CN113083024A - 一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用 - Google Patents
一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113083024A CN113083024A CN202110271459.5A CN202110271459A CN113083024A CN 113083024 A CN113083024 A CN 113083024A CN 202110271459 A CN202110271459 A CN 202110271459A CN 113083024 A CN113083024 A CN 113083024A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- storage tank
- supercritical
- solution
- affinity adsorption
- ultramicro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001914 filtration Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 58
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 claims description 2
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000000710 polymer precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 2
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 30
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 26
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 15
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,7-dichloro-3,6-dihydroxy-9h-xanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC(Cl)=C(O)C=C2OC2=CC(O)=C(Cl)C=C21 XDFNWJDGWJVGGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000007234 antiinflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000011506 response to oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/147—Microfiltration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D36/00—Filter circuits or combinations of filters with other separating devices
- B01D36/04—Combinations of filters with settling tanks
- B01D36/045—Combination of filters with centrifugal separation devices
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用。所述系统包括第一储存罐，第一蠕动泵，超临界过滤装置，第二储存罐，第二蠕动泵以及亲和吸附装置。所述方法包括将样本溶液预处理；外泌体的提取纯化并破碎外泌体，破碎外泌体溶液与非外泌体溶液混合，将置于第一储存罐；经超临界过滤装置过滤后的溶液经亲和吸附装置吸附洗脱后得超微因子溶液。制备的超微因子应用于超微因子相关的生物制品的制备。本发明可用于大规模超微因子的制备，可用于各种样本来源超微因子的提取，既可以去除样本中颗粒较大的非超微因子物质，又可最大程度的对其提取浓缩，适合大规模超微因子的生产制备。
Description
本发明涉及生物医学技术领域，一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用。
背景技术
超微因子是来源于植物，动物，微生物等活细胞分泌的，分子量小于5KD的活性成分。其来源非常广泛，包括组织液、培养液、体细胞、干细胞及经诱导分化的细胞等。根据来源可分为植物超微因子、微生物超微因子、干细胞超微因子、体液超微因子、组织液超微因子、体细胞超微因子等。
超微因子包含了细胞分泌的小分子多肽、脂肽、脂质、磷脂，microRNA及各种调控细胞代谢的因子等1000多种活性成分，可参与调控各种细胞的生物学功能。功能一，穿越生物屏障，超微因子的分子量小于5KD，能够穿越皮肤、生物膜(如血脑屏障等)及细胞屏障，深入组织及细胞核内部发挥生物功能。功能二，调节氧化应激反应，超微因子中含有谷胱甘肽等小分子抗氧化物质，可以清除体内自由基，提高SOD的活性，改善氧化与抗氧化失衡的状态。功能三，抗炎反应，超微因子能够调节免疫细胞(巨噬细胞、单核细胞、T细胞等)的活性，降低体内的炎症反应，防止炎症因子对细胞或组织的损伤。功能四，促进细胞的增殖与迁移，超微因子可通过调节各种细胞的代谢通路，增强细胞代谢，进而促进细胞的增殖与迁移。因此，超微因子可以应用在医美类产品，促进伤口愈合的敷料，缓解哮喘及急性呼吸窘迫症的喷雾及其他生物制品。
目前常用的超微因子提取方法主要是超滤法，但该方法只限于在实验室提取，不适合超微因子的大规模工业化的制备。因此，为了加速超微因子相关生物制品的转化，急须一种操作简单，样本处理量大、可重复好且适合大规模GMP级制备超微因子的方法。
发明内容
为此，本发明提供一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用，以解决现有技术中操作复杂、样本量小、重复性差，不能用于大规模GMP级制备超微因子的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明的第一方面提供的一种制备超微因子的超临界过滤亲和吸附系统，所述系统包括第一储存罐，第一蠕动泵，超临界过滤装置，第二储存罐，第二蠕动泵，亲和吸附装置；
其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与超临界过滤装置的入口相连；超临界过滤装置的出口与储存罐入口相连；过滤后的液体出口与第二储存罐的第一入口相连；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与亲和吸附系统相连；亲和吸附装置分别连接开关K2和开关K1，所述开关K2与第二储存罐的第二入口相连，所述开关K1与体系外相连。
进一步的，超临界过滤装置内置超临界过滤膜，膜孔径为1KD-10KD；亲和吸附装置内置亲和吸附膜。
根据本发明的第二方面提供的一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，所述方法包括：
步骤一，将样本溶液进行预处理；
步骤二，将预处理后的样本溶液进行外泌体的提取纯化，得到外泌体溶液和非外泌体溶液，将所得外泌体溶液进行破碎处理，得外泌体破碎溶液，将外泌体破碎溶液和非外泌体溶液混合后置于第一储存罐；
步骤三，第一储存罐的液体经第一蠕动泵过超临界过滤装置浓缩循环过滤后，小分子溶液进入第二储存罐内；
步骤四，打开开关K2，关闭开关K1，第二储存罐的液体经第二蠕动泵过亲和吸附装置，循环过滤至亲和过滤装置内亲和吸附膜饱和吸附后；关闭开关K2打开，打开开关K1，将第二储存罐的液体排出体系；
步骤五，关闭开关K1，打开开关K2，第二储存罐中加入洗脱液，经第二蠕动泵将洗脱液泵入亲和吸附装置，循环洗脱；即得超微因子溶液。
进一步的，所述超临界过滤装置内置超临界过滤膜，膜孔径为1KD-10KD；所述亲和吸附装置内置亲和吸附膜。
进一步的，所述样本溶液是来自植物、动物或人的体液和组织液，微生物培养液，植物、动物或人的体细胞、干细胞及经干细胞诱导分化的细胞的培养上清液。
进一步的，所述样本预处理的方法为将样本加入离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
进一步的，所述的外泌体提取纯化的方法为超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、切向流过滤法、双重切向流过滤法、免疫捕获法、亲和色谱法、微流控法或分子排阻法。
进一步的，所述外泌体溶液破碎处理的方法为超声法、挤出法、表面活性剂法或冻融法。
进一步的，所述的洗脱液包括：10-100mM KH2PO4、150-500mM NaCl和50-250mMMgCl2。
根据本发明的第三方面提供的上述方法制备的超微因子的应用，所述超微因子是由活细胞分泌的，分子量小于5KD的活性成分；所述超微因子应用于与超微因子相关的生物制品的制备中。
本发明具有如下优点：
本发明提供了一种超临界过滤亲和体系用于各种样本来源超微因子的提取，该体系分别对样本进行超临界过滤膜过滤和亲和树脂吸附浓缩，两种方法对超微因子的连续浓缩纯化，即可以去除样本中颗粒较大的非超微因子物质，又可以最大程度的对其提取浓缩，非常适合大规模的超微因子的生产制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为发明提供的超微因子制备流程图。
图2为发明提供的超临界过滤亲和系统制备超微因子的原理示意图，其中，1为第一储存罐，2为第二储存罐，3为第一蠕动泵，4为第二蠕动泵，5为超临界过滤装置，6为亲和吸附装置。
图3为本发明提供的一种切向流过滤膜纯化外泌体原理示意图，其中，(1)为切向流过滤膜F-1原理示意图，(2)为切向流过滤膜F-2原理示意图。
图4为本发明提供的一种双重切向流过滤体系的结构图，11为第一储存罐，12为第一蠕动泵，13为第一过滤装置，14为第二储存罐，15为第二过滤装置，16为第二蠕动泵。
图5为本发明提供的一种脐带间充质干细胞显微镜观察图。
图6为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白CD34的流式检测结果图。
图7为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白CD45的流式检测结果图。
图8为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白CD73的流式检测结果图。
图9为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白CD90的流式检测结果图。
图10为本发明提供的一种脐带间充质干细胞特异蛋白CD105的流式检测结果图。
图11为本发明提供的超微因子促进细胞的增殖实验检测结果图。
图12为本发明提供的Transwell实验原理示意图，(1)小鼠脑微血管内皮细胞，(2)脐带间充质干细胞，(3)超微因子。
图13为本发明提供的超微因子穿越血脑屏障实验结果图。
图14为本发明提供的超微因子调节氧化应激反应实验结果图。
图15为本发明提供的超微因子抑制炎症因子IL-1β实验结果图。
图16为本发明提供的超微因子抑制炎症因子TNF-a实验结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明提供的一种利用双重切向流过滤体系提取纯化外泌体的方法
本实施例的一种双重切向流过滤体系的结构图，见图4。
一.脐带间充质干细胞培养
1.脐带间充质干细胞的提取制备
从手术室采集新生儿脐带，用无菌PBS缓冲液将脐带冲洗干净，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将组织充分剪碎至1mm3大小的组织块。将组织块均匀铺于培养皿中，至于培养箱中培养1h(培养条件为5％CO2，37℃)。待组织块贴壁比较牢固时，加入适量的干细胞培养基，置于培养箱培养(培养条件为5％CO2，37℃)。待细胞贴壁情况良好后，轻轻吸去培养基，并用干细胞培养基轻轻漂洗一次，再加入10mL新鲜的干细胞培养基置于培养箱中培养(培养条件为5％CO2，37℃)。待培养皿中贴壁细胞铺满70％-85％时，用消化液(0.25％胰蛋白酶)消化，待细胞开始脱落飘起时，加入终止液终止消化，用移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心10min后弃上清，最后用10mL新鲜干细胞培养基重悬，所得细胞为原代脐带间充质干细胞(P0)，如图5所示，原代脐带间充质干细胞显微镜观察图。
2.脐带间充质干细胞的鉴定
获得原代干细胞P0后，加无菌PBS缓冲液调整细胞浓度至1×106/mL，取五份200μL细胞悬液，分别加入5μL荧光标记的单抗CD34、5μL荧光标记的单抗CD45、5μL荧光标记的单抗CD73、5μL荧光标记的单抗CD90、5μL荧光标记的单抗CD105混匀，室温下避光孵育20min，于流式细胞仪中检测，如图6、图7、图8、图9、图10所示，分别为脐带间充质干细胞特异蛋白CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的流式检测结果图。
3.脐带间充质干细胞的培养
将原代脐带间充质干细胞置于干细胞培养基中培养(培养条件为5％CO2、37℃)，待细胞贴壁铺满90％时，5000g离心10min收集细胞培养上清液，得脐带间充质干细胞溶液。
二、外泌体的提取及破碎
1.脐带间充质干细胞溶液预处理
将脐带间充质干细胞溶液加入离心管中，5000-12000g，离心5-50min，再用0.22-0.45μm滤膜过滤除菌，得预处理的外泌体样本溶液，放置4℃备用；
2.双重切向流过滤体系提取纯化外泌体，如图4所述结构图
(1)向第一储存罐11和第二储存罐14中加入无菌水，分别打开蠕动泵(12和16)，冲洗系统；
(2)向第一储存罐11中加入1L预处理的样本溶液，打开第一蠕动泵12使系统循环，预处理的样本溶液经设有切向流过滤膜F-1的第一过滤装置13浓缩过滤，其中，切向流过滤膜F-1原理如图3(1)所示，使含有外泌体的溶液进入第二储存罐14中；待第一储存罐11中的液体体积为最小运行体积时，加入500ml无菌的PBS缓冲液继续浓缩过滤至最小运行体积；
(3)待第二储存罐14中的液体体积超过300mL时，打开第二蠕动泵16使系统循环，含有外泌体的溶液经设有切向流过滤膜F-2的第二过滤装置15，浓缩过滤，其中，切向流过滤膜F-2原理如图3(2)所示，此时收集滤出系统的滤液为小分子非外泌体溶液，备用；
(4)待第二储存罐14中的液体体积为最小运行体积时，向第二储存罐14中加入500ml的PBS缓冲液，继续浓缩过滤至第二储存罐14中溶液为50mL，收集该溶液，即得到双重切向流过滤体系提取纯化的外泌体。
(5)50ml的外泌体溶液放置在烧杯中，将6mm的超声探头放入外泌体溶液中，设置功率400W，超声5秒/次，共70次，间隙5秒(总时间为10min)。外泌体进行超声破碎后，将外泌体破碎溶液与小分子非外泌体溶液混合得混合溶液备用。
实施例2超微因子的提取制备
本实施例如图1超微因子溶液制备流程图和如图2所示超微因子溶液制备结构图
(1)向第一储存罐1和第二储存罐2中加入无菌水，分别打开蠕动泵(3和4)，冲洗系统；
(2)向第一储存罐1中加入混合溶液，打开第一蠕动泵4使系统循环，混合样本溶液流经设有超临界过滤膜的超临界过滤膜装置中，使含有超微因子的溶液进入第二储存罐2中；待第一储存罐1中的液体体积为最小运行体积时，加入500ml无菌的PBS缓冲液继续浓缩过滤至最小运行体积；
(3)待第二储存罐2中的液体体积超过400mL时，闭合开关K2，断开K1，打开第二蠕动泵4使系统循环，含有超微因子的溶液流经装有亲和介质的亲和吸附装置6，其中，亲和介质可吸附超微因子，循环反应30min后，此时超微因子已全部吸附至亲和介质上，再断开开关K2，闭合K1，打开第二蠕动泵4，将滤液排出系统；
(4)待第二储存罐2中的滤液排出完毕后，向第二储存罐2中加入200ml洗脱液，闭合开关K2，断开K1，打开第二蠕动泵4使系统循环30min，使洗脱液流经亲和介质，将超微因子充分的洗脱下来并富集至第二储存罐2中，收集该溶液，即得到超临界过滤亲和系统提取浓缩的超微因子。
实施例3一种用于提取纯化超微因子方法的体系
所述一种用于超微因子提取的超临界过滤亲和吸附系统包括第一储存罐1、第二储存罐2、超临界过滤膜装置5、亲和吸附装置6、第一蠕动泵3、第二蠕动泵4、开关K1和开关K2；
其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与超临界过滤装置的入口相连；超临界过滤装置的出口与储存罐入口相连；过滤后的液体出口与第二储存罐的第一入口相连；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与亲和吸附系统相连；亲和吸附装置分别经开关K2与第二储存罐的第二入口相连，经开关K1与体系外相连。
所述超临界过滤装置内置超临界过滤膜，膜孔径为1KD-10KD；所述亲和吸附装置内置亲和吸附膜。
实验例1超微因子促进细胞的增殖
本实验采用MTT法检测超微因子的促进细胞增殖的效能。取脐带间充质干细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，分别取10μL的PBS缓冲液、脐带间充质干细胞培养上清液和超微因子加入培养的细胞中。培养3d后，每孔加MTT溶液(5mg/mL)20μL。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10min。用酶标仪在450nm处检测OD值，每组6个重复，取平均值。结果如图11所示，超微因子对细胞增殖起到了明显的促进作用，其对细胞增殖的效果明显高于对照组，说明超微因子具有较好的促进细胞的增殖的能力。
实验例2超微因子穿越血脑屏障
本实验利用Transwell系统模拟脑内的BBB，该装置如图12所示。首先在Transwell系统上层小室培养小鼠脑微血管内皮细胞，下层小室接种脐带间充质干细胞。将20uL的超微因子溶液加入到上层小室，培养12h，以等体积的PBS缓冲液和预处理后的脐带干细胞培养上清液作为阴性对照。最后用MTT法检测下层小室的脐带干细胞增殖情况。实验结果如图13所示，相比于对照组，加入超微因子的脐带间充质干细胞的增殖活性较强，表明超微因子已经穿过了BBB并进入脐带间充质干细胞，影响其生物活性。
实验例3超微因子调节氧化应激反应(ROS)
本实验采用Aβ42寡聚体处理小鼠小胶质细胞，此时，小胶质细胞内ROS水平会有明显的增加，再将10μL的超微因子溶液加入小胶质细胞中，以10μL的PBS缓冲液为和脐带间充质干细胞培养上清液为阴性对照，未经Aβ42寡聚体处理的小鼠小胶质细胞为阳性对照，再用DCFH-DA荧光探针孵育培养，最后用流式细胞仪检测小胶质细胞屮的ROS的含量。DCFH-DA可自由穿过细胞膜，并且在ROS的存在下，可被氧化为带有绿色荧光的DCFH，而DCFH对细胞膜不能自由出入，所以可以用其来判断细胞内的ROS的水平。实验结果如图14所示，用Aβ42寡聚体处理小鼠小胶质细胞，其胞内ROS水平显著增强。与对照组相比，经过超微因子处理后，其胞内ROS水平有明显降低，表明超微因子具有降低氧化应激的能力。
实验例4超微因子促进抗炎反应
Aβ42寡聚体诱导的小胶质细胞发生氧化应激的同时，还可以使小胶质细胞分泌大量的炎症因子，如IL-1β和TNF-a。本实验采用ELISA法检测不同条件下的小胶质细胞对炎症因子分泌的影响。
将小鼠小胶质细胞以1×105个/孔的密度接种于24孔板，培养24h后，更换培养基，再加入Aβ42寡聚体，同时加入10ul的超微因子溶液，以10μL的PBS缓冲液和脐带间充质干细胞培养上清液为阴性对照，未经Aβ42寡聚体处理的小鼠小胶质细胞为阳性对照，继续培养12h，收集培养上清液。根据ELISA试剂盒说明书的操作流程，检测培养上清中IL-1β和TNF-a的含量。
实验结果如图15和图16所示，Aβ42寡聚体诱导的小胶质细胞内的TNF-a和IL-1β含量分别为2.45ng/mL和0.33ng/mL，加入超微因子后，TNF-a和IL-1β含量明显降低，甚至接近了未经Aβ42寡聚体处理的水平，所以超微因子具有降低炎症因子的能力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于制备超微因子的超临界过滤亲和吸附系统，其特征在于，所述系统包括第一储存罐，第一蠕动泵，超临界过滤装置，第二储存罐，第二蠕动泵以及亲和吸附装置；
其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与超临界过滤装置的入口相连；超临界过滤装置的出口与储存罐入口相连；过滤后的液体出口与第二储存罐的第一入口相连；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与亲和吸附系统相连；
亲和吸附装置的出口分别设有开关K2和开关K1，所述开关K2与第二储存罐的第二入口相连，所述开关K1与体系外相连。
2.根据权利要求1所述一种用于制备超微因子的超临界过滤亲和吸附系统，其特征在于，超临界过滤装置内置超临界过滤膜，膜孔径为1KD-10KD；亲和吸附装置内置亲和吸附膜。
3.一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤一，将样本溶液进行预处理；
步骤二，将预处理后的样本溶液进行外泌体的提取纯化，得到外泌体溶液和非外泌体溶液，将所得外泌体溶液进行破碎处理，得外泌体破碎溶液，将外泌体破碎溶液和非外泌体溶液混合后置于第一储存罐；
步骤三，第一储存罐的液体经第一蠕动泵过超临界过滤装置浓缩循环过滤后，小分子溶液进入第二储存罐内；
步骤四，打开开关K2，关闭开关K1，第二储存罐的液体经第二蠕动泵过亲和吸附装置，循环过滤至亲和过滤装置内亲和吸附膜饱和吸附后；关闭开关K2打开，打开开关K1，将第二储存罐的液体排出体系；
步骤五，关闭开关K1，打开开关K2，第二储存罐中加入洗脱液，经第二蠕动泵将洗脱液泵入亲和吸附装置，循环洗脱；即得超微因子溶液。
4.根据权利要求3所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述超临界过滤装置内置超临界过滤膜，膜孔径为1KD-10KD；所述亲和吸附装置内置亲和吸附膜。
5.根据权利要求3所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述样本溶液是来自植物、动物或人的体液和组织液，微生物培养液，植物、动物或人的体细胞、干细胞及经干细胞诱导分化的细胞的培养上清液。
6.根据权利要求3所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述样本预处理的方法为将样本加入离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。
7.根据权利要求3所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述的外泌体提取纯化的方法为超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、切向流过滤法、双重切向流过滤法、免疫捕获法、亲和色谱法、微流控法或分子排阻法。
8.根据权利要求3所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述外泌体溶液破碎处理的方法为超声法、挤出法、表面活性剂法或冻融法。
9.根据权利要求3所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法，其特征在于，所述的洗脱液包括：10-100mM KH2PO4、150-500mM NaCl和50-250mM MgCl2。
10.一种权利要求3-9任一种所述一种应用超临界过滤亲和吸附系统制备超微因子的方法制备的超微因子，其特征在于，所述超微因子是由活细胞分泌的，分子量小于5KD的活性成分；所述超微因子应用于与超微因子相关的生物制品的制备中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110271459.5A CN113083024A (zh) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | 一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110271459.5A CN113083024A (zh) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | 一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113083024A true CN113083024A (zh) | 2021-07-09 |
Family
ID=76667538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110271459.5A Pending CN113083024A (zh) | 2021-03-12 | 2021-03-12 | 一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113083024A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1958793A (zh) * | 2006-11-23 | 2007-05-09 | 西安组织工程工程技术研究中心 | 一种天然细胞复合生长因子的制备方法 |
| CN102846474A (zh) * | 2011-07-01 | 2013-01-02 | 沈阳药科大学 | 一种制备具有内外水相梯度差囊泡的装置及方法 |
| CN108785779A (zh) * | 2018-09-12 | 2018-11-13 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种干细胞体外富集筛选系统和方法 |
| CN111257073A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-06-09 | 北京热景生物技术股份有限公司 | 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物 |
| CN111304049A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-06-19 | 华中科技大学 | 一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法 |
| US20200330922A1 (en) * | 2017-12-26 | 2020-10-22 | Limited Liability Company "Prostagnost" | Method and device for separating extracellular vesicles from biological liquids with the aid of cascade ultrafiltration |
| CN111808166A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-23 | 江南大学 | 一种多级分离纯化工艺制备的黄酒多肽及其应用 |
| CN111893093A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-11-06 | 沈阳三禾生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法 |
-
2021
- 2021-03-12 CN CN202110271459.5A patent/CN113083024A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1958793A (zh) * | 2006-11-23 | 2007-05-09 | 西安组织工程工程技术研究中心 | 一种天然细胞复合生长因子的制备方法 |
| CN102846474A (zh) * | 2011-07-01 | 2013-01-02 | 沈阳药科大学 | 一种制备具有内外水相梯度差囊泡的装置及方法 |
| US20200330922A1 (en) * | 2017-12-26 | 2020-10-22 | Limited Liability Company "Prostagnost" | Method and device for separating extracellular vesicles from biological liquids with the aid of cascade ultrafiltration |
| CN108785779A (zh) * | 2018-09-12 | 2018-11-13 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种干细胞体外富集筛选系统和方法 |
| CN111304049A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-06-19 | 华中科技大学 | 一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法 |
| CN111257073A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-06-09 | 北京热景生物技术股份有限公司 | 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物 |
| CN111808166A (zh) * | 2020-07-02 | 2020-10-23 | 江南大学 | 一种多级分离纯化工艺制备的黄酒多肽及其应用 |
| CN111893093A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-11-06 | 沈阳三禾生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞来源的超微因子的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101951055B1 (ko) | 조직 검체로부터 세포 및 세포가 풍부한 기질의 강화된 회수를 위한 방법 및 기구 | |
| CN109536440A (zh) | 外泌体的提取方法 | |
| CN107988153A (zh) | 人脐带血间充质干细胞源分离外泌体的方法和使用的试剂 | |
| WO2004018615A1 (ja) | フィブリン含有組成物 | |
| CN107080753A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞源外泌体的美容制剂 | |
| CN112899218A (zh) | 一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用 | |
| CN110812318B (zh) | 用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法 | |
| CN107006452A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞源外泌体冻干保存方法及其应用 | |
| CN113388575A (zh) | 一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法 | |
| CN112587720A (zh) | 一种cgf和脐带间充质干细胞外泌体混合物、制备及应用 | |
| CN112675203A (zh) | 一种细胞来源的外泌体在制备治疗哮喘和/或肺纤维化生物制剂中的应用 | |
| WO2011111386A1 (ja) | 細胞濃縮・回収方法及び細胞回収液 | |
| CN113425619A (zh) | 一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途 | |
| Ferroni et al. | Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells | |
| CN113083024A (zh) | 一种超临界过滤亲和吸附系统及其构建方法和超微因子制备方法及应用 | |
| CN106267425A (zh) | Aids免疫吸附治疗仪 | |
| CN113287603B (zh) | 一种生物样本保存液及其制备方法与应用 | |
| CN112029705B (zh) | 促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用 | |
| CN114058576A (zh) | 一种血小板裂解液及其制备方法和应用 | |
| CN106039448B (zh) | Aids细胞吸附治疗仪 | |
| CN106566802A (zh) | 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法 | |
| CN209048767U (zh) | 一种干细胞体外富集筛选系统 | |
| CN106267415B (zh) | 艾滋病净化治疗仪 | |
| CN111265550A (zh) | 一种修复损伤组织的干细胞因子脂质体及其制备方法 | |
| CN111349600A (zh) | 一种pbmc体外培养基及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210709 |