CN111433350B - 从生物样品分离颗粒的方法、系统和过滤单元 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于从生物样品分离颗粒的方法和自动液体处理系统。本发明还提供了适用于这样的方法和系统的柱、容器和过滤单元。

Description

从生物样品分离颗粒的方法、系统和过滤单元

技术领域

本发明涉及用于诊断目的的高通量样品处理领域。特别是，本发明涉及用于从生物样品分离颗粒的方法、自动化液体处理系统、柱、容器和过滤单元，优选用于(但不限于)从血液样本分离罕见颗粒，例如包括循环肿瘤细胞(CTC)在内的循环罕见细胞(CRC)，或如循环肿瘤微栓子(CTM)的循环微栓子。

发明背景

癌症检测的时间点代表癌症患者治疗的主要预后因素之一，因为大多数肿瘤能发生转移，从而增加原发肿瘤治疗后癌症复发的风险。由肿瘤细胞扩散到血液循环中的转移细胞可能发生得很早，重要的是甚至在通过常规筛查或诊断检测到原发肿瘤之前。

对于癌症的诊断和预后，通常会进行侵入性检查，例如组织活检，以了解肿瘤组织的存在和进展。然而，这样的侵入性方法成本高昂，并且还使患者处于发病和心理应激的更高风险中。

另一方面，液体活检，例如外周血的，具有微创性，可用于多种疾病及其治疗过程的数个预测因素和生物标志物的早期和系列评估，包括缓解期间的随访筛查。例如已经将循环罕见细胞(CRC)，如循环肿瘤细胞(CTC)的和循环肿瘤微栓子(CTM)，其为包括CTC的细胞钳，确定为外周血流中有价值的生物标志物。CTC和/或CTM的检测允许评估肿瘤的组成、侵袭性、药物敏感性和治疗抗性。CTM的检测尤为重要，因为这些细胞簇似乎比单个CTC具有更大的转移潜力(Fabisiewicz等人,Med Oncol.2017；34(1))。

罕见颗粒分离技术的目的是以适合随后下游分析的方式收集这些颗粒。评估基于罕见颗粒分离的系统的三个主要标准是：高捕获效率、高分离纯度和高通量。

高捕获效率通过分离存在于样品中所有目标颗粒的能力得以定义。高分离纯度是指仅有效地分选目标颗粒，而无其他(不需要的)颗粒。高通量是指在较短时间内处理大量样品，以使系统适用于临床应用。

检测CTC和CTM的主要技术挑战是由于相对于血流中其他细胞，它们的数量极低。CTC的包含比例通常是1CTC对5Mio(百万)的其他单核细胞，特别是白细胞，1CTC对十亿个以上的红细胞。除了这些细胞或微栓子的罕见外，它们在形态学上各自的异质性进一步挑战了任何检测方法。

现有技术中已知用于分离循环罕见细胞，例如CTC的几种方法，其或涉及特定CTC表面标记物的检测，或涉及CTC与其他血细胞之间的物理差异，例如大小、密度、可变形性或电性能。此外，已经开发出用于分离罕见细胞的微流体装置。

在检测细胞表面标志物谱的情况下，基于免疫亲和力的富集系统(例如提供)是基于靶向CTC的上皮细胞粘附分子(EpCAM)的单克隆抗体。将抗体与能从血液样本磁性分离的铁磁流体纳米颗粒偶联。

关于物理分离技术，诸如ISET(按上皮肿瘤细胞大小分离)和ScreenCell^TM的过滤方法提供了多孔过滤器，可按尺寸将CTC与红细胞和白细胞分离。循环肿瘤细胞的直径在12至25μm的范围内，因此比直径8至14μm的白细胞和尺寸约为7μm的红细胞大得多(Ferreira等人，Mol Onc.2016；10)。通过选择合适孔径的过滤器，较大的循环肿瘤细胞因此可以被过滤器保留。

是一种包含多孔屏障的装置，其可使红细胞和白细胞通过屏障，同时保留CTC。该装置还包括基于密度的离心步骤，以实现CTC的更有效富集。

此外，已经开发了基于大小差异来分离细胞的微流体装置。例如，Zheng等人(Biomed Microdevices 2011；13)开发了一种3D微型过滤器装置，用于从血液中富集有活力的CTC，其中两个多孔PDMS层堆叠在微流体装置中。微流体装置中两层的构造降低了样品过滤过程中施加在细胞膜上的应力。

在以下现有技术参考文献中描述了其他的分离技术：

EP 0485228 A1涉及一种检测配体结合的方法，其包括检测在基本上不可压缩的微粒的基质的顶部或内部凝集物的存在或不存在。

EP 0536658 A1涉及一种用于对全血样品中的红细胞子集的密度进行群体频率分布分析的方法。

US 4,234,317涉及一种筛分血浆或血清血液样品的方法，尤其包括涂覆有基本上干燥的试剂等分试样的具有大表面积的多个惰性构件。

US 7,214,348涉及包括限流颗粒的微流体装置。限流颗粒可以包括凝胶过滤材料。

但是，现有技术中描述的每种方法都具有些缺点。基于免疫亲和力的系统依赖于癌细胞的特定细胞表面表达谱，但是，它们可能有很大差异。特别地，靶向抗原EpCAM在经历上皮到间质转化(EMT)的肿瘤细胞中不再表达。此外，在分离细胞后，细胞表面上的靶向抗原保持封闭，使得例如细胞表面表达谱的进一步分析变得困难。

另一方面，物理分离技术也具有缺点。例如，如果使用多孔过滤器将CTC与白细胞分离，则大小的部分重叠会导致结果不准确。此外，物理分离技术具有细胞可能在分离过程中受损的风险。例如，当细胞与多孔过滤器发生非特异性相互作用时，可能会发生细胞损伤。此外，由于细胞与细胞之间的相互作用或细胞与过滤器之间的相互作用，过滤器的孔可能会堵塞。这种堵塞不仅会抑制过滤过程，而且还会导致细胞在穿过或陷于过滤孔中时产生较高的剪切应力。高剪切应力和压力也与细胞变形能力有关，最终影响过滤技术的性能。例如，已知包含至多20个细胞的CTC簇即使在全血中也能穿越5到10μm的收缩区域(Au等人，PNAS 2016；113(18))。因此，这样的簇也可以通过变形而绕过较小直径的过滤孔，因此未被检测到。

微流体装置遭受高度复杂设计、长处理时间和低通量的困扰。而且，捕获的活细胞极其难以从微流体装置中提取。然而，如果需要在微流体流动室之外进行进一步的下游应用，则必须进行提取。此外，这种装置通常仅包含几纳升至甚至飞升的体积。但是，血液中的循环罕见细胞浓度非常低(例如，每毫升全血中CTC的浓度仅为约1至10个细胞，Millner等人，Ann Clin Lab Sci，2013)，导致处理过程极其漫长。增加流速以克服此时间限制通常不是一个可行的选择，因为同时增加的剪切力最终会损坏细胞膜。最后，出于实际原因，通常由PDMS构建微流体装置。但是，PDMS会溶解气体和疏水性化合物，导致气泡形成以及细胞与PDMS表面的非特异性附着，这最终可能会对细胞造成伤害。

因此，鉴于用于分离罕见肿瘤细胞的已知系统的上述缺点，仍然需要一种方法来捕获生物样品中存在的所有靶标颗粒，以有效地仅分离靶标颗粒，在短时间内处理大量样品。还需要一种适于执行这种分离方法的柱和过滤基质，更确切地说是一种用于分离和回收生物样品中选定的生物材料的柱，优选(但不限于)用作用于过滤生物样品并分离罕见颗粒-例如包括循环肿瘤细胞(CTC)在内的循环罕见细胞(CRC)或循环肿瘤微栓子(CTM)的柱。当在短时间内处理大样品量时，这种柱和/或过滤单元应优选进一步适合于被使用，例如，柱/过滤单元可以适合于集成到适合于自动化和高通量处理的系统中。

发明概要

本发明通过提供从生物样品分离颗粒的方法来解决现有技术的缺陷，其中该方法包括以下步骤：

-提供具有上部开口和下部开口的柱，

其中所述柱包括至少第一区段，其包含具有第一直径的第一多个微珠，其中所述第一多个微珠保留在所述柱中，以防止所述第一多个微珠穿过下部开口；

-将所述生物样品通过所述柱的上部开口施加在过滤基质上；

-将所述生物样品的第一部分颗粒与所述生物样品的第二部分颗粒进行分离；

其中所述生物样品的第一部分颗粒穿过第一区段；且其中所述第一区段保留所述生物样品的第二部分颗粒；

-将保留的所述生物样品的第二部分颗粒和所述第一区段悬浮在缓冲液中以形成悬浮液；

-将悬浮的所述生物样品的第二部分颗粒与悬浮的第一区段进行分离。

从生物样品分离颗粒(例如罕见细胞)的建议方法是基于颗粒大小的分离。第一区段作为过滤基质，包含特定直径的微珠，从而在相邻的微珠之间提供明确界定的空隙。这些空隙充当生物样品的过滤器，即，尺寸大于所形成的空隙的尺寸的颗粒被微珠捕获。选择的微珠直径越小，空隙越小，因此有效的过滤器尺寸也越小。因此，包括微珠的第一区段可以捕获直径大于由微珠形成的空隙的颗粒(“第二部分颗粒”)，而其余部分穿过这些空隙(“第一部分颗粒”)。

当目标颗粒捕获在空隙内时，通常形成为三维隧道结构的微珠之间的空隙体积提供最小的接触面积。同时，捕获的颗粒未占据的空隙的剩余体积减小了捕获的颗粒所经历的剪切应力，并且通过允许低于临界空隙直径的颗粒穿过而防止了过滤基质的堵塞。给定40μm的微珠大小，每平方毫米总计576个空隙。这比其他基于大小的分离技术，即通过多孔的洞，压缩物/柱杆更加密集和稳定。因此，避免了与某些先前已知方法中遇到的与堵塞相关的效能问题。

至少第一区段的微珠的另一有利特征是能够捕获表现出高度可变形性的颗粒。特别是，只要施加足够的压力和应力，细胞簇就可以挤压通过传统的多孔过滤系统。通过在这样的区段上设置多个微珠作为过滤基质，并因此沿流动路径具有多个过滤空隙，甚至可能捕获易于变形的颗粒。此外，在过滤过程中，微珠的弯曲有助于减轻细胞损伤，从而使分离后的完整、存活的细胞得以分离。

通过将过滤、捕获的第二部分颗粒悬浮在缓冲液中，第一区段的有序排列丧失。因此，基于第一区段的微珠的直径，第一区段的微珠不再形成有效的过滤器。结果，第二部分颗粒被释放到缓冲液中并且可以与第一区段分离。

在另一实施方式中，通过重力或通过施加离心力将生物样品的第一部分颗粒与生物样品的第二部分颗粒分离，优选其中分离的生物样品的第一部分颗粒被收集在第一容器中。

特别地，离心力的施加允许第一和第二部分颗粒快速分离。离心力可以适应于生物样品，以便不损坏生物样品或不使生物样品的颗粒变形。

在另一实施方式中，悬浮的第二部分颗粒借助于重力或离心力与悬浮的第一区段分离。离心力特别允许将颗粒与剩余的微珠分离，因为微珠的密度和尺寸与颗粒不同。

悬浮的第二部分颗粒可以可替代地或另外通过其他方式分离，例如基于免疫亲和的富集或基于密度的富集。

所述方法可以进一步包括浓缩分离的第二部分颗粒的步骤。

可以通过施加离心力来浓缩分离的第二部分颗粒。例如，第二部分颗粒可以在离心储存器或第三容器中以1000-2000g离心10至15分钟，以将第二部分颗粒收集在离心储存器或第三容器的底部。

所述方法可以进一步包括将分离的第二部分颗粒转移到下游分析的步骤。下游分析可以包括微观分析或整体生化分析。转移步骤可以在将悬浮的生物样品的第二部分颗粒与悬浮的第一区段分离之后和/或在浓缩分离的第二部分颗粒之后进行。

微珠可以是基本上不可压缩的。这允许即使当施加离心力时，微珠的空隙的尺寸，即有效的过滤器或孔的尺寸也保持良好限定。

微珠可以是基本上无孔的。这允许生物样品的颗粒，即第一部分和第二部分颗粒，不渗透到微珠中，因此不被捕获在微珠内。因此，在第二部分颗粒与第一部分颗粒分离期间，仅在微珠之间形成的空隙确定过滤器的尺寸。根据将要分离的颗粒的尺寸，可以在执行方法之前计算空隙尺寸。因此，与常规的凝胶过滤技术相反，不需要对过滤基质进行校准。

微珠可以由选自尼龙、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素、纤维素衍生物和葡聚糖中的一种或多种聚合物、玻璃、陶瓷、和/或金属组成。琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素衍生物和葡聚糖可以任选地交联。这些材料证明与生物样品相容。

微珠可以是磁性的。特别地，仅一部分微珠，例如一个或多个区段的微珠可以是磁性的。例如，第二区段可以包括磁性微珠。在分离第二部分颗粒的步骤期间，随后可以施加磁力以将第二区段与第二部分颗粒分离。

微珠在诸如血液等生物样品中可以是不溶的和/或不溶混的。从而，微珠在分离颗粒期间是稳定的，并且可以重复使用。

微珠可以与生物样品无反应。因此，只有空隙的大小决定了生物样品颗粒的分开和分离。

或者，第一区段可以包括对生物样品的至少部分颗粒具有反应性的微珠。特别地，可以将针对生物样品中包含的抗原，优选针对生物细胞表面上包含的抗原的抗体与微珠偶联。

第一区段可能是可悬浮的。因此，第一区段的提供方式不局限于任何不可移动的物理边界或限制，例如在过滤基质的顶部和底部上的固定过滤器。结果，第二部分颗粒、第一区段的微珠和缓冲液可以形成悬浮液，可以采用直接的方式，例如通过离心将第二部分颗粒从其中分离出来。

微珠的第一直径可以在20至700μm的范围内，优选50至600μm。该直径允许形成的过滤空隙在3至110μm之间。这样的空隙尺寸允许分离多种生物颗粒，例如细胞簇或大的CTC。

微珠的第一直径可以可选地在10至1000nm的范围内，优选为50nm至500nm，更优选为100nm至300nm。这些微珠尺寸允许在纳米范围内分离生物颗粒，例如尺寸在20至50nm之间的细胞外囊泡(外泌体)或尺寸在50至1000nm之间的微泡。

此外，微珠的第一直径可以可选地在1μm至20μm的范围内。该直径允许例如凋亡小体的分离。

微珠的前述特性可以应用于前述和以下实施方式中的每一个。

在另一实施方式中，在提供具有上部开口和下部开口的柱的步骤中，过滤基质的第一区段通过位于下部开口的约束装置(constricting means)保持在柱中。由此，第一区段稳定地定位在柱中并且不流过下部开口。虽然约束装置允许第一区段的微珠稳定于柱中，但是它也允许缓冲液和较小尺寸的颗粒，例如第一部分颗粒，可以流过柱并离开下部开口。因此，约束装置不完全阻塞下部开口，而仅约束下部开口。

约束装置可以临时定位在柱的下部开口处和/或可以是可移动的。因此，在将第一部分颗粒与第二部分颗粒分离的步骤中，约束装置可以位于柱的下部开口处，并且在将第一部分颗粒与第二部分颗粒分离的步骤之后、和/或在形成第二部分颗粒和过滤基质的悬浮液的步骤中、和/或在形成第二部分颗粒和过滤基质的悬浮液的步骤之后，约束装置可以被移除。

在一实施方式中，约束装置包括第二区段，该第二区段包括具有第二直径的第二多个微珠，其中，第一直径小于第二直径。第二区段可以有效地阻塞柱的下部开口，从而支撑第一区段。

在另一实施方式中，约束装置包括第二区段和/或位于柱的下部开口处的机械屏障。机械屏障可以是支撑第二区段的微珠的过滤器或柱下部开口的一部分。下部开口例如可以形成为十字形或形成为过滤器以支撑第二区段。

在另一实施方式中，约束装置是插塞，优选地是可移除插塞。约束装置例如插塞可以由位于柱下方的容器提供。特别地，约束装置可以是定位在柱的下部开口处的居中突起，其中至少部分突起装配入柱中。居中突起可包括至少上部和下部，其中上部安装入柱中，并且其中下部支撑柱的下部开口的侧壁。或者，插塞可以是多孔的，可移动的盖子，以定位在柱的下部开口处。

在另一实施方式中，第一区段和第二区段被设置为堆叠层，第一区段是顶层。

通过以分层的几何形状应用包括具有不同直径的微珠的区段，柱不需要额外的装置来保留第一区段的微珠。相反，具有较大微珠的第二区段可以有效地阻塞柱的下部开口。通过将保留的第二部分颗粒悬浮在缓冲液中，过滤基质的第一和第二区段的有序排列丧失，第二部分颗粒被释放到缓冲液中，同时柱的下部开口的阻塞被减少或消除。由此，例如，悬浮的第二部分颗粒可以与较小尺寸的微珠一起通过下部开口离开柱，而在柱中留下较大尺寸的微珠。

在另一实施方式中，柱包括多个区段，其中两个区段为第一区段和第二区段，其中每个区段包括具有特定直径的多个微珠，多个区段至少在微珠的特定直径上不同，其中第一区段的第一直径包括最小直径。

在另一实施方式中，多个区段被设置为堆叠层，第一区段是顶层，并且其中多个区段的微珠的特定直径从顶层到底层逐渐增加。这种几何形状促使流动压力降低，因为朝向底层的每个区段都包含较大的空隙。从而，增加了通量。

在另一实施方式中，多个区段包括3至7个区段。该范围反映了最佳的流动压力曲线，以及最佳的颗粒分离，例如CTC或微栓子的分开和分离。

在另一实施方式中，在施加到第一区段上之前，通过密度梯度离心步骤使生物样品的颗粒富集。为了减小施加到第一区段上的生物样品的体积，这种富集步骤可能是特别有利的。

在另一实施方式中，所述方法用于分离循环肿瘤细胞，其中第一直径在80至200μm的范围内。

在另一实施方式中，所述方法用于分离循环微栓子，其中第一直径在200至600μm的范围内。

在另一实施方式中，所述方法用于细胞外囊泡的分离，其中第一直径在10至1000nm，优选50至500nm，更优选100至300nm的范围内。

在另一实施方式中，所述方法在自动液体处理平台中实施。

在另一方面，本发明还涉及一种用于从生物样品分离颗粒的自动化液体处理系统，其中，该系统包括：

-用于将包括上部开口和下部开口的柱定位于第一容器上的装置，其中所述柱设置有至少第一区段，所述第一区段包括具有第一直径的第一多个微珠，其中所述第一多个微珠保留在所述柱中以防止所述第一多个微珠穿过下部开口，以便将生物样品的第一部分颗粒与生物样品的第二部分颗粒分开；

-用于将液体样品转移到柱、第一容器和/或第二容器中的装置；

-用于从柱、第一储存容器和/或第二容器抽吸液体样品的装置；和

-用于离心柱、第一储存容器和/或第二容器的装置。

液体样品的体积至少为0.1ml。液体样品的体积最多为500ml。这样的体积允许以有效的方式处理生物样品。例如，对于CTC的检测，通常需要至少2ml血液样本。考虑到CTC罕见，为了增加检测罕见细胞的可能性，优选采用较大体积，例如10毫升全血样品。

在另一方面，本发明还涉及适于在从生物样品分离颗粒的方法中使用的柱，其中该柱包括：

-上部腔室，用于接收生物样品，且在其侧面由一个或多个侧柱壁界定，延伸入其下端的锥形部分；

-从锥形部分向下延伸到下部开口的细长通道；

其中，

-所述细长通道至少部分地被至少第一区段填充，该第一区段包括具有第一直径的第一多个微珠，其中第一多个微珠保持在柱中以防止第一多个微珠穿过下部开口。

在另一实施方式中，柱还可以包括盖部，该盖部包括上部开口以密封上部腔室，通过该上部开口接收生物样品。

在另一实施方式中，在细长通道的下部开口处设置约束装置，以将第一多个微珠保留在柱中。

约束装置可以包括第二区段，该第二区段包括具有第二直径的第二多个微珠，其中，第一直径小于第二直径。

约束装置可以包括保留第二区段的下部开口的十字形端部。选择尺寸，使得位于约束装置上方的微珠被装置的十字形所保留。可以想到的是，选择十字形端部的尺寸，使得至少一个区段的微珠，特别是第一多个微珠，适合穿过约束装置。

约束装置可以包括多孔过滤器。

至少第一区段和第二区段可以包括以上为本发明方法所定义的微珠。特别地，微珠可以是基本上不可压缩的。此外，微珠可以是无孔的。特别地，微珠可以由选自尼龙、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素衍生物和葡聚糖中的一种或多种聚合物、玻璃、陶瓷、和/或金属组成。微珠可以是磁性的。微珠在诸如血液的生物样品中可能是不溶的和/或不溶混的。微珠可能与生物样品无反应。或者，柱可包含对生物样品的至少部分颗粒具有反应性的微珠。第一区段和/或第二区段可以是可悬浮的。微珠的第一直径可以在20至700μm的范围内，优选为50至600μm，或者在10nm至1μm的范围内，优选为50nm至500nm，更优选为100至300nm，或者在1μm至20μm的范围内。在另一实施方式中，第一区段和第二区段被设置为堆叠层，第一区段是顶层。在另一实施方式中，柱包括多个区段，其中的两个区段为第一区段和第二区段，其中每个区段包括多个特定直径的微珠，多个区段至少在微珠的特定直径上不同，其中第一区段的第一直径包括最小直径。在另一实施方式中，多个区段被设置为堆叠层，第一区段是顶层，并且其中多个区段的微珠的特定直径从顶层到底层逐渐增加。在另一实施方式中，多个区段包括3至7个区段。

在另一方面，本发明还涉及一种容器，其中该容器包括用于容纳部分或全部生物样品的容器腔室，并在其侧面由一个或多个侧容器壁界定，其中布置所述容器使得当将所述柱放置在容器的顶部时，柱的细长通道突出入容器腔室中。

所述容器的底部可包括锥形的底壁，以建立捕获部分(36)。

所述容器可以包括作为约束装置的居中突起(39)，被定位在柱的细长通道的下部开口处，其中该突起装配入柱的细长通道中。

所述居中突起可以至少包括上部和下部，其中上部装配入柱的细长通道中，并且其中下部支撑细长通道的下部开口的侧壁。下部可以具有例如大于上部的直径。直径的变化可以是连续的(例如，截锥的形式)，或者直径的变化可以是不连续的。优选地，在细长通道的侧壁与突起的侧壁之间形成通道，允许液体流过该通道并进入容器腔室。这样的通道可以具有例如10至40μm的宽度，优选约20μm。因此，虽然液体和较小的颗粒可以通过通道从柱中流入容器腔室，但是较大的颗粒，特别是大于该尺寸的微珠被稳定地安置在柱中。

本发明还涉及一种过滤单元，其包括如上所述的柱并且还包括如上所述的容器。

本文所用的术语“颗粒”包括但不限于细胞、血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、红细胞、白细胞、淋巴细胞、上皮细胞、干细胞、癌细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、细胞前体、造血干细胞、间充质细胞、基质细胞、血小板、精子、卵、卵母细胞、微生物、微生虫、细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒、细胞器、核、核酸、线粒体、胶束、脂质、细胞外囊泡、蛋白质、蛋白质复合物、细胞碎片、寄生虫、脂肪滴、多细胞生物体、孢子、藻类，上述物质的簇或聚集体。颗粒可以是刚性的或可变形的，并且可以具有各种尺寸和形状。颗粒的尺寸可以变化，例如，最大直径可为约20nm至约1mm。

生物样品可以是任何含有生物元素的流体、凝胶或溶液。例如，要从中提取罕见细胞的生物学样品可以是来自人或动物的任何体液或细胞组织的分散体。其实例是血液，特别是外周血，例如静脉或动脉血，淋巴液、尿液、分泌液、渗出液、脊髓液、精液、唾液、来自天然或非天然体腔的流体、骨髓和分散的身体组织。最优选的体液是外周血。

在本发明的上下文中，“基本上不可压缩”是指微珠对形状或尺寸变化的抵抗力，该变化可能是由于向微珠施加力而引起，例如离心力、磁力、电场力、静水压力、负压或正压作用力等，或以正常重力长时间存储引起。基本上不可压缩的微珠表现出至多1.5，优选至多1.2，更优选至多1.1的压缩系数，其中压缩系数(CF)定义为CF＝重力沉降体积/填充床体积。可以通过2-100g离心或通过将柱连接到真空泵适当的时间直到床体积保持恒定来进行微珠填充柱。

在本发明的上下文中，“基本上无孔”是指相对于生物样品的感兴趣颗粒，即要分开和分离的第一部分和第二部分颗粒的微珠孔隙率。这些颗粒不能渗入基本上无孔的微珠。但是，这并不排除微珠包含尺寸范围低于颗粒尺寸的孔，即微珠的截止值(或排除极限)可以低于颗粒尺寸。因此，基本上无孔的微珠通常可以被小分子例如低于微珠的尺寸排阻极限的寡核苷酸或肽渗透。

实际上，第一多个微珠、第二多个微珠以及任何其他多个微珠的微珠直径并非精确地具有均匀的尺寸。例如，可商购的微珠不是严格均匀的并且包括直径的分布。例如，产品编号为G9143的未清洗的玻璃珠具有筛孔尺寸，其中指出90％的微珠在212至300μm的范围内。在一个区段中使用这些未洗涤的玻璃珠应理解为具有“第一直径”、“第二直径”和/或“特定直径”的微珠。为了本发明的目的，微珠直径的确切分布可以根据所需的应用而有所不同。但是，由于各种不同区段的微珠，必须实现上述过滤效果。优选地，在一应用中，微珠中至少50％的微珠具有基本相同的直径或窄的分布。在其他应用中，微珠中至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的微珠具有基本相同的直径或窄的分布。而且，微珠中100％的微珠可能具有基本相同的直径或窄的分布。

附图简述

在下面的详细描述中参考以下附图将描述本发明的当前优选实施方式：

图1a至c：示出由三个相邻的微珠形成的空隙的示意图，其可以用作根据本发明的过滤器。

图2a至c：示出根据本发明的容器的示意图。

图3a至c：示出根据本发明的方法的工作流程图。

图4a至e：示出根据本发明的容器的示意图。

图5a至c：示出根据本发明的方法的工作流程图。

图6：示出根据本发明的方法的工作流程图。

图7：示出健康检查图，其可以利用根据本发明的方法、系统、柱和容器。

图8a、b：示出平均直径为20μm(a)和平均直径为30μm(b)的硅珠的显微图像(760×放大)。

图9a至g：示出血沉棕黄层样品(a)、施加到20μm微珠基质上后的流出物(b)、在20μm微珠基质悬浮后分离的颗粒(c)、施加到50μm基质上后的流出物(d)、在50μm微珠基质悬浮后分离的颗粒(e)、施加到50μm基质上后流通(f)、在50μm微珠基质悬浮后分离的颗粒(g)的显微图像(图a-e：350×放大；图f-g：760×放大)。

图10a、b：示出平均大小为30μm的微珠空隙中捕获的凝集红细胞的显微图像(350×放大)。

具体实施方式

在下面的详细描述中将描述本发明的优选实施方式和实施例。然而，要强调的是，本发明不限于这些实施方式。

本发明涉及一种用于从生物样品分离颗粒的方法、系统、柱、容器和过滤单元以克服上述现有技术中已知的限制和挑战。有利地，所述方法、系统、柱、容器和过滤单元能够提供大量样品的高通量过滤，同时保持细胞活力并提供高产率和高纯度。

所建议的用于分离生物(样品)的方法以及系统、柱和过滤单元基于或包括第一区段，该第一区段包括特定直径的微珠。这些微珠形成空隙，用作生物颗粒的过滤器。直径或尺寸大于空隙尺寸的生物颗粒被捕获在区段中。有利地，当目标颗粒被捕获在空隙中时，成形为三维隧道结构的微珠之间的空隙体积提供了最小的接触面积。同时，捕获的颗粒未占据的空隙的剩余体积减小了捕获的颗粒所经历的剪切应力，并且通过允许低于临界空隙直径的颗粒通过而防止了过滤基质的堵塞。此外，第一区段是具有过滤空隙的三维基质，它能够分离和捕获通常在压缩中变形从而避免被捕获的颗粒。

被捕获的颗粒可以直接从第一区段回收。重要的是，根据建议的方法，颗粒保留在缓冲液中，从而增加了分离活的、未损坏的生物颗粒的可能性。

图1a示出了捕获圆形颗粒102的空隙的形成。该空隙由至少三个相邻的微珠101形成。可以根据以下公式计算由三个相邻的微珠形成的空隙直径。

其中d是由三个微珠形成的空隙的直径，D是每个微珠的直径。图1b以及表1包括对于均一尺寸的示例性微珠的计算空隙。

第一区段的微珠基质的分布是相对一致的。例如，特定直径为500μm的微珠可提供恒定且精确的空隙，以捕获直径为80μm及以上的颗粒。显然，实际上，精确的空隙可能会略偏离计算值。然而，一般而言，如果例如微珠是不可压缩的，则获得对应于或非常接近所计算的空隙直径的值。

表1：均一大小的微珠的孔径。

通过使用不同大小的微珠的混合物，空隙直径会发生变化，可以测量或计算(图1c、表2)。

表2：不同尺寸微珠的孔径

图2a以过滤单元1的形式示出了根据本发明的装置，其具有柱2和容器3。在不同的实施方式中，过滤单元1(及其柱2和容器3)具有大致圆柱形或矩形的形状。在不同的实施方式中，装置可以仅包括柱2，在那种情况下，它可以适于连接到架子或储器。一个过滤单元1的柱2和容器3被设计成使得它们可以组装在一起或者与来自相同类型的另一过滤单元1的任何其他部件组装，例如，柱2可以与不同的容器3接连组装。

过滤单元1的合适材料包括：聚丙烯、聚乙烯、玻璃。在一实施方式中，过滤单元1通过注射成型形成。应当注意，在几个实施方式中，过滤单元1的各个部分不需要由相同的材料制成。

过滤单元的柱2具有用于容纳一种或多种生物样品的上部腔室21。该上部腔室21由位于柱2的一个或多个侧壁22的中间的空腔形成。在一实施方式中，上部腔室21可以是基本圆柱形的形状，从而形成管。柱2在其上端(在其上部腔室21上方)具有上部开口24，用于将一种或多种生物样品引入上部腔室21中并使一种或多种生物样品流出上部腔室21。上部开口24附近可以设有移液通道连接件25(用于与实验室自动化系统的移液通道连接)，和/或用于封闭上部开口并因此密封上部腔室21上端的盖(图2a中未示出)。在一实施方式中，该盖是弹性体片。移液通道连接件25的存在促进并简化了用移液通道而不是特定的机械臂直接转移样品。在这两种情况下，都应专门设计以匹配递送样品的器件，甚至直接静脉穿刺。

上部腔室21的下部形成锥形部分29，该锥形部分的侧壁是锥形的，即，当沿向下方向(即从上部区段的顶部到下部区段的底部)移动时，相对壁之间的距离(或一个或多个连续侧壁的相对侧之间的距离)变小。锥形部分29的末端是朝向向下方向，并向与锥形部分29连接的细长通道26打开的开口。在一些实施方式中，细长通道26从柱2的锥形部分29向下突出。在一优选实施方式中，细长通道26包括过滤器元件4(见图2b)，将在本说明书的后面部分进行详细描述。在具有容器3的实施方式中，细长通道26可突出入容器3的容器腔室31中。细长通道26的长度和直径可以适于给定生物样品的采样类型和方法，即用于优化过滤效果的实例。例如，在一些实施方式中，细长通道26可以足够长以容纳柱状过滤器元件形式的过滤器元件4。细长通道26在其下侧末端有下部开口27，以使得能够排出容纳在上部腔室21中的一部分或多部分生物样品。该下部开口27可以包括约束装置271，其预定的间距足够大以允许未过滤的生物样品流通。约束装置271可以包括在细长通道26内延伸的锥形和成角度的斜面。或者，约束装置271可以是多孔过滤器。

优选地，过滤单元1的柱2一体成型，例如通过注射成型。然而，在一些实施方式中，柱2可以包括主体和盖部210。盖部210可以与柱2的其余部分(也称为“主体”)分开地制造，其中每个部分可以通过注塑成型生产，然后组装。已经证明该实施方式易于制造并且具有成本效益。

盖部210可以位于柱2的上端。它可以包括基本平行于柱2的侧壁22的侧壁211。侧壁211优选地围绕上部区段的侧壁22，并且可以通过摩擦力与它们连接。在一实施方式中，提供有用于将柱2的主体连接至盖部210的连接凹槽212。该连接凹槽212可以设置在盖部210的侧壁211上或柱2的侧壁22上。该连接凹槽212可以设置在侧壁22和211之间，以替代或补充将盖部210维持连接于柱2的主体的摩擦力。盖部210还可以包括内壁213，其基本上平行于侧壁211，并位于柱2的主体的上端，使得当盖部210连接到柱2的主体时，内壁213和侧壁211形成狭槽214，柱2的主体的侧壁22的上部夹持在其中，从而确保柱2的主体与盖部210之间的连接更加稳定，并确保上部腔室21更好的密封。

对于矩形过滤单元1，柱2的外表面可以包括锚定突起23，优选成对的两个、四个、八个等。这些突起使柱2可靠地定位在过滤单元1的容器3或兼容的架子上。

过滤单元1的容器3可以包括开放的上端，上部区段的下部可以通过其进入。容器3可以包括用于收集例如分离的样本流体的容器腔室31。容器腔室31由在开放上部、容器的一个或多个侧壁32与底端34之间形成的间隔界定。下部腔室31也可以是圆柱形或矩形的。最优选地，它具有与被设计附接到其上的柱2相同的形状。

容器3在其上部开口端处可具有围绕其开口(在侧壁32的顶端处)的凸缘33，用于容纳柱2的一个或多个突起23，并确保过滤单元1的柱与容器之间的连接。这种凸缘33还具有以下优点：便于拆卸、和/或定位在离心机和/或自动处理系统上、和/或定位在兼容的架子上。

下部腔室31的底端34可设置有形成锥形部分(即，当向下移动时，相对壁之间的距离或一个或多个连续侧壁的相对侧之间的距离变小)的一个或多个底壁35。底端34还可以在底壁35的下端处设置有减小的捕获部分36。在示例性实施方式中，容器还可以包括盖以便能够安全运输容器3及其从柱2接收用于进一步处理的内容物，从而减少丢失和/或污染容器3中内容物的风险。

容器3可以进一步设置有一个或多个壁延伸部37，其使得容器3的一个或多个侧壁31沿基本向下的方向延伸。这些一个或多个壁延伸部37优选地构造成允许容器在平坦表面上稳定地立足，而无论容器是否存在与柱2附接或分离。例如，这些壁延伸部37可以至少向下延伸到容器3的一个或多个底壁35或捕获部分26。这些壁延伸部34可以具有基本水平的端面，适于支撑它们并确保与可以放置容器2在其上的外表面稳定接触。

在优选的实施方式中，柱和容器以可以拆卸的方式设计，其中例如，柱2的减小的外表面小于容器3的内表面，从而当柱和容器连接在一起时施加摩擦力。当上部区段3与容器3连接时，柱2的减小的外表面，上部腔室21的锥形部分29和柱2的细长通道26容纳在容器腔室31中。

参考图2b和2c，包含在细长通道26中的过滤器元件4可以由微珠411和412、413的基质41形成。在这种情况下，一个区段包括多个微珠411(上部区段，即“第一区段”)，另一区段包括多个微珠412(中间区段)。此外，一个区段包括多个微珠413(下部区段，即“第二区段”)，其配置为将微珠411和412保留在柱中，而较小的颗粒(即“第一部分颗粒”)和缓冲液可以通过。因此，包括微珠基质41的微珠(413)的下部或“第二”区段是将上述部分411和412保持在柱中的约束装置的一部分。在一些实施方式中，柱2的细长通道26具有基本圆柱形的内表面，其填充有微珠基质41。

根据本发明的微珠基质41是指基本上不可压缩的微珠101的尺寸连续或尺寸不连续的基质。用语“尺寸连续的基质”旨在表示微珠101的尺寸逐渐增加。用语“尺寸不连续”意在表示基质包括尺寸依赖的微珠区段，各区段内的微珠具有特定的直径，并且在细长通道结构的范围内随机地扩散。

用于微珠101的非限制性的合适的不可压缩材料包括不锈钢、磁性、硅石，在血液中不溶和不混溶，与血液不反应。这种微珠101也可以由其他材料制成，例如玻璃或陶瓷，和/或一种或多种聚合物，例如尼龙、聚四氟乙烯(TEFLON^TM)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素衍生物或葡聚糖，和/或可由金属构成。微珠101的实例包括但不限于磁隔离、磁性颗粒、塑料颗粒、陶瓷颗粒、碳颗粒、玻璃隔离、金属颗粒、复合合成物颗粒、超细加工独立式微结构等。

在图2b中，过滤单元1的柱2填充有微珠的基质41，其具有三区段微珠411、412和413。虽然包括多个微珠411的区段用作过滤器，但是区段413是约束装置的一部分。如上所述，各区段微珠411、412和413中的微珠可以优选地具有基本均匀的尺寸，即，包括如市售微珠通常的直径分布(参见上文)。要注意的是，微珠的基质41也可以具有比本说明性实施例中公开的三个区段更少的区段(即两个或一个)或更多的区段。这些区段按层排列，其中顶层的微珠具有最小的直径(例如80μm)，而底层的微珠具有最大的直径(例如300μm)。中间层包括直径例如为200μm的微珠。底层布置在柱的下部开口处，使得微珠堵塞或压制开口。顶层的80μm尺寸的微珠形成约10μm的有效空隙，能够用于分离CTC、CIC和CTM。

图3a至c示出用于分离循环罕见细胞的方法的实施方式。生物样品8可以是例如血沉棕黄层或全血样品。在将样品施加到微珠基质上之前，可以通过任何方式稀释全血样品或富集感兴趣的生物颗粒。例如，代表本申请人提交的PCT/CN2017/072654中描述的密度梯度离心方法可以应用于在施加到过滤基质上之前富集样品中的生物颗粒。

下面描述的所有方法步骤都可以手动执行，或可以在自动液体处理系统中执行。

在图3a至c的示例方法中，将2ml全血用作用于检测循环肿瘤细胞、循环免疫细胞(CIC)和/或微栓子的样品液体。首先通过密度梯度离心分离样品，得到两个部分，即大约1ml血浆和单个核细胞(MNC)，以及1ml RBC和重细胞，和/或被RBC捕获的CTC/CIC/微栓子。然后将包含RBC和重细胞的部分施加到包含在柱2中的过滤基质41上。该过滤基质包括三区段大小均一的微珠411、412和413。这些区段分层排列，其中根据优选的实施方式，顶层的微珠具有最小的直径(50μm)，而底层的微珠具有最大的直径(300-500μm)。中间层包括直径大于60μm，优选100-220μm的微珠。顶层的50μm大小的微珠形成约7.7μm的有效空隙，因此可以用于分离CTC、CIC和CTM。微珠的底层堵塞柱的下部开口。由此，微珠的上层被稳定地在柱中，底部微珠层上方。

通过将微珠悬浮液(例如，在水中或在20％乙醇中的微珠)通过上部开口24连续移液到柱2中可以将微珠基质填充到柱中，各悬浮液包括特定大小的微珠。最后，将具有最小微珠的悬浮液(“第一区段”)移入柱中。然后可以通过离心干燥微珠基质，并用缓冲液例如PBS洗涤，之后施加生物样品。

在图3a的步骤a中，将生物样品8通过上部开口24施加到微珠基质41上，该生物样品8任选地在密度梯度离心后富集并且可能包含CTC、CIC和/或CTM。生物样品8由此缓慢进入第一区段，大于第一区段，即顶部微珠层空隙直径的生物颗粒被保留。在图3a的步骤b中，将可以作为过滤单元1的一部分并进一步放置在容器3上的柱2离心，例如以5-20g离心2至5分钟，优选2至3分钟。离心参数可以改变，取决于样品以及要提取的生物颗粒。通过离心，生物样品的第一部分颗粒可以穿过第一区段以及其他区段(包括在柱的下部开口处的第二区段)的微珠，并在下部开口处离开柱。原则上，重力足以使第一部分颗粒通过微珠基质，但是，通过离心，通过的时间可以显著减少。这样的时间减少是有利的，因为它减少了周转时间以及在处理过程中生物样品的颗粒被损坏的可能性。离心后，生物样品的流体812，例如生物样品富集过程中使用的缓冲液或血浆，以及其直径或大小低于临界尺寸10μm(即，具有最小尺寸微珠的微珠层的空隙尺寸)的第一部分颗粒811流过具有区段411、412和413的微珠基质41并收集在容器3中，而高于临界值的第二部分颗粒813(如果有的话)，则保留在微珠有效空隙的上方或内部。第二部分的这些颗粒的尺寸或直径大于10μm，因此被截留在最小尺寸的微珠，即第一区段的微珠的空隙中。

在图3a的步骤c中，将容器3和柱2分离。包括低于临界值的第一部分颗粒811的容器3可以被取出或进一步处理，特别是通过根据本发明的方法。因此，在图3a的步骤a”中，可以将颗粒811施加到包含多个微珠的另一柱上，所述多个微珠的直径小于区段411中的珠的直径。例如，柱可以包括形成第一区段的直径为40μm的微珠，从而提供约6μm的过滤空隙。通过将第一部分颗粒施加到这种柱上，可以进一步分离成尺寸或直径大于6μm的部分颗粒和尺寸小于6μm的部分颗粒。

捕获在微珠的基质41的空隙中的第二部分颗粒可以根据本发明的方法进一步处理。在图3b的步骤d中，将微珠的基质41和第二部分颗粒悬浮在缓冲液中。例如，2ml PBS足以形成颗粒和微珠的悬浮液。通过悬浮颗粒和微珠，区段411、412和413的限定结构丢失，并且颗粒从第一区段411释放到缓冲液中。该步骤确保了所有被捕获的颗粒现在可以从悬浮液中分离出来，而在生理含水环境中。

根据本发明的优选实施方式之一，将包括微珠基质41和捕获的生物颗粒的过滤单元1的柱2转移到容器3’中，该容器3’装有缓冲液9，例如2毫升PBS。在这种情况下，过滤单元1的柱2的下部开口27浸入容器3’中的缓冲液中。通过经由下部开口27将缓冲液抽吸到柱2中并用移液通道重复分配，微珠的基质41至少在很大程度上被破坏。特别地，包括大微珠以最初约束下部开口(即，用作约束装置)的微珠基质的底层被破坏，并与其他微珠层的较小微珠混合。因此，下部开口不再被较大的微珠堵塞，生物颗粒和较小的微珠可以通过柱2的下部开口27进入容器3’的容器腔室31。

根据本发明的一个实施方式，第二区段的微珠，即具有较大直径的微珠，其阻塞了下部开口以用作约束装置，是磁性的。因此，通过将过滤单元1的柱2穿过磁性元件或在磁性元件旁边放置，磁性微珠从下部开口27拉下，且有助于第二部分颗粒的生物颗粒和第一区段的更小(非磁性)微珠通过。因此，第二部分颗粒和第一区段的微珠被收集在第二容器3’中(图3b的步骤e)。

或者，柱2的下部开口27可以被密封，例如用适合下部开口的盖子。在这种情况下，通过过滤单元1的柱2的上部开口24施加缓冲液9，并且通过重复分配和抽吸将基质41悬浮在缓冲液中。这至少导致基质41的部分破坏。被捕获的生物颗粒因此释放到缓冲液中，并且微珠、颗粒和缓冲液在柱中形成悬浮液。然后将悬浮液吸出并转移到第二容器3’中(图3b的步骤e)。

原则上，可以重复悬浮和抽吸的过程，以便从过滤基质提取所有目标颗粒。

在图3b的步骤f中，将第二容器3′离心以使微珠421与包括第二部分颗粒的悬浮液814分离。例如，可将容器以200g离心5秒，由于密度和/或尺寸差异，可将微珠和颗粒完全分离。或者，可以借助于重力来实现颗粒和微珠的分离。由于密度和/或尺寸差异，微珠最终沉降在容器的底部，而颗粒保留在溶液中。此外，可以用密度比溶液中微珠部分轻的分离凝胶或矿物油预填充容器。这确保了没有颗粒被捕获在微珠沉淀中，从而提高了总体捕获效率。此外，由于形成了明显的分离线，使用分离凝胶或矿物油可以容易地抽吸颗粒。例如，这对于确保下游应用的纯度非常重要。

在将微珠从悬浮液中分离出来之后，可以将包含第二部分颗粒的悬浮液814转移到另一个容器3”中(图3b的步骤g)。该转移步骤可以手动进行或通过自动液体处理系统进行。在图3b的后续步骤h中，可以将悬浮液至少以100g离心1分钟以沉淀目标颗粒815。例如，容器可以包括减少的捕获部分36，在此处形成颗粒沉淀。这样的捕获部分可以促进溶液的完全去除，例如移液吸出(图3b的步骤i)。除去溶液后，可以将颗粒悬浮在另一缓冲液中(图3b的步骤j)。可以将颗粒悬浮在例如用于染色或免疫亲和测定的合适缓冲液中。因此，图3b的离心步骤h允许有效的缓冲液交换，简化了任何进一步的下游测定。或者，在步骤f之后，可以将第二部分颗粒直接转移至下游分析，例如显微镜分析，而无需转移至新容器、浓缩和缓冲液交换。

图3c示例了不同的下游过程。在通过形态成像或其他验证分析进行分析之前，可以对第二部分颗粒进行，例如染色(图3c的步骤k)、清洗(图3c的步骤l)，悬浮(图3c的步骤m)。这些测定允许对样本中的颗粒，例如CTC或CIC进行定量。

有利地，可以并行处理多个柱2和容器3，并且可以容易地将其集成在自动液体处理平台中。因此，处理量可以大大增加。此外，在根据本发明的方法期间可以将样品分裂。如上所述，包含第一部分颗粒的第一滤液可以被进一步处理，例如通过另外的分离方法或直接通过验证分析。另一方面，第二部分颗粒，例如包含在悬浮液814中的，可以被进一步处理，例如通过将悬浮液施加到另一柱，该柱包含第一区段或微珠基质，其间隙大于微珠基质41的第一区段411的间隙。例如，以18μm的临界尺寸有效过滤的第一部分可用于分离低于和高于此尺寸的颗粒。

图4a示出了根据本发明的优选实施方式的另一装置，其形式为具有柱2和容器3的过滤单元1。如以上针对图2a所述，过滤单元1(及其柱2和容器3)具有基本上圆柱形或矩形的形状。该装置只能包括柱2，在这种情况下，它可以适合于连接到架子或储罐上。过滤单元1的柱2和容器3的设计使其可以组装在一起，也可以与其他同类过滤单元1的任何其他组件组装在一起，例如，柱2可以依次与不同的容器3组装在一起。用于过滤单元1的合适材料包括：聚丙烯、聚乙烯、玻璃。过滤单元1可以通过注射成型形成。应当注意，在几个实施方式中，过滤单元1的各个部分不需要由相同的材料制成。

根据该实施方式，如图2a所示形成过滤单元的柱2、上部腔室21、一个或多个侧壁22、锚突起23、上开口24、移液通道连接件25、锥形部分29、结合到锥形部分29的细长通道26、下部开口27。细长通道26可包含过滤器元件4，如以上针对图2b和2c所述(见图4b)。

如针对图2a所述，过滤单元1的柱2可以一体成型，例如通过注塑成型，或者柱2可以包括主体和盖部分210。

盖部分210、其侧壁211、连接凹槽212、内壁213和狭槽214可以如图2a所述那样设置。

过滤单元1的容器3可以包括开口的上端，上部区段的下部可以通过其进入。容器3可包括容器腔室31、容器的一个或多个侧壁32、凸缘33、底壁35、一个或多个壁延伸部37，如图2a所述。

下部腔室31的底端34可以设置有具有上部391和下部392的居中突出39。居中突起39设置为穿过柱2的下部开口27装配入细长通道26中，藉此防止了位于细长通道26中的过滤基质进入容器腔室31。优选地，在细长通道的侧壁与突起的侧壁之间形成通道，该通道允许液体流过该通道并进入容器腔室。这样的通道可以具有例如10至40μm的宽度，优选地为约20μm。因此，虽然液体和较小的颗粒可以通过通道从柱中流入容器腔室，但是较大的颗粒，特别是大于该尺寸的微珠，稳定地置于柱中。

容器还可以包括盖，以允许安全运输容器3及从柱2接收其内容物以进行进一步处理，并降低容器3中的内容物丢失和/或污染的风险。

在优选实施方式中，柱和容器以可拆卸的方式设计，其中例如，柱2的减小的外表面小于容器3的内表面，从而当柱和容器连接在一起时施加摩擦力。当上部区段3与容器3连接时，柱2的减小的外表面、上部腔室21的锥形部分29和柱2的细长通道26被容纳在容器腔室31中。然后居中突起39可以装配到细长通道26中。

图4b示出了容器3，包括具有上部391和下部392的居中突起。在该实施方式中，上部的直径适合进入细长通道26(未示出)的下部开口27，而下部392的直径不适合进入细长通道的下部开口，但支撑下部开口的侧壁。下部392由此用作保持装置，确保突起39没有完全填充细长通道26。

图4c示出了柱2和容器3，其中柱2的细长通道26填充有微珠的基质41。微珠基质41包括一区段的微珠411，其充当过滤器。容器3的居中突起39用作约束装置，该约束装置防止第一区段的微珠穿过细长通道26的下部开口27。

图4d示出了根据本发明的柱2和容器3。尽管如图4a所示提供了柱2，包括上部腔室21、一个或多个侧壁22、锚突起23、上部开口24、移液通道连接件25、锥形部分29、细长通道26、下部开口27和盖部210、侧壁211、连接凹槽212、内壁213和狭槽214，容器3包括开放的上端(上部区段的下部可以通过该上端进入)、容器腔室31、容器的一个或多个侧壁32、凸缘33、底壁35、一个或多个壁延伸部37，如图4a所述，但是没有居中突起。这样的容器可用于不需要约束装置的处理步骤，或用于以其他形式提供约束装置的处理步骤，例如作为第二区段的微珠、插塞或多孔过滤器，定位于柱2的下部开口。容器3可以如图2所示设置。特别地，下部腔室31的底端34可以设置有形成锥形部分(即，当沿向下方向移动时，相对壁之间的距离或一个或多个连续侧壁的相对侧之间的距离变小)的一个或更多个底壁35。底端34还可在底壁35的下端上设置有减小的捕获部分36(未示出)。

图4e示出了包括根据图4d的柱2和容器的过滤单元1，其中柱2位于容器3的顶部。由于容器不包含突起，柱2的下部开口没有被容器阻塞，而不接触容器3的壁。

在图5a和b的示例方法中，应用根据图4a至e的过滤单元。如针对于图3a至图c所述，2ml全血可以用作用于检测循环肿瘤细胞、循环免疫细胞(CIC)和/或微栓子的样品液。在密度梯度离心之后，然后将包含RBC和重细胞的部分施加到包含在柱2中的微珠基质41上。微珠基质包含一区段大小均一的微珠。此区段充当过滤器。微珠的直径优选为约50μm，从而形成约7.7μm的有效空隙。用作约束装置的容器3的突起阻塞了柱的下部开口，从而将微珠部分保持在柱中。优选地，在细长通道的侧壁与突起的侧壁之间形成通道，该通道允许液体流过该通道并进入容器腔室。这样的通道，例如可以具有10至40μm的宽度，优选地为约20μm。因此，虽然液体和较小的颗粒可以流过通道从柱中流入容器腔室，但是较大的颗粒，特别是大于该尺寸的微珠稳定地置于柱中。通过容器的突起对柱的下部开口的有效密封还尤其促进了悬浮步骤，其中(在分离出第一部分颗粒之后)将第二部分颗粒和第一区段的微珠悬浮在缓冲液中。

可以通过将微珠悬浮液(例如，微珠在水中或在20％乙醇中)通过上部开口24连续移液到柱2中，将区段微珠填充到柱中。然后可以通过离心干燥该区段，用缓冲液如PBS清洗，之后施加生物样品，从而防止气泡形成。此外，通过离心获得致密的坚实的基质。可以通过相同的自动化液体处理系统完成填充。

在图5a的步骤a′中，将生物样品8(任选地在密度梯度离心之后被富集并且可能包含CTC、CIC和/或CTM)通过上部开口24施加到微珠基质41上，即，包含多个微珠的第一区段。生物样品8由此缓慢地进入微珠基质，并且大于微珠间隙直径的生物颗粒被保留在微珠基质的顶部。在图5a的步骤b′中，将可以是过滤单元1的一部分并且还可以放置在容器3上的柱2以5-20g离心2-5分钟，优选2-3分钟，具体取决于样品。因此，生物样品的第一部分颗粒可以穿过微珠基质，在下部开口处离开柱，并穿过在柱的细长通道的侧壁与容器的突起之间形成的通道。原则上，重力足以使第一部分颗粒通过该区段的微珠，但是，通过离心，可以显著减少该通过的时间。离心后，生物样品的流体812，例如生物颗粒富集期间使用的非目标颗粒或缓冲液，以及直径或大小低于10μm的临界大小(即微珠区段的间隙大小)的第一部分颗粒811已通过微珠基质41并收集在容器3中，而高于临界值的第二部分颗粒813则保留在微珠的有效空隙上方或内部。第二部分的这些颗粒的尺寸或直径大于10μm，因此被捕获在微珠的空隙中。

在图5a的步骤c′中，将容器3和柱2分开。包括低于临界值的第一部分颗粒811的容器3可以被取出或进一步处理，特别是通过根据本发明的方法，如针对图3a的步骤a′所述。

捕获在微珠基质41的空隙中的第二部分颗粒可以根据本发明的方法进一步处理。在图5a的步骤d’中，将包括微珠基质41和捕获的生物颗粒的过滤单元1的柱2转移到容器3’中，该容器3’中填充有缓冲液9，例如2毫升PBS。在这种情况下，容器3'不包括居中突起，而是形成为容纳柱的细长通道，使得当柱2定位在容器3'上时，细长通道的下部开口不会被容器3'的任何壁阻塞。当微珠基质基本上干燥时，尤其可以进行转移。将过滤单元1的柱2的下部开口27浸入容器3’中的缓冲液中(图5b，步骤e’)。

如图5b中的步骤f′所示，过滤基质和捕获的颗粒可以进入容器3′的容器腔中。此外，缓冲液可以通过下部开口27被吸入柱2中，并用移液通道重复分配以确保微珠基质41被破坏并通过下部开口离开柱。因此，第一区段的微珠和生物颗粒可以通过柱2的下部开口27进入容器3′的容器腔室31并形成悬浮液。

然后从容器中移出空柱(步骤g')。

步骤h′中样品的进一步处理以从样品中分离微珠，可以如以上针对图3b的步骤f所述实施。步骤i′中的样品处理以将分离的第二部分颗粒从微珠转移到新容器，可以如以上针对图3b的步骤g所述执行。在步骤j′中将第二部分颗粒集中在容器的底部，例如通过离心作用，可以如以上针对图3b的步骤h所述进行。步骤k’中除去上清液并将第二部分颗粒重新悬浮在适当的缓冲液中，可以如以上针对图3b的步骤i和j所述进行。最后，可以执行以上针对图3c所述的处理步骤k至m。或者，如以上针对图3b所解释的，在步骤f之后，可以将分离的第二部分颗粒直接转移到下游分析中，例如微观分析。

图6示出了本发明方法的一般工作流程。首先，提供包括至少第一区段微珠的柱。然后将生物样品施加到第一区段，并将样品中的颗粒彼此分离。第一部分颗粒通过过滤基质，并收集在流通物中。第二部分颗粒保留在第一区段的空隙中。可以通过重力或离心力实现分离。可以丢弃或收集第一部分颗粒。可以将收集的第一部分颗粒施加到其他柱上。第二部分颗粒悬浮在缓冲液中。可以例如通过重力或离心力来收集悬浮液。在下文中，例如通过重力或离心力将第二部分颗粒与第一区段的微珠分离。分离后，可以富集颗粒并进行分析。

根据本发明，自动液体处理系统可以执行如图6所示的工作流程。现代实验室设备包括例如用形成基质的微珠填充柱、用生物样品填充柱、将柱放置在架子或离心机中的装置，吸取液体样品的装置，离心装置等。因此，根据本发明，也可以提供存储在非暂时性计算机可读介质上的计算机程序，该计算机程序包含指令，当该指令由自动液体处理系统的一个或多个处理器执行时，该指令执行根据本文所述任何实施方式的方法。例如，这些指令可以遵循如图6所示的工作流程。

图7示出了可以利用根据本发明的方法的健康检查程序。第一步，从癌症患者中采集全血样品，并根据本发明的方法分离颗粒。通过成像分析分离的颗粒的细胞形态。如果检测到微栓子，则需进行进一步的测定，例如NAAT(核酸扩增技术)或CLIA(化学发光免疫测定)，以验证检测到的微栓子的转移潜力。

实施例

微珠的尺寸分布

为了量化市售微珠的尺寸分布，通过光学显微镜分析了平均直径为20μm和30μm的二氧化硅珠。如图8a和图8b所示，对几个成像的微珠(假设是完全圆形的微珠)进行图像分析，分别说明平均直径为20μm的珠的直径偏差约为1μm至2.4μm，平均直径分别为30μm的珠子，直径偏差最大可达4μm。

对血沉棕黄层的过滤性能

通过用由三层组成的微珠基质填充每柱来制备四根柱，每根柱都包括具有形成为支撑微珠的十字形的下部开口的细长通道。对于所有柱，底层由500μm大小的微珠形成，中间层由220μm大小的微珠形成。对于四柱，顶层的微珠尺寸分别为20μm(柱号W1031-20)、30μm(柱号W1031-30)、40μm(柱号W1031-40)和50μm(柱号W1031-50)，从而提供分别为3.1μm、4.6μm、6.2μm和7.7μm间隙尺寸。

血沉棕黄层通常是通过离心(约300g，持续15分钟)总共8ml的全血而制备的，所述全血已经使用抗凝剂例如EDTA收集，然后分成四个离心管。从四个试管中吸出总计840μl的血沉棕黄层，并合并在一起。取20μl样品，并用Sysmex XS-500i系统分析细胞含量(白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PTL))。将剩余的分离的血沉棕黄层样品分成四个200μl等分试样，然后将每个等分试样吸移到上述四个微珠基质柱中的一个上。将四根柱在不到20g的速度下离心2分钟，然后收集每个流出物，用Sysmex XS-500i系统进行分析。这些流通样品包含血沉棕黄层样品的第一部分颗粒。离心后，将200μl缓冲液(PBS)移液到每个微珠基质上，分配并吸取几次，以形成微珠和第二部分颗粒在缓冲液中的悬浮液。将悬浮液转移到四个新的容器中，并将该容器以50g离心3分钟，以将第二部分颗粒与微珠分离。从含有第二部分颗粒的上清液中取样，然后用Sysmex XS-500i系统进行分析。

通过Sysmex XS-500i分析获得的细胞浓度汇总在表3中。

表3：血沉棕黄层样品，第一次离心后的流出物(第一部分颗粒)以及第二次离心后的上清液(第二部分颗粒)的细胞浓度(白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PTL))。

从处理前后获得的细胞浓度可以看出，顶层包含20μm大小的微珠的柱(柱号W1031-20)成功保留白细胞和红细胞，同时很大程度滤出较小尺寸的血小板。包含较大微珠且有效间隙分别为4.6μm、6.2μm和7.7μm的柱(柱号W1031-30、W1031-40、W1031-50)未保留红细胞。另一方面，部分白细胞被30μm和40μm大小的微珠保留。考虑到所分析的细胞群体的平均大小，这些结果表明，顶层中微珠的平均直径决定了过滤过程的临界值。此外，数据表明，能够变形并挤过直径仅为3μm的毛细血管的RBC(例如，Jones等人，“循环系统中的测量科学”，Cell Mol Bioeng。2014；7(1)：1-14))仍保留在具有20微米大小、提供3.1微米空隙的微珠的微珠基质中。因此，方法也适合于富集通常易于变形的细胞。

为了进一步在Sysmex XS-500i分析工具中研究有关细胞大小的细胞分布，白细胞组被分解为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞。结果汇总在表4中。

表4：血沉棕黄层样品，第一次离心后的流出物(第一部分颗粒)和第二次离心后的上清液(第二部分颗粒)的细胞浓度(中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、单核细胞(MONO)、嗜碱性粒细胞(BASO))。

表4中的结果示出微珠基质相对于细胞群体的过滤效率的差异化。对于白细胞组中的所有细胞类型，过滤效率均不相同，但是对于具有30和40μm大小的微珠的柱而言，其过滤效率却有很大差异。用30μm大小的微珠保留83％中性粒细胞，单核细胞保留至96％，而仅分别保留66％和57％的淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。使用直径为40μm的微珠，这四种细胞类型的过滤效率为28％至62％。因此，可以通过选择特定直径的微珠从多种类组成的样品中特异性富集某些细胞。

如表3和4中所述，血沉棕黄层和分离的血细胞的样品也通过光学显微镜分析。对于该过程，将样品转移到新容器中，以80g离心5分钟，并弃去上清液。将沉淀的细胞重悬于50μl缓冲液(PBS)中，用罗曼诺夫斯基(Romanowsky)染料染色，然后将2μl的每个样品吸移到常规显微镜盖玻片上。图9a示出了血沉棕黄层样品的显微镜图像，其通过离心从全血样品中分离。此样本包含大小不一的细胞分布。图9b示出了在将血沉棕黄层样品施加到柱W1031-20上并离心分离后作为流出物获得的样品的显微镜图像。图9c示出在将捕获的细胞和柱W1031-20的微珠基质悬浮并离心后获得的样品的显微镜图像。与图9b相比，在图9c中观察到大量较大尺寸的细胞，从而定性地确认了表3的结果。图9d显示在施加血沉棕黄层样品至柱W1031-50上并离心后作为流出物获得的样品的显微镜图像。图9e示出在将捕获的细胞和柱W1031-50的微珠基质悬浮并离心后获得的样品的显微镜图像。比较图9d和图9e明显看出具有50μm大小的微珠的柱仅保留了一小部分细胞，而在流出物中发现大多数的细胞。对于被包含50μm大小微珠的基质所保留的细胞，对其大小进行进一步分析。图9f和9g分别示出了根据图9d和图9e的显微镜图像，除了放大倍率增加。分析包围细胞的直径(假设是完全圆形的细胞)，结果总结在下表5中。

表5：在流出物中获得的细胞(第一部分颗粒)和保留在微珠基质中的细胞(第二部分颗粒)的图像分析

基于这些数据，至少可以得出在保留部分中倾向于较大细胞的趋势。

对红细胞悬液的过滤性能

制备具有三层微珠基质的柱。顶层由直径为30μm的微珠组成，中间层由直径为220μm的微珠组成，底层由500μm大小的微珠组成。顶层的有效空隙直径为4.6μm。

将0.8％的红细胞(RBC)悬浮液添加到微珠基质上，然后将柱以小于20g的速度离心2分钟。离心后，将柱置于光学显微镜下以观察顶层(图10a，10b)。可以观察到凝集的RBC(3至10个细胞)被困在顶层的空隙中(用箭头标记示例性的点)。

重要的是，大小相对恒定的RBC和凝集的RBC可以用作参比阶梯，以便根据其他靶细胞，例如循环肿瘤细胞优化微珠基质。

Claims (36)

1.一种从生物样品分离颗粒的方法，包括以下步骤：

- 提供具有上部开口和下部开口的柱，

其中所述柱包括至少第一区段，其包含具有第一直径的第一多个基本上是无孔的微珠，其中通过定位于下部开口的约束装置将所述第一多个基本上是无孔的微珠保留在所述柱中，以防止所述第一多个基本上是无孔的微珠穿过下部开口，

其中所述约束装置包括下部的第二区段，其包含具有第二直径的第二多个微珠，其中所述第一直径小于第二直径；和/或所述约束装置包括可移动的插塞，所述约束装置的插塞由位于所述柱下方的容器提供，所述约束装置为所述容器的居中突起，并且位于所述柱的细长通道的下部开口处，其中所述突起的至少一部分装配入所述柱中；其中在细长通道的侧壁与容器的居中突起的侧壁之间形成通道，该通道具有允许生物样本的第一部分颗粒或液体流过该通道并进入容器腔室的宽度；

且其中所述第一区段提供相邻基本上是无孔的微珠之间的空隙，用作生物样品的过滤器；

- 将所述生物样品通过所述柱的上部开口施加在第一区段上；

- 将所述生物样品的第一部分颗粒与所述生物样品的第二部分颗粒进行分离；

其中所述生物样品的第一部分颗粒通过第一区段；且其中所述第一区段保留所述生物样品的第二部分颗粒，其中保留的第二部分颗粒在所述空隙内被捕获；

- 将所述生物样品的保留的第二部分颗粒和所述第一区段悬浮在缓冲液中以形成悬浮液；

- 将所述生物样品的悬浮的第二部分颗粒与悬浮的第一区段进行分离，

其中，第一直径在10nm到700μm的范围内。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过重力或通过应用离心力将所述生物样品的第一部分颗粒与所述生物样品的第二部分颗粒进行分离。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述生物样品的分离的第一部分颗粒收集在第一容器中。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过重力或通过应用离心力将所述悬浮的第二部分颗粒与所述悬浮的第一区段进行分离。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

浓缩所述生物样品的分离的第一或第二部分颗粒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用离心力浓缩所述生物样品的分离的第一或第二部分颗粒。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微珠基本上是不可压缩的。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一直径在50到600μm的范围内或者在50 nm至500 nm的范围内。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一直径在100至300 nm或1到20μm的范围内。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一区段是可悬浮的。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述居中突起至少包括上部和下部，其中所述上部装配入所述柱中，和其中所述下部支撑所述柱的下部开口的侧壁。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通道的宽度在10到40μm。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通道的宽度为20μm。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

- 通过抽吸悬浮液并将悬浮液转移到第二容器中将所述悬浮液收集在第二容器中；或

所述方法还包括以下步骤：

- 通过重力或通过应用离心力将所述悬浮液收集在第二容器中。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一区段和第二区段以堆叠的层的形式提供，第一区段处于顶层。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱包含多个区段，其中两个为第一区段和第二区段，其中每个区段包括具有特定直径的多个基本上是无孔的微珠，所述多个区段至少在微珠的特定直径上不同，其中第一区段的第一直径包括最小直径。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，以堆叠的层的形式提供所述多个区段，所述第一区段处于顶层，和其中从顶层到底层，所述多个区段的微珠的特定的直径逐渐增加。

18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述多个区段包含3到7个区段。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于分离循环肿瘤细胞，其中第一直径在80到200μm的范围内；

或所述方法用于分离循环微栓子，其中第一直径在200到600μm的范围内；

或所述方法用于分离细胞外囊泡，其中第一直径在50 nm到500 nm的范围内。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一直径在1到700μm的范围内。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一直径在20到700μm的范围内。

22.用于从生物样品分离颗粒的自动化液体处理系统，包括：

- 用于提供具有上部开口和下部开口的柱的装置，其中所述柱包括至少第一区段，其包括具有第一直径的第一多个基本上是无孔的微珠，其中通过定位于下部开口的约束装置将所述第一多个基本上是无孔的微珠保留在所述柱中以防止所述第一多个基本上是无孔的微珠穿过下部开口，

其中所述约束装置包括下部第二区段，其包含具有第二直径的第二多个微珠，其中所述第一直径小于第二直径；和/或所述约束装置包括可移动的插塞，所述约束装置的插塞由位于所述柱下方的容器提供，所述约束装置为所述容器的居中突起，并且位于所述柱的细长通道的下部开口处，其中所述突起的至少一部分装配入所述柱中；其中在细长通道的侧壁与容器的居中突起的侧壁之间形成通道，该通道具有允许生物样本的颗粒的第一部分或液体流过该通道并进入容器腔室的宽度；

其中所述第一区段提供相邻基本上是无孔的微珠之间的空隙，用作生物样品的过滤器；

- 用于将生物样品通过柱子的上部开口施加到第一区段的装置；

- 用于将生物样品的第一部分颗粒与生物样品的第二部分颗粒分开的装置，其中生物样品的第一部分颗粒穿过第一区段，并且其中第一区段保留生物样品的第二部分颗粒，其中保留的第二部分颗粒被捕获在空隙中；

- 用于将生物样品的保留的第二部分颗粒和第一区段悬浮在缓冲液中以形成悬浮液的装置；

- 用于将生物样品的悬浮的第二部分颗粒与悬浮的第一区段分离的装置，

其中，第一直径在10nm到700μm的范围内。

23.如权利要求22所述的自动化液体处理系统，其特征在于，第一直径在1μm到700μm的范围内。

24.如权利要求22所述的自动化液体处理系统，其特征在于，第一直径在50到600μm的范围内或者在50 nm至500 nm的范围内。

25.如权利要求22所述的自动化液体处理系统，其特征在于，第一直径在100至300 nm或1到20μm的范围内。

26.如权利要求22所述的自动化液体处理系统，其特征在于，第一直径在20至700μm的范围内。

27.一种装置(1)，包括柱(2)，还包括容器(3)，其中所述柱(2)适于在从生物样品分离颗粒的方法中使用，其中所述柱(2)包括：

- 上部腔室(21)，用于接收生物样品，且在其侧面由一个或多个侧柱壁(22)界定，延伸入其下端的锥形部分(29)；

- 从锥形部分(29)向下延伸到下部开口(27)的细长通道(26)；

其中，

- 所述细长通道(26)至少部分地被至少第一区段填充，该第一区段包括具有第一直径的第一多个基本上是无孔的微珠，其中通过定位于下部开口的约束装置将第一多个基本上是无孔的微珠保持在柱中以防止第一多个基本上是无孔的微珠穿过下部开口，

其中所述约束装置包括下部第二区段，其包含具有第二直径的第二多个微珠，其中所述第一直径小于第二直径；和/或所述约束装置包括可移动的插塞，

其中所述第一区段提供相邻基本上是无孔的微珠之间的空隙，用作生物样品的过滤器以便颗粒在空隙内被捕获；和

其中所述容器(3)包括用于容纳部分或全部生物样品的容器腔室(31)，并在其侧面由一个或多个侧容器壁(32)界定，其中所述容器布置成使得当柱(2)放在容器顶部时，柱(2)的细长通道(26)伸入容器腔室(31)内，

其中，所述约束装置的插塞由位于所述柱下方的容器提供，其中所述容器包含居中突起(39)作为约束装置，定位于所述柱(2)的细长通道(26)的下部开口(27)处，其中所述至少部分突起装配到所述柱(2)的细长通道(26)中；其中在细长通道的侧壁与容器的居中突起的侧壁之间形成通道，该通道具有允许生物样本的颗粒的第一部分或液体流过该通道并进入容器腔室的宽度；

其中，第一直径在10nm到700μm的范围内。

28.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述柱(2)还包括盖部分(210)，其包括上部开口(24)，通过该上部开口接收生物样本，以密封上部腔室(21)。

29.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述约束装置还包括保留第二区段的下部开口的十字形端部，或所述约束装置包括多孔过滤器。

30.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述居中突起至少包括上部(391)和下部(392)，其中所述上部(391)装配入所述柱的细长通道(26)中，和其中所述下部(392)支撑所述细长通道(26)的下部开口的侧壁。

31.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述通道的宽度在10到40μm。

32.如权利要求27所述的装置，其特征在于，所述通道的宽度为20μm。

33.如权利要求27所述的装置，其特征在于，第一直径在1μm到700μm的范围内。

34.如权利要求27所述的装置，其特征在于，第一直径在50到600μm的范围内或者在50nm至500 nm的范围内。

35.如权利要求27所述的装置，其特征在于，第一直径在100至300 nm或1到20μm的范围内。

36.如权利要求27所述的装置，其特征在于，第一直径在20至700μm的范围内。