CN113425619A - 一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，包括以下步骤：步骤(1).MSC上清液制备；步骤(2).间充质干细胞分泌因子的纯化，包括过滤和浓缩，肝素亲和层析，肝素亲和层析洗脱峰5kD超滤或G‑25脱盐柱脱盐；步骤(3)纯化后的MSC分泌因子用于制备面膜。本发明采用肝素亲和层析介质，特异性吸附间充质干细胞(MSC)分泌因子，纯化MSC分泌物中具有刺激NIH 3T3细胞增殖作用的物质，潜在用于治疗难愈性创面修复和作为添加物加入到化妆品中，能够发挥修复受损的皮肤、消除皮肤皱纹、收缩毛孔、改善面色等作用。

Description

一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途
技术领域
本发明属于皮肤修复技术领域，具体为一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法和用途。
背景技术
人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell，MSC)是一类贴壁培养后呈成纤维细胞样形态(纺锤形和梭形)、可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的干细胞。其不但可以分化为人体多种细胞，包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肌腱细胞等；同时，MSC还可以诱导分化为肝细胞、胰岛β细胞、神经细胞等。人间充质干细胞可由多种人体组织(如骨髓、脐带、胎盘、脂肪、脐带血等)分离得到，也可以通过分化或转分化方式获得；不同来源的间充质干细胞在基因表达和分化能力方面存在差异。应用方面，已经证明MSC安全性很好，是临床应用最广泛的干细胞。
将干细胞外用治疗难愈性创面和皮肤损伤，可以大大降低间充质干细胞在体内的不可控性和致瘤几率，但是间充质干细胞在体外环境下有一定的存活时间，24h后细胞就会出现凋亡，影响了治疗效果，况且皮肤外表面环境极其不稳定，细胞很难长时间存活，死亡细胞又形成新的污染物，影响治疗效果。MSC分泌因子是间充质干细胞无血清培养基培养后收集到的培养液，其中含有大量的细胞分泌因子(蛋白质和多肽)包括巨噬细胞集落刺激因子-1(CSF-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、金属蛋白酶(MMP)、胰岛素样生长因子(IGFs)，血管内皮生长因子(VEGF)这些因子都具有促进细胞增殖的作用。所以它具有一些其它干细胞所没有的优势，即免疫调节、分泌多种生长因子以及主动迁移到体内损伤部位的能力。已经证明MSC能参与伤口愈合过程中的所有阶段，抑制局部免疫反应、分泌生长因子，促进新生血管和再上皮化，加速伤口闭合。MSC还可以促进成纤维细胞和角质形成细胞的迁移，并通过增加血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)的水平来促进血管生成。MSCs分泌可溶性因子诱导真皮成纤维细胞增殖、迁移和趋化，增加人真皮成纤维细胞的增殖和胶原合成。MSC亦通过增加再生表皮的再上皮化和厚度来改善与伤口愈合相关的指标。所以MSC分泌因子在治疗难愈性创面修复和作为添加物加入到化妆品中，能够发挥修复受损的皮肤、消除皮肤皱纹、收缩毛孔、改善面色等作用；在医疗整形美容行业有广阔的应用前景。
目前也有一些针对间充质干细胞上清液进行制备的方法，典型的案例是将收集到上清液进行超滤浓缩(例如3kD)后，然后添加一定的物质做成制剂或冻干；但是不能有效去除培养基中一些大分子物质，如外源性蛋白、糖类、培养基中不能透过3kD超滤膜的成分等杂质。仅用超滤技术处理脐带间充质干细胞培养上清存在一定的不足，要更好地纯化制备间充质干细胞分泌因子，就需要对间充质干细胞分泌因子的纯化制备提出新的解决方案。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，包括以下步骤：
步骤1 MSC上清液制备
步骤1.1华通氏胶分离：将捐赠且合格的脐带按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm3的组织匀浆块；洗涤组织匀浆块：收集末次上清：收集末次离心洗涤上清液，送检厌氧菌、需氧菌和真菌，样本保存液送检支原体；
步骤1.2接种：根据胶体重量确定培养瓶数，每瓶接种0.5～0.6g组织匀浆块；
步骤1.3传代：根据计数和活力结果，将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，平置培养瓶使细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面，待汇合率达到70～80％，收获细胞。P1代细胞经过全检后，如均符合质量标准的要求，作为种子细胞库，冻存；
步骤1.4 MSC体外扩增：按照需求量复苏种子库细胞，进行扩增培养；
步骤1.5收集MSC培养上清液：将收集的P1～P6代细胞所有的无血清培液在37℃水浴解冻后，合并得到MSC培养上清液15L；最后对收集的上清液进行无菌、支原体、内毒素检测；
步骤2间充质干细胞分泌因子的纯化
步骤2.1过滤和浓缩：解冻后的MSC培养上清液，先900×g离心15min，去除细胞碎片和残留的细胞；然后用0.45μm的中空纤维柱切向流过滤，去除上清液中的不溶性颗粒杂质；滤液再用5kd的超滤膜浓缩10～20倍，并用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液更换缓冲，备用；
步骤2.2肝素亲和层析：预装2.6×25cm的肝素亲和层析柱，先用纯化水洗脱10～20CV，去除肝素亲和层析介质中的保存液；平衡：(1)pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱10CV；(2)pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl平衡至pH和电导率与上柱前一致；上样：上述浓缩后的样本，按照RT时间20min速度上样；上样完毕后，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl洗脱10CV；再用pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱，收集洗脱峰；层析温度：4～30℃；pH7.0 20mM PB+2.0MNaCl洗脱峰用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐。
步骤2.3 5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐(1)5kD超滤脱盐：肝素亲和层析pH7.020mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液在5kD超滤膜上更换缓冲，保持缓冲液流入速度与超滤膜透过端的速度一致，截留端体积恒定不变，维持恒定的过膜压力；直到截留端溶液的pH值和电导率与流入缓冲液一致，停止超滤，收集截留端溶液，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用。(2)G-25脱盐：装填合适大小的G-25脱盐柱，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液平衡后，按照20％柱体积上样肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰，RT时间2～5min，上样结束后，用平衡缓冲液洗脱，收集OD280nm吸收峰部分，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用。上述得到的原液若长时间保存，保存于-80℃；
步骤3间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用。
所述步骤1.1中洗涤组织匀浆块是指用0.9％氯化钠注射液将剪切后的组织匀浆块定容，盖紧盖子后轻轻晃动离心管，使匀浆块悬浮在0.9％氯化钠注射液中，用800～900×g的离心力离心5min。
所述步骤1.2中接种是指根据胶体重量确定培养瓶数，每瓶接种0.5～0.6g组织匀浆块，按照T75瓶的接种体积，组织匀浆块中加入适量FACTOR-M-A完全培养基，平置培养瓶使组织匀浆块尽量均匀分布于整个底面，然后将T75培养瓶放置于CO2培养箱中，37.0±0.5℃，CO2浓度为5％，培养第5～6天进行全量换液，放置CO2培养箱继续培养；然后每3天进行一次换液，直到细胞汇合度达到70％～80％时，收获细胞。
所述步骤1.3中传代是指根据计数和活力结果，按照4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，并补充完全培养基需要的体积，在培养瓶上贴上条码，写上日期，平置培养瓶使细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面，将培养瓶水平放入37℃,5％CO2培养箱中培养，期间根据规程补加或置换培养基，细胞汇合度到70％～80％时，收获细胞，冻存培养基添加有10％的DMSO，调整细胞浓度至1×107/ml，用程序性降温仪冻存后保存在液氮罐中，该冻存的P1代细胞经过全检后，如均符合质量标准的要求，作为种子细胞库。
所述步骤1.4 MSC体外扩增是指将种子库细胞以活细胞4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，并采用无血清培养体系培养，当细胞生长至汇合度达到70～80％时，收集培养基上清液并保存于-80℃冰箱中；对P2代细胞进行传代，再以活细胞4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，当细胞生长至汇合度达到70～80％时，收集培养基上清液并保存于-80℃冰箱中，对P3代细胞进行传代，如此重复操作，细胞传代＜P8代细胞，每代收获的细胞都进行相关的形态、表型、活性检查。
所述步骤2.1过滤和浓缩是指解冻后的MSC培养上清液，先900×g离心15min，去除细胞碎片和残留的细胞；然后用0.45μm的中空纤维柱切向流过滤，去除上清液中的不溶性颗粒杂质；滤液再用5kd的超滤膜浓缩10～20倍，并用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液更换缓冲，备用。
所述步骤2.2肝素亲和层析是指预装2.6×25cm的肝素亲和层析柱，先用纯化水洗脱10～20CV，去除肝素亲和层析介质中的保存液；平衡：(1)pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱10CV；(2)pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl平衡至pH和电导率与上柱前一致；上样：上述浓缩后的样本，按照RT时间20min速度上样；上样完毕后，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl洗脱10CV；再用pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱，收集洗脱峰；层析温度：4～30℃；pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐。
(1)、上述亲和层析介质所用的配基为肝素，所述肝素为含有长短不一的酸性粘多糖，主要由硫酸-D-葡萄糖胺、硫酸-L-艾杜糖醛酸、硫酸-D-葡萄糖胺及D-葡萄糖醛酸中两种双糖单位交替连接而成，分子量为5000～30000的混合物。
(2)上述亲和层析介质所用的骨架材料为琼脂糖凝胶、葡聚糖，纤维素、聚苯乙烯聚合物、陶瓷等。
(3)上述亲和层析用缓冲液种类及pH范围包括：磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等，pH范围5～8。
(4)上述亲和层析用的盐种类及浓度包括：氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、高氯酸钠等中性盐,浓度范围为0～2.5mol/L。
(5)上述亲和层析用的条件为以上条件的组合，具体为层析介质种类、缓冲液及浓度、中性盐种类及浓度，还包括RT时间1～60min、层析温度4～30℃产生的组合。本文实例中选择的RT时间为20min，层析温度为室温。
所述步骤2.3中采用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐是指(1)5kD超滤脱盐：肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液在5kD超滤膜上更换缓冲，保持缓冲液流入速度与超滤膜透过端的速度一致，截留端体积恒定不变，维持恒定的过膜压力；直到截留端溶液的pH值和电导率与流入缓冲液一致，停止超滤，收集截留端溶液，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用。(2)G-25脱盐：装填合适大小的G-25脱盐柱，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液平衡后，按照20％柱体上样肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰，RT时间2～5min，上样结束后用平衡缓冲液洗脱，收集OD280nm吸收峰部分，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用。上述得到的原液若长时间保存，保存于-80℃。
所述步骤3中间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用是指包括以下重量份的原料：MSC分泌因子：1-1000微克/升1-3份、牛樟芝提取物：1-5份、植物多肽：0.1-1.0份、小麦胚芽：1-5份、小分子胶原蛋白：1-5份、医用透明质酸：0.1-1.0份、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物：2-10份、二裂酵母发酵产物溶胞物：3-10份、烟酰胺：0.1-1.0份、富勒烯：0.1-1.0份、神经酰胺：2-10份、寡肽-1：0.1-0.5份、寡肽-3：0.1-0.5份、丁二醇：2-10份、甘油：2-5份、水：10-100份。
所述步骤3中间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用是指包括以下重量份的原料：MSC分泌因子：1-1000微克/升1-3份、积雪草提取物：0.1-2.0份、葡萄籽提取物：0.1-2.0份、植物多肽：0.1-1.0份、小麦胚芽：1-5份、小分子胶原蛋白：1-5份、医用透明质酸：0.1-1.0份、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物：2-10份、二裂酵母发酵产物溶胞物：3-10份、烟酰胺：0.1-1.0份、富勒烯：0.1-1.0份、神经酰胺：2-10份、寡肽-1：0.1-0.5份、寡肽-3：0.1-0.5份、丁二醇：2-10份、甘油：2-5份、水：10-100份。
所述步骤3中间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用是指包括以下重量份的原料：MSC分泌因子：1-1000微克/升1-3份、绿茶多酚：0.1-2.0份、马齿苋提取物：0.1-2.0份、植物多肽：0.1-1.0份、小麦胚芽：1-5份、小分子胶原蛋白：1-5份、医用透明质酸：0.1-1.0份、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物：2-10份、二裂酵母发酵产物溶胞物：3-10份、烟酰胺：0.1-1.0份、富勒烯：0.1-1.0份、神经酰胺：2-10份、寡肽-1：0.1-0.5份、寡肽-3：0.1-0.5份、丁二醇：2-10份、甘油：2-5份、水：10-100份。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用肝素亲和层析介质能较好吸附多种生长因子的特性，采用肝素亲和层析纯化制备人脐带间充质干细胞培养上清液中的分泌因子，特异性吸附间充质干细胞(MSC)分泌因子，纯化MSC分泌物中具有刺激NIH 3T3细胞增殖作用的物质，潜在用于治疗难愈性创面修复和作为添加物加入到化妆品中，能够发挥修复受损的皮肤、消除皮肤皱纹、收缩毛孔、改善面色等作用。肝素亲和层析的制药行业得到广泛应用，用于纯化因子类蛋白，如凝血因子、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，而用于间充质干细胞(MSC)分泌因子的纯化未见报道。
综上所述本发明采用肝素亲和层析介质，特异性吸附间充质干细胞(MSC)分泌因子，纯化MSC分泌物中具有刺激NIH 3T3细胞增殖作用的物质，潜在用于治疗难愈性创面修复和作为添加物加入到化妆品中，能够发挥修复受损的皮肤、消除皮肤皱纹、收缩毛孔、改善面色等作用。
附图说明
图1为本发明的MSC显微镜观察形态图。
图2为本发明的MSC流式表型结果图。
具体实施方式
为了使本发明的实现技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面进一步阐述本发明。
一、制备方法
如图1、图2所示，一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，包括以下步骤：
本发明的脐带的来源：胎儿父母签署脐带捐赠者知情同意书，产前检查产妇的丙型肝炎病毒抗体、艾滋病毒I/II抗体、乙型肝炎病毒抗原、梅毒螺旋体抗体、甲型肝炎病毒抗体和巨细胞病毒IgM抗体。采集前有一次传染病筛查，时间不限；采集后再筛查一次，两次筛查时间间隔7周，且上述传染病检查结果均为阴性，保证脐带无病毒污染。家庭无遗传病史。脐带两端结扎，结扎后中间有效脐带长度≥25cm。
步骤1 MSC上清液制备
步骤1.1华通氏胶分离：将捐赠且合格的脐带按照规程的要求，在规定的运输条件及时间送达GMP级的制备中心，按照规程要求，剔除动脉和静脉血管，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm3的组织匀浆块；
洗涤组织匀浆块：用0.9％氯化钠注射液将剪切后的组织匀浆块定容，盖紧盖子后轻轻晃动离心管，使匀浆块悬浮在0.9％氯化钠注射液中，离心800～900×g的离心力离心5min；
收集末次上清：收集末次离心洗涤上清液(至少30ml)，送检厌氧菌、需氧菌和真菌检测，标本保存液送检支原体检测。
步骤1.2接种：根据胶体重量确定培养瓶数，每瓶接种0.5～0.6g组织匀浆块，按照T75瓶的接种体积，组织匀浆块中加入适量FACTOR-M-A完全培养基，平置培养瓶使组织匀浆块尽量均匀分布于整个底面，然后将T75培养瓶放置于CO2培养箱中，37.0±0.5℃，CO2浓度为5％，培养第5～6天进行全量换液，放置CO2培养箱继续培养；然后每3天进行一次换液，直到细胞汇合度达到70％～80％时，收获细胞。
步骤1.3传代：根据计数和活力结果，按照4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，并补充完全培养基需要的体积。在培养瓶上贴上条码，写上日期，平置培养瓶使细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面，将培养瓶水平放入37℃,5％CO2培养箱中培养，期间根据规程补加或置换培养基，细胞汇合度到70％～80％时，收获细胞。添加有10％的DMSO，调整细胞浓度至1×107/ml，用程序性降温仪冻存后保存在液氮罐中，该冻存的P1代细胞经过全检后，如均符合质量标准的要求，作为种子细胞库。
步骤1.4 MSC体外扩增：按照需求量复苏种子库细胞，进行扩增培养。将种子库细胞以活细胞4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，并采用无血清培养体系培养。当细胞生长至汇合度达到70～80％时，收集培养基上清液并保存于-80℃冰箱中。对细胞(P2代细胞)进行传代，再以活细胞4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，当细胞生长至汇合度达到70～80％时，收集培养基上清液并保存于-80℃冰箱中。对细胞(P3代细胞)进行传代，如此重复操作，细胞传代＜P8代细胞。每代收获的细胞都进行相关的形态、表型、活性等检查。
步骤1.5收集MSC培养上清液：将收集的P1～P6代细胞所有的无血清培液在37℃水浴解冻后，合并得到MSC培养上清液15L；最后对收集的上清液进行无菌、支原体、内毒素检测。
步骤2间充质干细胞分泌因子的纯化
步骤2.1过滤和浓缩：解冻后的MSC培养上清液，先900×g离心15min，去除细胞碎片，残留的细胞等；然后用0.45微米的中空纤维柱切向流过滤，去除上清液中的不溶性颗粒等杂质。滤液再用5kd的超滤膜浓缩10～20倍，并用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液更换缓冲，备用。
步骤2.2肝素亲和层析：预装2.6×25cm的肝素亲和层析柱，先用纯化水洗脱10～20CV，去除肝素亲和层析介质中的保存液；平衡：(1)pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱10CV；(2)pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl平衡至pH和电导率与上柱前一致；上样：上述浓缩后的样本，按照RT时间20min速度上样；上样完毕后，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl洗脱10CV；再用pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱，收集洗脱峰。层析温度：4～30℃；
步骤2.3 pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐
(1)5kD超滤脱盐：洗脱峰用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液，在5kD超滤膜上更换缓冲液，保持缓冲液流入速度与超滤膜透过端的速度一致，截留端体积恒定不变，维持恒定的过膜压力；直到截留端溶液的pH值和电导率与流入缓冲液一致，停止超滤，收集截留端溶液，0.22微米膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用。
(2)G-25脱盐：装填合适大小的G-25脱盐柱，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液平衡后，按照20％柱体上样，RT时间2～5min，上样结束后用平衡缓冲液洗脱，收集OD280nm吸收峰部分，0.22微米膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用。上述得到的原液若长时间保存，保存于-80℃。
二、实验结果
1.分泌蛋白浓度(蛋白浓度差)＝实验组蛋白浓度-阴性对照组蛋白浓度。因为阴性对照组为无血清培养基，含有大量氨基酸成分作为细胞生长的营养物质，所以自身有一定的OD值。细胞分泌的蛋白保留在无血清培养基中，要了解细胞分泌蛋白的含量，需要进行阴性值的剔除，将相同培养条件下的无血清培养基的数值减掉。本发明中实验组蛋白浓度即总蛋白浓度为557.45μg/ml，阴性对照组蛋白浓度即培养基蛋白浓度为510.03μg/ml，分泌蛋白浓度(蛋白浓度差)为二者之差，即47.42μg/ml，MSC上清液中得到的总分泌蛋白为749236μg。
2.由于收获的MSC上清液中含有培养基组分的氨基酸等小分子物质，在5kD超滤浓缩时，该类物质容易透过超滤膜，总蛋白回收率只有73.63％；同时，能够刺激3T3细胞增殖的因子一般为10kD以上的大分子，不能透过超滤膜，回收率达到97.2％。
3.肝素亲和层析时，由于树脂特异性吸附，绝大部分与肝素配基无特异性结合的蛋白全部流穿，总蛋白回收率降低至5.32％，只占总分泌蛋白的46％，说明MSC分泌蛋白中的一些成分也不能与肝素产生特异性结合；同时，活性回收率达91.3％，说明能够刺激3T3细胞增殖的大部分蛋白均能与肝素发生特异性吸附。
表1 MSC细胞检测结果
Figure BDA0003070759760000121
表2 MSC培养上清液检测结果
Figure BDA0003070759760000122
Figure BDA0003070759760000131
采用BCA法和NIH3T3细胞增殖法分别测定纯化前后MSC上清液中分泌因子浓度和生物学活性，其结果如下：
表3 MSC上清液中分泌因子浓度和生物学活性
Figure BDA0003070759760000132
安全性初步评价：
皮内反应试验：根据医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验(GB/T 16886.10——2005/ISO 10993-10:2002)相关要求，皮内注射纯化后的MSC分泌因子，对该样品产生刺激反应的潜在性作出评价；试验结果显示，分别给白化兔注射试验样品纯化后的MSC分泌因子和空白对照(生理盐水)后，观察24h、48h和72h，注射部位(样品，对照)均无红斑和水肿。根据评价结果中记分标准打分并计算，试验样品和对照平均记分之差小于1.0，说明该样品无潜在的刺激反应。
小鼠毒性试验：按照2020版《中国药典》四部附录1141方法，分别给5只小鼠腹腔注射0.5ml纯化后的MSC分泌因子，分别观察7天之后，无小鼠死亡，而且体重增加。符合试验要求。
豚鼠毒性试验：按照2020版《中国药典》四部附录1141方法，分别给2只豚鼠各注射纯化后的MSC分泌因子5.0ml，7天后，无死亡，而且无异常反应，体重增加。符合试验要求。
无菌、细菌内毒素根据《中国药典》四部附录方法检测，均符合要求。
间充质干细胞分泌因子化妆品(面膜)制备：
表4间充质干细胞分泌因子化妆品(面膜)制备配方1
Figure BDA0003070759760000141
Figure BDA0003070759760000151
Figure BDA0003070759760000161
表5间充质干细胞分泌因子化妆品(面膜)制备配方2
Figure BDA0003070759760000162
Figure BDA0003070759760000171
Figure BDA0003070759760000181
表6间充质干细胞分泌因子化妆品(面膜)制备配方3
Figure BDA0003070759760000182
Figure BDA0003070759760000191
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (11)

1.一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1 MSC上清液制备
步骤1.1华通氏胶分离：将捐赠且合格的脐带按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm3的组织匀浆块；洗涤组织匀浆块：收集末次上清：收集末次离心洗涤上清液，送检厌氧菌、需氧菌和真菌，样本保存液送检支原体；
步骤1.2接种：根据胶体重量确定培养瓶数，每瓶接种0.5～0.6g组织匀浆块；
步骤1.3传代：根据计数和活力结果，将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，平置培养瓶使细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面，待汇合率达到70～80％，收获细胞；P1代细胞经过全检后，如均符合质量标准的要求，作为种子细胞库，冻存；
步骤1.4 MSC体外扩增：按照需求量复苏种子库细胞，进行扩增培养；
步骤1.5收集MSC培养上清液：将收集的P1～P6代细胞所有的无血清培液在37℃水浴解冻后，合并得到MSC培养上清液15L；最后对收集的上清液进行无菌、支原体、内毒素检测；
步骤2间充质干细胞分泌因子的纯化
步骤2.1过滤和浓缩：解冻后的MSC培养上清液，先900×g离心15min，去除细胞碎片和残留的细胞；然后用0.45μm的中空纤维柱切向流过滤，去除上清液中的不溶性颗粒杂质；滤液再用5kd的超滤膜浓缩10～20倍，并用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液更换缓冲，备用；
步骤2.2肝素亲和层析：预装2.6×25cm的肝素亲和层析柱，先用纯化水洗脱10～20CV，去除肝素亲和层析介质中的保存液；平衡：(1)pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱10CV；(2)pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl平衡至pH和电导率与上柱前一致；上样：上述浓缩后的样本，按照RT时间20min速度上样；上样完毕后，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl洗脱10CV；再用pH7.020mM PB+2.0M NaCl洗脱，收集洗脱峰；层析温度：4～30℃；pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐；
步骤2.3 5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐(1)5kD超滤脱盐：肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液在5kD超滤膜上更换缓冲，保持缓冲液流入速度与超滤膜透过端的速度一致，截留端体积恒定不变，维持恒定的过膜压力；直到截留端溶液的pH值和电导率与流入缓冲液一致，停止超滤，收集截留端溶液，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用；(2)G-25脱盐：装填合适大小的G-25脱盐柱，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液平衡后，按照20％柱体积上样肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰，RT时间2～5min，上样结束后，用平衡缓冲液洗脱，收集OD280nm吸收峰部分，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用；上述得到的原液若长时间保存，保存于-80℃；
步骤3间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤1.1中洗涤组织匀浆块是指用0.9％氯化钠注射液将剪切后的组织匀浆块定容，盖紧盖子后轻轻晃动离心管，使匀浆块悬浮在0.9％氯化钠注射液中，用800～900×g的离心力离心5min。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤1.2中接种是指根据胶体重量确定培养瓶数，每瓶接种0.5～0.6g组织匀浆块，按照T75瓶的接种体积，组织匀浆块中加入适量FACTOR-M-A完全培养基，平置培养瓶使组织匀浆块尽量均匀分布于整个底面，然后将T75培养瓶放置于CO2培养箱中，37.0±0.5℃，CO2浓度为5％，培养第5～6天进行全量换液，放置CO2培养箱继续培养；然后每3天进行一次换液，直到细胞汇合度达到70％～80％时，收获细胞。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤1.3中传代是指根据计数和活力结果，按照4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，并补充完全培养基需要的体积，在培养瓶上贴上条码，写上日期，平置培养瓶使细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面，将培养瓶水平放入37℃,5％CO2培养箱中培养，期间根据规程补加或置换培养基，细胞汇合度到70％～80％时，收获细胞，冻存培养基添加有10％的DMSO，调整细胞浓度至1×107/ml，用程序性降温仪冻存后保存在液氮罐中，该冻存的P1代细胞经过全检后，如均符合质量标准的要求，作为种子细胞库。
5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤1.4MSC体外扩增是指将种子库细胞以活细胞4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，并采用无血清培养体系培养，当细胞生长至汇合度达到70～80％时，收集培养基上清液并保存于-80℃冰箱中；对P2代细胞进行传代，再以活细胞4～5×103/cm2的接种密度将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，当细胞生长至汇合度达到70～80％时，收集培养基上清液并保存于-80℃冰箱中，对P3代细胞进行传代，如此重复操作，细胞传代＜P8代细胞，每代收获的细胞都进行相关的形态、表型、活性检查。
6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤2.1过滤和浓缩是指解冻后的MSC培养上清液，先900×g离心15min，去除细胞碎片和残留的细胞；然后用0.45μm的中空纤维柱切向流过滤，去除上清液中的不溶性颗粒杂质；滤液再用5kd的超滤膜浓缩10～20倍，并用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液更换缓冲，备用。
7.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤2.2肝素亲和层析是指预装2.6×25cm的肝素亲和层析柱，先用纯化水洗脱10～20CV，去除肝素亲和层析介质中的保存液；平衡：(1)pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱10CV；(2)pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl平衡至pH和电导率与上柱前一致；上样：上述浓缩后的样本，按照RT时间20min速度上样；上样完毕后，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl洗脱10CV；再用pH7.020mM PB+2.0M NaCl洗脱，收集洗脱峰；层析温度：4～30℃；pH7.0 20mM PB+2.0MNaCl洗脱峰用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐；
(1)、上述亲和层析介质所用的配基为肝素，所述肝素为含有长短不一的酸性粘多糖，主要由硫酸-D-葡萄糖胺、硫酸-L-艾杜糖醛酸、硫酸-D-葡萄糖胺及D-葡萄糖醛酸中两种双糖单位交替连接而成，分子量为5000～30000的混合物；
(2)上述亲和层析介质所用的骨架材料为琼脂糖凝胶、葡聚糖，纤维素、聚苯乙烯聚合物、陶瓷；
(3)上述亲和层析用缓冲液种类及pH范围包括：磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液等，pH范围5～8；
(4)上述亲和层析用的盐种类及浓度包括：氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、高氯酸钠等中性盐,浓度范围为0～2.5mol/L；
(5)上述亲和层析用的条件为以上条件的组合，具体为层析介质种类、缓冲液及浓度、中性盐种类及浓度，还包括RT时间1～60min、层析温度4～30℃产生的组合。
8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤2.3中采用5kD超滤膜或G-25脱盐柱脱盐是指(1)5kD超滤脱盐：肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液在5kD超滤膜上更换缓冲，保持缓冲液流入速度与超滤膜透过端的速度一致，截留端体积恒定不变，维持恒定的过膜压力；直到截留端溶液的pH值和电导率与流入缓冲液一致，停止超滤，收集截留端溶液，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用；(2)G-25脱盐：装填合适大小的G-25脱盐柱，用pH7.0 20mM PB+0.15M NaCl缓冲液平衡后，按照20％柱体上样肝素亲和层析pH7.0 20mM PB+2.0M NaCl洗脱峰，RT时间2～5min，上样结束后用平衡缓冲液洗脱，收集OD280nm吸收峰部分，0.22μm膜过滤，得到纯化后的MSC分泌因子原液，2～8℃保存备用；上述得到的原液若长时间保存，保存于-80℃。
9.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤3中间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用是指包括以下重量份的原料：MSC分泌因子：1-1000微克/升1-3份、牛樟芝提取物：1-5份、植物多肽：0.1-1.0份、小麦胚芽：1-5份、小分子胶原蛋白：1-5份、医用透明质酸：0.1-1.0份、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物：2-10份、二裂酵母发酵产物溶胞物：3-10份、烟酰胺：0.1-1.0份、富勒烯：0.1-1.0份、神经酰胺：2-10份、寡肽-1：0.1-0.5份、寡肽-3：0.1-0.5份、丁二醇：2-10份、甘油：2-5份、水：10-100份。
10.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤3中间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用是指包括以下重量份的原料：MSC分泌因子：1-1000微克/升1-3份、积雪草提取物：0.1-2.0份、葡萄籽提取物：0.1-2.0份、植物多肽：0.1-1.0份、小麦胚芽：1-5份、小分子胶原蛋白：1-5份、医用透明质酸：0.1-1.0份、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物：2-10份、二裂酵母发酵产物溶胞物：3-10份、烟酰胺：0.1-1.0份、富勒烯：0.1-1.0份、神经酰胺：2-10份、寡肽-1：0.1-0.5份、寡肽-3：0.1-0.5份、丁二醇：2-10份、甘油：2-5份、水：10-100份。
11.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途，其特征在于，所述步骤3中间充质干细胞分泌因子在面膜中的应用是指包括以下重量份的原料：MSC分泌因子：1-1000微克/升1-3份、绿茶多酚：0.1-2.0份、马齿苋提取物：0.1-2.0份、植物多肽：0.1-1.0份、小麦胚芽：1-5份、小分子胶原蛋白：1-5份、医用透明质酸：0.1-1.0份、乳酸杆菌/藻提取物发酵产物：2-10份、二裂酵母发酵产物溶胞物：3-10份、烟酰胺：0.1-1.0份、富勒烯：0.1-1.0份、神经酰胺：2-10份、寡肽-1：0.1-0.5份、寡肽-3：0.1-0.5份、丁二醇：2-10份、甘油：2-5份、水：10-100份。
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