＮＡを泳動させた例であり、図は圧力差およそ４０Ｐａ以下のものであるが、速度に差は見られたが、このように小さな圧力差であっても、大きいＤＮＡ（Ｔ４）も、小さいＤＮＡ（そのフラグメント）もトラップされなかった。圧力差が大きくなるにつれ、ＤＮＡは益々容易にこの流路を通過した。これはクサビの方向を逆にしても同様であった。これは、後述されるＤＮＡのトラップの後のリリースに利用できる。
【００１９】
図１０は、電場のみをかけてＤＮＡを泳動した例である。この図はもっとも電圧が低い（０．１Ｖ以下）の例であるが、ＤＮＡは簡単にこの流路を通過した。より大きい、電圧差では、更に容易にこの流路を通過した。これはクサビの方向を逆にしても同様であった。これは、後述するトラップされたＤＮＡのリリースに利用できる。
【００２０】
図１１は、クサビの方向に対して、電界がＤＮＡに及ぼす力が、電界による力の方向１１０１になるように電圧を６Ｖ印加し、圧力流れによる力の方向１１０２に圧力を５ｋＰａ印加した場合の例である。このとき、Ｔ４ ＤＮＡは、図中ＤＮＡ１０２で表示された位置にトラップされ、長時間１０分ほどたっても動かなかった。また、トラップされたＤＮＡは電界を切ると圧力流れによる力の方向１１０２の方向に直ちに、リリースされた。
【００２１】
図１２は、図１１におけるＴ４−ＤＮＡのトラップが起こる電圧と圧力の条件範囲である。１２０１はトラップの起こる範囲（斜線部）であり、この範囲の中の条件で、Ｔ４ＤＮＡが確実にトラップされた。およそ３ｋＰａ以上の領域で、圧力流とつりあう電圧の付近でトラップが見られる。トラップが起こる電圧の範囲は、圧力が増加するにつれ、広くなった。また、Ｔ４−ＤＮＡよりも小さいＤＮＡは、この条件のすこし内側で、リリースされ、トラップにはサイズ依存性があることが示された。
【００２２】
図１３は、図１１において、圧力と電圧の向きを両方とも反転した場合のトラップがおきる範囲である。図１２と同様に、圧力が増加するにつれ、電圧のトラップ範囲はひろくなった。
【００２３】
図１２及び図１３中の実線は、ＤＮＡに及ぼす、圧力流れからの力と、電界からの力が、つりあう条件である。このことから、本トラップは、ＤＮＡに及ぼす力において、圧力による力と電界による力が、つりあう条件の３０％から１７０％の範囲で起こり、形状とＤＮＡ分子によって決まるある閾値よりも強い力を印加する必要があることが判る。
【００２４】
図１４は、図１２において、トラップ領域の下側における、大、小ＤＮＡの移動を示したものである。この図から、このような形状において、圧力と電場を両方逆向きに印加した場合は、泳動速度に著しいサイズ依存性がみられた。トラップ領域の上側においても同様な著しいサイズ依存性がみられた。これは、ゲルやキャピラリーを用いた電気泳動法に代わる、ＤＮＡサイズ分離法である。
【００２５】
図１５、図１６は圧力場、電場のみの場合において、図１４と同様なプロットを行ったものであるが、圧力場、電場のみの場合はサイズによる泳動速度の差はほとんどないことが判る。
【００２６】
クサビ型の、最も狭い部分と、広い部分の大きさを変えて、トラップを行った。広い部分は、トラップされているＤＮＡの大きさからは十分無限大とおもわれる１００ミクロンを越えても問題なくトラップできることが判った。狭い部分を変化させると、同じ圧力、電場においても、トラップできるＤＮＡのサイズが変化し、０．６ミクロンでは、１０００ｂｐ以上のＤＮＡがトラップされ、０．３ミクロンでは５００ｂｐ以上のＤＮＡがトラップされた。また、５０ミクロンのものでは、ＤＮＡのトラップは見られなかった。この結果より、小さいＤＮＡをトラップするには、最も狭い部分のサイズが小さい方が有利で、また狭い部分の大きさや電圧や圧力の大きさを最適化することにより、特定の大きさ以上のＤＮＡをトラップできることがわかる。また、ＤＮＡをトラップするのに有効な狭い部分の幅は、ＤＮＡの大きさから考えて、０．０１ミクロンから５０ミクロンの間と考えられる。
【００２７】
〔第二の実施例〕
次に第２の実施例を示す。第一の実施例と同様に図８に示した蛍光観察装置を用いる。ここで、泳動チップ８０８は図１８に示すように、入り口３０１と出口２０３の他に、ＤＮＡ回収流路３０２、ＤＮＡ回収口３０３と、液体供給装置１８０１、交換液リザーバー１８０２を付加したものを用いる。トラップ機構２０１は、第１の実施例と同様にクサビの最も細い部分は０．６ミクロンであり、太い部分は５ミクロン、クサビの周期は５０ミクロン、繰り返し回数は、８回である。深さは０．５ミクロンである。０．５ＴＢＥバッファーに、メルカプトエタノール、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースを付与し溶存酸素によって観察中にＤＮＡが切れるのを抑え、また電気浸透流をおさえるために、ポリビニルピロリドンを付与した、緩衝液を用意する。これを緩衝液Ａとする。まず流路全体を緩衝液Ａで満たす。実施例一と同様に調製したＤＮＡ溶液に、表面にＣＯＯＨ基を付与したポリスチレンビーズを混入した溶液を、入り口３０１に入れる。交換液リザーバ１８０２には、緩衝液Ａを入れる。入り口３０１には、圧力を印加するシリンジと白金電極を実施例一と同様に接続する。出口２０３には、白金電極を接続する。交換液リザーバ１８０２と、ＤＮＡ回収口３０３には、それぞれ、圧力を印加するシリンジを接続する。この４つの接続は実施例一と同様にシリコーンゴムでそれぞれ密閉されている。
【００２８】
まず、入り口３０１に８ｋＰａの圧縮の圧力を加えると同時に、出口２０３と入り口３０１の間に１０Ｖの電圧を、出口２０３側が負になるように加える。この時、液体供給装置１８０１、ＤＮＡ回収流路にはＤＮＡが流れないように、交換液リザーバ１８０２、ＤＮＡ回収口３０３に印加する圧力を調整する。入り口３０１にいれた、ＤＮＡと溶液とポリスチレンビーズは、次々とトラップ機構２０１に流れ込み、ＤＮＡはトラップされ、濃縮されるが、ビーズは出口２０３へ流れ去った。十分ＤＮＡがトラップされた後、交換液リザーバへ印加する圧力を増加し、入り口３０１に印加する圧力を弱めると、入り口３０１からのＤＮＡとポリスチレンビーズの供給が止まり、トラップされたＤＮＡは交換液リザーバーからの液体にさらされた。これにより、トラップ機構に存在するポリスチレンビーズは完全に出口２０３へ流れ去り、ＤＮＡは洗浄された。次に、印加している電界と圧力を同時に０にし、ＤＮＡ回収口３０３に引っ張りの圧力を加える。この時、入り口３０１と交換液リザーバ１８０２から液体が流出しないような引っ張りの圧力を加える。トラップされたＤＮＡはＤＮＡ回収流路３０２を通って、ＤＮＡ回収口に回収された。以上により、ＤＮＡとポリスチレンビーズの混合物から、ＤＮＡのみを濃縮して抽出し、洗浄し、回収することができた。
【００２９】
図１７はトラップ力の説明である。１７０１は電場による力であり、ＤＮＡが電場から受ける力は壁面からの距離によらず一定である。これに対して、１７０２は圧力流による力であり、ＤＮＡが圧力流からうける力は、壁面付近が小さく、中央が大きい。従って、最も狭い部分近辺では、壁面付近では電場による力が強くなり、中央部１７０３では非常に強い圧力による力ができる。ここを流れる粒子状のものは、壁面からすり抜けることが可能であるが、ＤＮＡのような長い分子は、すり抜ける過程で、逃げ出そうとするＤＮＡ１７０４のように長い分子のどこかが中央の流れに引きずられトラップ部に戻される。これによって、長い分子のみトラップされる。
【００３０】
トラップ中のＤＮＡを詳細に観察すると、図１７で示すように運動しながらトラップされるＤＮＡが観察されこのトラップ力の説明が裏付けられる。
【００３１】
【発明の効果】
以上に述べたとおり、本発明によるＤＮＡトラップ機構により、液体よりＤＮＡ、或いはＤＮＡを含む長い分子のみをトラップし、必要に応じてリリースすることが可能である。これにより、チップ上で、ＤＮＡを取り出すための前処理の溶液からＤＮＡのみを回収する機構、ＤＮＡを残してバッファーや溶液を交換する作業、あるいは、非常に薄まったＤＮＡを濃縮しＰＣＲやＬＡＭＰ法、ＤＮＡチップなどの検出感度を上げたり、チップ上で扱いやすい液量に調整したりすることが容易になる。これにより、血液中の白血球や、ウイルス、病原体のＤＮＡの分析や診断が容易になり、また、抗体検出ではなく抗原を検出することにより病気の診断がより早く、正確になる効果がある。また、トラップ機構や泳動速度のサイズ依存性を利用した、新しい、ＤＮＡ分離法や、ＤＮＡフィルタリング法、スクリーニング法も容易に構成できる。また、ＤＮＡを利用した蛋白質の合成や、ＤＮＡを用いた分析法、ＤＮＡを用いたデバイスの開発において、溶液中のＤＮＡのみを一時的に固定できることは、溶液の交換や、ＤＮＡのマニュピレーション、ＤＮＡの観察を容易にし、あらゆる波及効果が期待できる。本発明は、ＤＮＡに特化して説明を行ったが、同様の特性をもつ、ＲＮＡや長鎖線状分子に応用できることは容易に推測できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるトラッピング機構の図
【図２】本発明を利用する形態の基本
【図３】本発明の利用形態の応用例
【図４】本発明のトラッピング機構の構成例
【図５】本発明のトラッピング機構を複数配置して効果をあげる方法
【図６】効果の異なる本発明を直列に接続して分離を行う方法
【図７】本発明を利用して血液等を分析する構成
【図８】本発明を実施するための装置構成例
【図９】実施例における圧力場のみでのＤＮＡの泳動速度
【図１０】実施例における電場のみでのＤＮＡの泳動速度
【図１１】実施例における圧力場と電場を両方かけた場合のＤＮＡのトラッピング
【図１２】実施例におけるトラッピングが起こる電圧と圧力の範囲
【図１３】実施例における逆接続でのトラッピングが起こる電圧と圧力の範囲
【図１４】実施例における圧力場と電場を両方かけた場合のＤＮＡの移動距離と時間の関係
【図１５】実施例における圧力場のみの場合のＤＮＡの移動距離と時間の関係
【図１６】実施例における電場のみの場合のＤＮＡの移動距離と時間の関係
【図１７】現在のトラッピング現象の説明図
【図１８】本発明に液体供給装置を付加した応用例
【符号の説明】
１０１ 流路
１０２ ＤＮＡ
１０３ 圧力流れによる力の方向
１０４ 電界による力の方向
１０５ 流路幅の広い部分
１０６ 流路幅の狭い部分
２０１ 本発明によるトラッピング機構本体
２０２ 入り口（リザーバ）
２０３ 出口（ウエステ）
２０４ 流路
３０１ 入り口（リザーバ）
３０２ ＤＮＡ回収流路
３０３ ＤＮＡ回収口
３０４ ＤＮＡ検出機構
４０１ 流路壁
４０２ ビーズなど障害物
４０３ 多孔質物質
５０１ 入り口
５０２ 出口
６０１ 効果の異なるＤＮＡトラップ機構本体
６０２ 接続路（必要なときのみ）
６０３ 分離したＤＮＡ回収路（必要に応じて）
７０１ 血液などサンプル入り口
７０２ 細胞壁やウイルス壁を壊す前処理部
７０３ 本発明によるトラップ機構による濃縮器
７０４ 特定のＤＮＡの検出部（ＰＣＲチャンバーなど）
８０１ ＹＯＹＯ１で染色したＤＮＡ溶液
８０２ 電源
８０３ 圧力計
８０４ シリンジ
８０５ 白金線
８０６ ガラス板
８０７ シリコンラバー
８０８ 泳動チップ
８０９ 対物レンズ
８１０ ダイクロイックミラー
８１１ ミラー
８１２ ＣＣＤカメラ
８１３ 励起光
８１４ 蛍光
１１０１ 電界による力の方向
１１０２ 圧力流による力の方向
１２０１ トラップの起こる範囲（斜線部）
１７０１ 電場による力
１７０２ 圧力流による力
１７０３ 中央部
１７０４ 逃げ出そうとするＤＮＡ
１８０１ 液体供給装置
１８０２ 液体供給リザーバ
【発明の属する技術分野】
本発明は、健康状態の判断や、感染症の早期発見、早期治療、及び治療中の検査を行うために、血液等に含まれる、白血球、病原菌、ウイルスのＤＮＡのみを、分離、抽出、濃縮し、ＤＮＡの情報に基づく診断を行うための分離手段ならびにその装置に関する。特に必要な機能、構造の一部が一つの板状のチップに集積されており、必要な検体が微量ですみ、携帯性、即時性、使い捨て、安価などを特徴とする微小流体力学やｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐといわれる分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人体から取り出した、組織や血液等に含まれるＤＮＡを分析する技術は非常に重要である。白血球や体細胞からは本人の遺伝子情報が判り、生活習慣病や遺伝病の診断、オーダーメード医療に重要である。また、血液等に含まれる病原菌やウイルスのＤＮＡを取り出して特定することにより、感染症の診断ができる。
【０００３】
精製されたＤＮＡを特定する方法としては、ＤＮＡチップや、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法を用いて特定配列を持ったＤＮＡだけを増幅するような手法と組みあわせることにより、高感度で選択性の高い検出が原理的に可能である。このような検出方を用いるには、採取した細胞やウイルスが含まれているであろう液体から、ＤＮＡに有害な物質を除外し、細胞膜やウイルス壁を破砕してＤＮＡを取り出し、その後の反応や検出を阻害するような物質を除外し、ＰＣＲやＬＡＭＰ法に適当なＤＮＡ濃度、塩濃度、ｐＨを調整する前処理が必要である。前処理は試薬の混合、反応、ＤＮＡの回収処理の繰り返しからなる。この回収処理の形態としては、ＤＮＡの濃縮、分離、ＤＮＡのみを残した溶液の交換、溶液の交換によるＤＮＡの洗浄などがある。即ち、介在物が存在する溶液から、できるだけ選択的にＤＮＡのみを一箇所に集め、他の介在物と分けて回収することが必要であり、またＤＮＡを１まとめにしたまま、溶液内を移動する、あるいは逆に溶液の方を移動することにより、溶液の交換や洗浄が実現できれば、より簡単に前処理を実現できる。このようなＤＮＡの回収を行う方法としては、遠心分離法、磁気ビーズを用いてＤＮＡを絡め取った磁気ビーズを磁石により移動する方法等がある。
【０００４】
一方で、現在ウイルス性の病気の診断には、ウイルスに免疫が応対し、産出された抗体を検出する方法がとられている。これは、血液中のウイルスが余りに微量なため、検出が困難であるからである。しかし、この方法には、感染から免疫が応答し抗体ができるまでの期間、診断ができないという欠点がある。また、Ｂ型肝炎など、ウイルスが除去されても抗体だけ残ったり、また重症患者では、新たな感染があっても、抗体を産出できず、誤診される欠点があった。もし、血液中の微量なウイルス由来のＤＮＡを濃縮することができれば、これら抗原の直接検出でき、早期発見、早期治療に大きく貢献する。現在、石英など特定の材料の表面にＤＮＡを固定し洗い流す方法等を用いて濃縮が試みられているが、この要求レベルを満たすようなものはまだない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡの回収処理で用いられる、遠心分離は、手による上澄みや中間層、沈殿物の取り分け作業に依存しており、微量なサンプルに適用困難である。近年、ｍｉｃｒｏＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐという技術分野が立ち上がりつつあり、従来の分析技術や化学合成法を、一つのチップの上に集積化することで、システムの小型化、必要な試薬や検体量の縮小化、低コスト化、高速化、高機能化を実現している。この技術を用いると、一滴の血液、数個の細胞やウイルスからＤＮＡ分析が可能と期待される。しかしながらこれを実現するには、遠心分離に代わり、チップの中で実現できるＤＮＡの回収技術が必要である。磁気ビーズに絡め取る方法は、チップ上でも実現可能であるが、磁場の移動は煩雑であり、また集めたＤＮＡを、次の処理が行えるように再び溶液中に解放すること（即ちリリース）も、単純な緩衝液ではリリースされないなど、一般性に欠ける。診断を目的とした、ＤＮＡの前処理では、前に述べたように抗原である血中ウイルスを検出できるレベルの濃縮が可能なものはまだない。細胞や細菌レベルでは、いろいろな手法が開発されているが、煩雑で、完全チップ化に不向きであったり、感度が犠牲になったりする。また、ＤＮＡの濃縮や回収を行わず、細胞が含まれている溶液に混ぜるだけで前処理が完了するような薬品のキットが開発されているが、精製する方法に比較すると、感度や精度は悪い。
【０００６】
これらの要求に答えるべく、チップ上に形成した簡単な機構を用いて、流路を流れるたんぱく質やさまざまな試薬類を含む液体から、ＤＮＡあるいはそれに類するものを選択的に捕捉保持（即ちトラップ）し、ＤＮＡの回収、或いはＤＮＡの濃縮を行い、またトラップされたＤＮＡを簡単な操作で、リリースし、次の処理に用いることができるような、安価で単純な原理・装置はまだない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
図１は課題を解決する手段の説明である。流路１０１の中にＤＮＡ１０２を含む溶液を流す。溶液には、圧力差と電界を同時に印加する。即ち、溶液中のＤＮＡ１０２には、圧力流れによる力の方向１０３で示される方向の力と、電界による力の方向１０４で示される方向の力が、図１に示されるように互いに逆向きになるように同時に働かせる。流路１０１には、一つ以上の流路幅の広い部分１０５と、一つ以上の流路幅の狭い部分１０６が存在する。流路１０１の具体的な形状やその向きは後述するように様々であるが、電界と圧力流れの強さを調節することによりＤＮＡ１０２を、選択的に、幅が狭い部分の近辺に、トラップすることができる。また電界や圧力の強さを調節することにより、流れてきたＤＮＡを次々にトラップすることができる。この時トラップされるもの以外の溶液中の物質は、電界あるいは圧力流れにより流れ去るので、ＤＮＡの回収や濃縮が実現できる。また、ＤＮＡはトラップされたまま、溶液は流れているので、溶液の交換や洗浄にもちいることができる。狭い部分は、トラップするＤＮＡの大きさにより、０．０１ミクロンから、５０ミクロン、広い部分は、狭い部分に比べて断面積で２倍以上である。本発明のトラップ能力は、ＤＮＡのサイズにより異なる。流路径や形状を変えたり、電圧や圧力を変えることにより、トラップできるＤＮＡのサイズを変化させることが可能である。
【０００８】
トラップされたＤＮＡは、電界もしくは圧力のどちらかを強める、或いは弱めることにより、入り口側、あるいは出口側に放出される。これにより、簡単にリリース、回収でき、次の処理に用いることができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
図２に本発明に基づきＤＮＡをトラップ、リリースする最も基本的な形態を示す。トラップ機構２０１は本発明による、広い部分と狭い部分を持った流路である。入り口（リザーバ）２０２はＤＮＡの入り口でありここにＤＮＡが含まれた液体を入れる。液体は流路２０４、トラップ機構２０１を通り、出口（ウエステ）２０３へ流れる。入り口２０２と出口２０３のどちらかまたは両方から圧力源につながった管をもちいて圧力を加える。また入り口２０２と出口２０３には電極などをもちいて同時に電界を加える。圧力により入り口２０２から出口２０３へ液を搬送し、同時に入り口２０２に正、出口２０２に負の電圧を加える。これにより入り口２０２の液のうちＤＮＡだけがトラップ機構２０１にトラップされる。入り口２０２の液が大部分出口２０３に流れたあと、電界を強める、或いは圧力を弱めるまたは切る或いは逆転することにより。入り口２０２側に濃縮されたＤＮＡを取り出すことができる。あるいは圧力を強める、または電界を弱めるか切るか反転することにより、出口２０３側に濃縮されたＤＮＡを取り出すことができる。
【００１０】
図３の上の図は、本発明の形態であり、図２に加え、入り口３０１側に、濃縮されたＤＮＡ回収流路３０２と、電極を加えるリザーバを兼ねるＤＮＡ回収口３０３が設けられている。入り口３０１からＤＮＡを圧力によって、トラップ機構２０１へ流し、ＤＮＡ回収口３０３に正、出口２０３に負の電圧を印加する。十分トラップされたあと、圧力を弱めることにより、濃縮されたＤＮＡを流路２０４を経由して、ＤＮＡ回収流路３０２、ＤＮＡ回収口３０３に回収することができる。回収路が、２０３出口側にあっても同様に回収できる。
【００１１】
図３の下図は、本発明の利用形態であり、ＤＮＡ回収流路３０２の先に、検出部３０４が取り付けられている。検出部３０４はＰＣＲやＬＡＭＰチャンバーや、ＤＮＡチップが考えられる。また、各種電気泳動カラムであってもよい。電気泳動を行う場合は、電気泳動開始時に、プラグ状にサンプルを開始点につめる必要がある。通常、十字路などを用いてこれを実現するが、本発明によりリリースされたＤＮＡはプラグ状に固まってリリースされるため、この作業を省略してもよい。また、検出部３０４は、検出以外の後処理を行う要素に置き換えられる。
【００１２】
図１８は、図３下段の構成に、液体供給装置１８０１を付加したものである。圧力により入り口２０２から出口２０３へＤＮＡが含まれた液を搬送し、同時に入り口２０２に正、出口２０２に負の電圧を加える。これにより入り口２０２の液のうちＤＮＡだけがトラップ機構２０１にトラップされる。十分ＤＮＡがトラップされた後、ＤＮＡが圧力流れから受ける力と、電界から受ける力を保ったまま、入り口２０２からの液の供給を中止し、液体供給装置１８０１から、交換液リザーバ１８０２に格納されている交換液を供給することにより、ＤＮＡをトラップしたまま、ＤＮＡの周囲の液を交換できる。また、交換液を必要な時間連続して流すことにより、交換液によるＤＮＡの処理や、ＤＮＡの洗浄を行うことができる。その後、電界を強める、或いは圧力を弱めるまたは切る或いは逆転することにより、液交換し、処理あるいは洗浄されたＤＮＡを回収し、同様に次の処理に移すことが可能である。
【００１３】
図４は、本発明トラップ機構を構成する流路１０１の流路幅の狭い部分と流路幅の広い部分を実現するさまざまな形態であり、上段の図は、単純に幅の異なる流路を連結することに実現される。幅は、チップの水平方向でもよいし、深さ方向でも、その両方でもよい。中段の図は、流路の幅を変える代わりに、流路壁４０１内にビーズなど障害物４０２の詰め物をすることにより、トラップ機構を構成する。図４の下段の図は、多孔質の膜や樹脂等の多孔質物質４０３を流路壁４０１内に形成することによりこれを実現した例である。光硬化樹脂などを用いることにより簡単に実現できる。
【００１４】
図５は、本トラップ機構を複数並列に接続するための形態であり、スループットやトラップ量を向上することが可能である。上段の２つは、平面上に複数集積化する方法の形態であり、本トラップ機構は非常に微小なため、集積化により１００００倍程度の能力向上は容易に得られる。また、下段は、板状のものにあけられた孔とそれに隣接する空間によりトラップ機構を実現するものであり、さらに高い集積度が簡単に得られる。
【００１５】
図６は、トラップできるサイズの異なるトラップ機構６０１を直列に接続路６０２を介して、あるいは介さずに直接、直列に接続した形態であり、これにより異なるサイズのＤＮＡを異なるトラップ機構にトラップすることができる。これにより簡単にサイズによる分離が実現でき、分析やＤＮＡのフィルタリングに応用できる。接続路６０１に回収路６０３を接続した場合は、サイズごとに異なるＤＮＡを分けて回収したり、後処理を行うことが可能である。
【００１６】
図７は、本機構を用いたＤＮＡ分析装置の構成である。入り口７０１に注入された微量な血液、血清、大腸菌のような検体を含む液は、前処理部７０２により、酵素の非活性化処理、アルカリや酵素を用いた細胞壁やウイルス壁の破砕が行われる、次に既に述べた様々な形態の本発明を利用したＤＮＡトラップ機構７０３に注入され、破砕された細胞壁や淡白質、イオン類からＤＮＡのみを濃縮し、回収する。リリースされたＤＮＡは検出部７０４により選択的検出される。検出部７０４はＰＣＲ法やＬＡＭＰ法や電気泳動カラムなどが考えられる。これにより、血液や細胞、菌類、或いは、血清中に薄まったウイルス中のＤＮＡを濃縮して、チップ上で、高感度に検出可能である。
【００１７】
【実施例】
〔第一の実施例〕
図８は、本発明を用いてＤＮＡをトラップした実施例のひとつである。ＹＯＹＯ１で染色したＤＮＡ８０１は、蛍光顕微鏡で１分子観察が可能である。ここではＴ４−ＤＮＡ（大きさ１６０ｋＢＰ）あるいはλ−ＤＮＡ（大きさ４８ｋＢＰ）を用いた。ＤＮＡは、０．５ＴＢＥバッファーに、メルカプトエタノール、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースと一緒に含まれており、溶存酸素によって観察中にＤＮＡが切れるのを抑えてある。また電気浸透流をおさえるために、ポリビニルピロリドンが含まれている。電源８０２により電圧を印加する。圧力計８０３は、シリンジ８０４を用いて加えた圧力を計測する。白金線８０５を用いて入り口と出口に電圧を印加する。８０６はガラス板であり、８０７はシリコンゴムであり、両者は入り口と出口を密閉するために用いられる。８０８は、石英製のチップであり、図１のようなクサビ型が連続したようなトラップ機構が、図２のように配置されている。クサビの最も細い部分は０．６ミクロンであり、太い部分は５ミクロン、クサビの周期は５０ミクロン、繰り返し回数は、８回である。深さは０．５ミクロンである。８０９はレンズであり、ＤＮＡの様子を拡大観察する。８１０はダイクロイックミラー、８１１はミラー、８１３は励起光（４９０ｎｍ）であり、蛍光観察のための光学系である。ＤＮＡからの蛍光を８１４、高感度ＣＣＤカメラ８１２によって観察する。
【００１８】
図９は、まず圧力だけをかけてＤＮＡを泳動させた例であり、図は圧力差およそ４０Ｐａ以下のものであるが、速度に差は見られたが、このように小さな圧力差であっても、大きいＤＮＡ（Ｔ４）も、小さいＤＮＡ（そのフラグメント）もトラップされなかった。圧力差が大きくなるにつれ、ＤＮＡは益々容易にこの流路を通過した。これはクサビの方向を逆にしても同様であった。これは、後述されるＤＮＡのトラップの後のリリースに利用できる。
【００１９】
図１０は、電場のみをかけてＤＮＡを泳動した例である。この図はもっとも電圧が低い（０．１Ｖ以下）の例であるが、ＤＮＡは簡単にこの流路を通過した。より大きい、電圧差では、更に容易にこの流路を通過した。これはクサビの方向を逆にしても同様であった。これは、後述するトラップされたＤＮＡのリリースに利用できる。
【００２０】
図１１は、クサビの方向に対して、電界がＤＮＡに及ぼす力が、電界による力の方向１１０１になるように電圧を６Ｖ印加し、圧力流れによる力の方向１１０２に圧力を５ｋＰａ印加した場合の例である。このとき、Ｔ４ ＤＮＡは、図中ＤＮＡ１０２で表示された位置にトラップされ、長時間１０分ほどたっても動かなかった。また、トラップされたＤＮＡは電界を切ると圧力流れによる力の方向１１０２の方向に直ちに、リリースされた。
【００２１】
図１２は、図１１におけるＴ４−ＤＮＡのトラップが起こる電圧と圧力の条件範囲である。１２０１はトラップの起こる範囲（斜線部）であり、この範囲の中の条件で、Ｔ４ＤＮＡが確実にトラップされた。およそ３ｋＰａ以上の領域で、圧力流とつりあう電圧の付近でトラップが見られる。トラップが起こる電圧の範囲は、圧力が増加するにつれ、広くなった。また、Ｔ４−ＤＮＡよりも小さいＤＮＡは、この条件のすこし内側で、リリースされ、トラップにはサイズ依存性があることが示された。
【００２２】
図１３は、図１１において、圧力と電圧の向きを両方とも反転した場合のトラップがおきる範囲である。図１２と同様に、圧力が増加するにつれ、電圧のトラップ範囲はひろくなった。
【００２３】
図１２及び図１３中の実線は、ＤＮＡに及ぼす、圧力流れからの力と、電界からの力が、つりあう条件である。このことから、本トラップは、ＤＮＡに及ぼす力において、圧力による力と電界による力が、つりあう条件の３０％から１７０％の範囲で起こり、形状とＤＮＡ分子によって決まるある閾値よりも強い力を印加する必要があることが判る。
【００２４】
図１４は、図１２において、トラップ領域の下側における、大、小ＤＮＡの移動を示したものである。この図から、このような形状において、圧力と電場を両方逆向きに印加した場合は、泳動速度に著しいサイズ依存性がみられた。トラップ領域の上側においても同様な著しいサイズ依存性がみられた。これは、ゲルやキャピラリーを用いた電気泳動法に代わる、ＤＮＡサイズ分離法である。
【００２５】
図１５、図１６は圧力場、電場のみの場合において、図１４と同様なプロットを行ったものであるが、圧力場、電場のみの場合はサイズによる泳動速度の差はほとんどないことが判る。
【００２６】
クサビ型の、最も狭い部分と、広い部分の大きさを変えて、トラップを行った。広い部分は、トラップされているＤＮＡの大きさからは十分無限大とおもわれる１００ミクロンを越えても問題なくトラップできることが判った。狭い部分を変化させると、同じ圧力、電場においても、トラップできるＤＮＡのサイズが変化し、０．６ミクロンでは、１０００ｂｐ以上のＤＮＡがトラップされ、０．３ミクロンでは５００ｂｐ以上のＤＮＡがトラップされた。また、５０ミクロンのものでは、ＤＮＡのトラップは見られなかった。この結果より、小さいＤＮＡをトラップするには、最も狭い部分のサイズが小さい方が有利で、また狭い部分の大きさや電圧や圧力の大きさを最適化することにより、特定の大きさ以上のＤＮＡをトラップできることがわかる。また、ＤＮＡをトラップするのに有効な狭い部分の幅は、ＤＮＡの大きさから考えて、０．０１ミクロンから５０ミクロンの間と考えられる。
【００２７】
〔第二の実施例〕
次に第２の実施例を示す。第一の実施例と同様に図８に示した蛍光観察装置を用いる。ここで、泳動チップ８０８は図１８に示すように、入り口３０１と出口２０３の他に、ＤＮＡ回収流路３０２、ＤＮＡ回収口３０３と、液体供給装置１８０１、交換液リザーバー１８０２を付加したものを用いる。トラップ機構２０１は、第１の実施例と同様にクサビの最も細い部分は０．６ミクロンであり、太い部分は５ミクロン、クサビの周期は５０ミクロン、繰り返し回数は、８回である。深さは０．５ミクロンである。０．５ＴＢＥバッファーに、メルカプトエタノール、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースを付与し溶存酸素によって観察中にＤＮＡが切れるのを抑え、また電気浸透流をおさえるために、ポリビニルピロリドンを付与した、緩衝液を用意する。これを緩衝液Ａとする。まず流路全体を緩衝液Ａで満たす。実施例一と同様に調製したＤＮＡ溶液に、表面にＣＯＯＨ基を付与したポリスチレンビーズを混入した溶液を、入り口３０１に入れる。交換液リザーバ１８０２には、緩衝液Ａを入れる。入り口３０１には、圧力を印加するシリンジと白金電極を実施例一と同様に接続する。出口２０３には、白金電極を接続する。交換液リザーバ１８０２と、ＤＮＡ回収口３０３には、それぞれ、圧力を印加するシリンジを接続する。この４つの接続は実施例一と同様にシリコーンゴムでそれぞれ密閉されている。
【００２８】
まず、入り口３０１に８ｋＰａの圧縮の圧力を加えると同時に、出口２０３と入り口３０１の間に１０Ｖの電圧を、出口２０３側が負になるように加える。この時、液体供給装置１８０１、ＤＮＡ回収流路にはＤＮＡが流れないように、交換液リザーバ１８０２、ＤＮＡ回収口３０３に印加する圧力を調整する。入り口３０１にいれた、ＤＮＡと溶液とポリスチレンビーズは、次々とトラップ機構２０１に流れ込み、ＤＮＡはトラップされ、濃縮されるが、ビーズは出口２０３へ流れ去った。十分ＤＮＡがトラップされた後、交換液リザーバへ印加する圧力を増加し、入り口３０１に印加する圧力を弱めると、入り口３０１からのＤＮＡとポリスチレンビーズの供給が止まり、トラップされたＤＮＡは交換液リザーバーからの液体にさらされた。これにより、トラップ機構に存在するポリスチレンビーズは完全に出口２０３へ流れ去り、ＤＮＡは洗浄された。次に、印加している電界と圧力を同時に０にし、ＤＮＡ回収口３０３に引っ張りの圧力を加える。この時、入り口３０１と交換液リザーバ１８０２から液体が流出しないような引っ張りの圧力を加える。トラップされたＤＮＡはＤＮＡ回収流路３０２を通って、ＤＮＡ回収口に回収された。以上により、ＤＮＡとポリスチレンビーズの混合物から、ＤＮＡのみを濃縮して抽出し、洗浄し、回収することができた。
【００２９】
図１７はトラップ力の説明である。１７０１は電場による力であり、ＤＮＡが電場から受ける力は壁面からの距離によらず一定である。これに対して、１７０２は圧力流による力であり、ＤＮＡが圧力流からうける力は、壁面付近が小さく、中央が大きい。従って、最も狭い部分近辺では、壁面付近では電場による力が強くなり、中央部１７０３では非常に強い圧力による力ができる。ここを流れる粒子状のものは、壁面からすり抜けることが可能であるが、ＤＮＡのような長い分子は、すり抜ける過程で、逃げ出そうとするＤＮＡ１７０４のように長い分子のどこかが中央の流れに引きずられトラップ部に戻される。これによって、長い分子のみトラップされる。
【００３０】
トラップ中のＤＮＡを詳細に観察すると、図１７で示すように運動しながらトラップされるＤＮＡが観察されこのトラップ力の説明が裏付けられる。
【００３１】
【発明の効果】
以上に述べたとおり、本発明によるＤＮＡトラップ機構により、液体よりＤＮＡ、或いはＤＮＡを含む長い分子のみをトラップし、必要に応じてリリースすることが可能である。これにより、チップ上で、ＤＮＡを取り出すための前処理の溶液からＤＮＡのみを回収する機構、ＤＮＡを残してバッファーや溶液を交換する作業、あるいは、非常に薄まったＤＮＡを濃縮しＰＣＲやＬＡＭＰ法、ＤＮＡチップなどの検出感度を上げたり、チップ上で扱いやすい液量に調整したりすることが容易になる。これにより、血液中の白血球や、ウイルス、病原体のＤＮＡの分析や診断が容易になり、また、抗体検出ではなく抗原を検出することにより病気の診断がより早く、正確になる効果がある。また、トラップ機構や泳動速度のサイズ依存性を利用した、新しい、ＤＮＡ分離法や、ＤＮＡフィルタリング法、スクリーニング法も容易に構成できる。また、ＤＮＡを利用した蛋白質の合成や、ＤＮＡを用いた分析法、ＤＮＡを用いたデバイスの開発において、溶液中のＤＮＡのみを一時的に固定できることは、溶液の交換や、ＤＮＡのマニュピレーション、ＤＮＡの観察を容易にし、あらゆる波及効果が期待できる。本発明は、ＤＮＡに特化して説明を行ったが、同様の特性をもつ、ＲＮＡや長鎖線状分子に応用できることは容易に推測できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるトラッピング機構の図
【図２】本発明を利用する形態の基本
【図３】本発明の利用形態の応用例
【図４】本発明のトラッピング機構の構成例
【図５】本発明のトラッピング機構を複数配置して効果をあげる方法
【図６】効果の異なる本発明を直列に接続して分離を行う方法
【図７】本発明を利用して血液等を分析する構成
【図８】本発明を実施するための装置構成例
【図９】実施例における圧力場のみでのＤＮＡの泳動速度
【図１０】実施例における電場のみでのＤＮＡの泳動速度
【図１１】実施例における圧力場と電場を両方かけた場合のＤＮＡのトラッピング
【図１２】実施例におけるトラッピングが起こる電圧と圧力の範囲
【図１３】実施例における逆接続でのトラッピングが起こる電圧と圧力の範囲
【図１４】実施例における圧力場と電場を両方かけた場合のＤＮＡの移動距離と時間の関係
【図１５】実施例における圧力場のみの場合のＤＮＡの移動距離と時間の関係
【図１６】実施例における電場のみの場合のＤＮＡの移動距離と時間の関係
【図１７】現在のトラッピング現象の説明図
【図１８】本発明に液体供給装置を付加した応用例
【符号の説明】
１０１ 流路
１０２ ＤＮＡ
１０３ 圧力流れによる力の方向
１０４ 電界による力の方向
１０５ 流路幅の広い部分
１０６ 流路幅の狭い部分
２０１ 本発明によるトラッピング機構本体
２０２ 入り口（リザーバ）
２０３ 出口（ウエステ）
２０４ 流路
３０１ 入り口（リザーバ）
３０２ ＤＮＡ回収流路
３０３ ＤＮＡ回収口
３０４ ＤＮＡ検出機構
４０１ 流路壁
４０２ ビーズなど障害物
４０３ 多孔質物質
５０１ 入り口
５０２ 出口
６０１ 効果の異なるＤＮＡトラップ機構本体
６０２ 接続路（必要なときのみ）
６０３ 分離したＤＮＡ回収路（必要に応じて）
７０１ 血液などサンプル入り口
７０２ 細胞壁やウイルス壁を壊す前処理部
７０３ 本発明によるトラップ機構による濃縮器
７０４ 特定のＤＮＡの検出部（ＰＣＲチャンバーなど）
８０１ ＹＯＹＯ１で染色したＤＮＡ溶液
８０２ 電源
８０３ 圧力計
８０４ シリンジ
８０５ 白金線
８０６ ガラス板
８０７ シリコンラバー
８０８ 泳動チップ
８０９ 対物レンズ
８１０ ダイクロイックミラー
８１１ ミラー
８１２ ＣＣＤカメラ
８１３ 励起光
８１４ 蛍光
１１０１ 電界による力の方向
１１０２ 圧力流による力の方向
１２０１ トラップの起こる範囲（斜線部）
１７０１ 電場による力
１７０２ 圧力流による力
１７０３ 中央部
１７０４ 逃げ出そうとするＤＮＡ
１８０１ 液体供給装置
１８０２ 液体供給リザーバ
Claims (4)
- ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子が含まれる液体を流すことができる流路で、かつ、当該流路が少なくとも一つ以上の広い部分と狭い部分の変化をもつ流路の中に、ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子が含まれる液体を、圧力流による力と電界による力を同時に逆向きに印加して流し、広さの変化している狭い部分の近くに当該線状分子の動きを一時的に捕捉保持（トラップ）し、その後必要に応じて、電界または圧力の大きさをトラップ条件からはずすことによって、一旦トラップした当該分子を速やかにあるいは計画的にリリースするものであり、
幅の広い部分は狭い部分に比べて断面積で２倍以上であり、狭い部分の幅が０．６ミクロンから５０ミクロンであることを特徴とするＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子のトラップ・リリース装置。 - 前記流路内において当該液体を移動させる圧力差を当該液体に印加することと、当該圧力差により当該液体が移動する方向と反対の方向に当該ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子を移動させる電界を当該液体に印加するものであり、当該圧力差が当該ＤＮＡあるいは電荷をもつ線状の分子に及ぼす力と当該電界強度が当該ＤＮＡあるいは電荷をもつ線状分子に及ぼす力がつりあう圧力差と電界強度を共に０．３から１．７倍した圧力差と電界強度を当該流路内に流した当該ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子が含まれる液体に印加することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子のトラップ・リリース装置。
- ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子が含まれる液体を流すことができる流路で、かつ、当該流路が少なくとも一つ以上の広い部分と狭い部分の変化をもつ流路の中に、ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子が含まれる液体を、圧力流による力と電界による力を同時に逆向きに印加して流し、広さの変化している狭い部分の近くに当該線状分子の動きを一時的に捕捉保持（トラップ）し、その後必要に応じて、電界または圧力の大きさをトラップ条件からはずすことによって、一旦トラップした当該分子を速やかにあるいは計画的にリリースするものであり、
前記流路内において当該液体を移動させる圧力差を当該液体に印加することと、当該圧力差により当該液体が移動する方向と反対の方向に当該ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子を移動させる電界を当該液体に印加するものであり、当該圧力差が当該ＤＮＡあるいは電荷をもつ線状の分子に及ぼす力と当該電界強度が当該ＤＮＡあるいは電荷をもつ線状分子に及ぼす力がつりあう圧力差と電界強度を共に０．３から１．７倍した圧力差と電界強度を当該流路内に流した当該ＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子が含まれる液体に印加することを特徴とするＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子のトラップ・リリース方法。 - 幅の広い部分は狭い部分に比べて断面積で２倍以上であり、狭い部分の幅が０．６ミクロンから５０ミクロンであることを特徴とする請求項３載のＤＮＡ或いは電荷をもつ線状の分子のトラップ・リリース方法。
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