CN114948998A - 富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途 - Google Patents

富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114948998A
CN114948998A CN202210617933.XA CN202210617933A CN114948998A CN 114948998 A CN114948998 A CN 114948998A CN 202210617933 A CN202210617933 A CN 202210617933A CN 114948998 A CN114948998 A CN 114948998A
Authority
CN
China
Prior art keywords
biomedical
mesenchymal stem
polysaccharide
colloidal fluid
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210617933.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李建锐
阴知远
亓发芝
顾建英
纳扎雷娜·阿尔曼
波格丹·莱维塔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongshan Hospital Fudan University
Original Assignee
Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongshan Hospital Fudan University filed Critical Zhongshan Hospital Fudan University
Priority to CN202210617933.XA priority Critical patent/CN114948998A/zh
Priority to LU502428A priority patent/LU502428B1/de
Publication of CN114948998A publication Critical patent/CN114948998A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及一种富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途，包括以下步骤：S1、纯化脂肪细胞；S2、培养脂肪间充质干细胞(hASCs)；S3、收集传代前上清液；S4、制备复合型生物医用胶体液；干细胞复合因子浓缩液与羧甲基纤维素钠、果胶复合，形成创面湿性环境，用于促进创面肉芽组织增生和再上皮化，并且可以形成创面保护膜，阻断细菌感染创面，抑制细菌在创面的吸附，增殖，复制等过程，同时该生物医用胶体液流动性和延展性良好，适合患者身体各个部位的贴敷。

Description

富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液 及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于干细胞新用途技术领域，涉及一种富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途。
背景技术
人脂肪间充质干细胞(human adipose mesenchymal stem cells，hASC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。研究发现，人脂肪间充质干细胞可以用于治疗多种疾病，其在治疗方面的作用通常归因于它们的细胞因子分泌和免疫调节作用，而不是它们定向分化成目的细胞的能力。
人脂肪间充质干细胞条件培养基上清液中包含多种生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子和外泌体等，这些物质在促进细胞的增殖、迁移，分化中有显著效果，相比于直接应用干细胞，上清液具有易工业化制造、冷冻干燥、储存，包装和运输的特点。此外，上清液因不含细胞，故不存在免疫排斥问题，使用相对安全。
创面愈合是一个复杂的生物学过程，包括急性创面愈合和慢性创面愈合。研究显示，在急性创面中，生长因子在促进肉芽组织形成的同时，还可促进创面再上皮化，加快愈合速度。对于慢性难愈性创面的治疗，使用重组人血小板生长因子、成纤维细胞生长因子能显著促进创面的肉芽组织形成及再上皮化，对临床难愈性的糖尿病足溃疡，褥疮以及其他创面，局部应用已显示出明显的治疗效果。然而，应用高剂量单一因子治疗难愈性创面虽然能在一定程度上发挥治疗效果，但因调控机制单一，提纯工艺冗杂，且价格昂贵等导致临床应用受限。
针对生长因子治疗创面的传统实施方法是将其配成溶液喷洒于创面，其优势是生长因子能与修复组织快速而均匀地结合发挥作用，但由于溶液易流失和蒸发，在一定程度上限制了生长因子发挥作用的时效性和稳定性。
因此，开发一种富含人脂肪间充质干细胞培养基上清液来源的干细胞因子复合物，并采用更为优胜的赋形剂承载，为创面制造一个湿润的环境，使生长因子能够持续稳定的作用于创面组织，具有广阔的临床应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明为了解决上述现有技术对于急慢性创面的修复手段不良反应多，操作繁琐，应用受限的问题，提供一种富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液的制备方法，包括以下步骤：
S1、纯化脂肪细胞
收集人体脂肪样本，使用生理盐水对其进行清洗，然后加入等体积的胶原酶消化，消化后多次过滤离心，去上清液，得到纯化的脂肪细胞；
S2、培养脂肪间充质干细胞(hASCs)
在无血清无酚红的高辅酶培养基中添加5％血小板裂解物，重悬纯化的脂肪细胞后，将其转入细胞培养瓶进行培育，细胞接种密度为6万个/ml；在低氧条件下培养，促进细胞因子的分泌，将脂肪间充质干细胞培养至90±5％，收集P3代到P5代之间的培养上清液；
S3、收集传代前上清液
将传代前的上清液通过离心机进行高速离心，浓缩后制成细胞培养液，经直径0.22μm滤膜过滤除菌，最终获得干细胞复合因子浓缩液；
S4、制备复合型生物医用胶体液
将羧甲基纤维素钠、果胶按80～90：1的摩尔比混合，得到1mL水胶体凝胶，再将水胶体凝胶用生理盐水稀释至5～10倍体积，再加干细胞复合因子浓缩液(浓度为10～20ug/L)，得到复合物多糖生物医用胶体液。
进一步，步骤S1中胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶混合物，消化的时间为30～60min，胶原酶的浓度为0.1％～0.5％，将消化后的脂肪细胞用直径为70μm的滤膜过滤，再在2000rpm/min的条件下离心5～10min，去除上清液，然后将细胞沉淀物以PBS分散，同样的条件，再次过滤离心得到纯化的脂肪细胞。
进一步，步骤S2中无血清无酚红的高辅酶培养基是每1L添加有辅酶A 10mg～28mg、辅羧酶5mg～15mg、黄素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的间充质干细胞培养基；低氧培养条件为：24h内细胞的氧浓度为21％，24h～26h氧浓度由21％均匀降到18％，第27h的氧浓度为18％，第28～36h氧浓度由18％均匀降到8％，第37h的氧浓度为8％，第38h～44h氧浓度由8％均匀降到2％，后持续于2％的氧浓度下培养，二氧化碳浓度均为5％，其余为氮气。
进一步，步骤S2中收集提取脂肪间充质干细胞过程中培养获得的分泌物至少包括血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)和血小板源性生长因子(PDGF)。
人脂肪间充质干细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)和血小板源性生长因子(PDGF)，这些细胞因子主要的生物学活性是抗炎、抗凋亡、发挥免疫调节作用，强烈促进有丝分裂，参与干细胞诱导分化，组织细胞的生长、再生和重建，改善创伤部位组织功能，促进创面愈合。
血管内皮生长因子(VEGF)介于728.56±124.23pg/ml、角质细胞生长因子(KGF)介于623.46±136.78pg/ml、肝细胞生长因子(HGH)介于2501.11±18.36pg/ml、转化生长因子β(TGF-β)介于4223.23±220.36pg/ml、胰岛素样生长因子(IGF)介于1653.56±56.23pg/ml和血小板源性生长因子(PDGF)介于102.56±23.53pg/ml。
进一步，步骤S4中羧甲基纤维素钠为低粘度羧甲基纤维素钠、中粘度羧甲基纤维素钠和高粘度羧甲基纤维素钠按照1：1：1的摩尔比混合。
一种通过富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液制备方法制备的富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液，其融合了人脂肪间充质干细胞因子复合物和多糖生物医用胶体液。
一种富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液在治疗急、慢性创面中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明所公开的富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液，干细胞复合因子浓缩液作为治疗创伤的核心内容，能够有效迅速修复急、慢性创面，并且修复过程副作用低、见效快，填补了市面上直接促进急、慢性创面修复的外用药的空缺。且干细胞因子复合物浓缩液与羧甲基纤维素钠、果胶复合，形成创面湿性环境，用于细胞修复在创面形成保护膜，阻断细菌感染创面，抑制细菌在创面的吸附，增殖等过程，同时该生物医用胶体液流动性和延展性良好，适合患者身体各个部位的贴敷。
2、本发明所公开的富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液，干细胞复合因子浓缩液促进烫伤创面修复效果明显，使用7d后，创面表皮完整且厚，皮下胶原排列有序；毛囊、血管再生规律且较多。
3、本发明所公开的富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液，浓缩脂肪间充质干细胞培养上清液制剂来源于人，无种属问题；并且成品中不含活细胞成分，不存在伦理学或免疫安全问题，无需现用现配，应用方便。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为本发明富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液的制备方法的流程图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示的富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液的制备方法，包括以下步骤：
S1、纯化脂肪细胞；
收集人体脂肪样本，使用生理盐水对其进行清洗，然后加入等体积的胶原酶消化，消化后多次过滤离心，去上清液，得到纯化的脂肪细胞；胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶混合物，消化的时间为30～60min，胶原酶的浓度为0.1％～0.5％，将消化后的脂肪细胞用直径为70μm的滤膜过滤，再在2000rpm/min的条件下离心5～10min，去除上清液，然后将细胞沉淀物以PBS分散，同样的条件，再次过滤离心得到纯化的脂肪细胞。
S2、培养人脂肪间充质干细胞(hASCs)
在无血清无酚红的高辅酶培养基中添加5％血小板裂解物，重悬纯化的脂肪细胞后，将其转入细胞培养瓶进行培育，细胞接种密度为6万个/ml；无血清无酚红的高辅酶培养基是每1L添加有辅酶A 10mg～28mg、辅羧酶5mg～15mg、黄素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的间充质干细胞培养基；在低氧条件下培养，促进细胞因子的分泌，，将脂肪间充质干细胞培养至90±5％，收集P3代的培养上清液；低氧培养条件为：24h内细胞的氧浓度为21％，24h～26h氧浓度由21％均匀降到18％，第27h的氧浓度为18％，第28～36h氧浓度由18％均匀降到8％，第37h的氧浓度为8％，第38h～44h氧浓度由8％均匀降到2％，后持续于2％的氧浓度下培养，二氧化碳浓度均为5％，其余为氮气。
分泌物至少包括血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)和血小板源性生长因子(PDGF)。
人脂肪间充质干细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)和血小板源性生长因子(PDGF)，这些细胞因子主要的生物学活性是抗炎、抗凋亡、发挥免疫调节作用，显著促进有丝分裂，参与干细胞诱导分化，组织细胞的生长、再生和重建，改善创伤部位组织功能，促进创面愈合血管内皮生长因子(VEGF)介于728.56±124.23pg/ml、角质细胞生长因子(KGF)介于623.46±136.78pg/ml、肝细胞生长因子(HGH)介于2501.11±18.36pg/ml、转化生长因子β(TGF-β)介于4223.23±220.36pg/ml、胰岛素样生长因子(IGF)介于1653.56±56.23pg/ml和血小板源性生长因子(PDGF)介于102.56±23.53pg/ml。
S3、收集传代前上清液
将传代前的上清液通过离心机进行高速离心，浓缩后制成细胞培养液，经直径0.22μm滤膜过滤除菌，最终获得干细胞复合因子浓缩液；
S4、制备复合型生物医用胶体液
将羧甲基纤维素钠、果胶按80～90：1的摩尔比混合，得到1mL水胶体凝胶，再将水胶体凝胶用生理盐水稀释至5～10倍体积，添加10ug/L干细胞复合因子浓缩液，得到复合物多糖生物医用胶体液。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于，步骤S4中羧甲基纤维素钠为低粘度羧甲基纤维素钠、中粘度羧甲基纤维素钠和高粘度羧甲基纤维素钠按照1：1：1的摩尔比混合。
实施例3
实施例3与实施例2的区别在于，步骤S2中，收集的上清液为P4代的上清。
实施例4
实施例4与实施例2的区别在于，步骤S2中，收集的上清液为P5代的上清。
实施例5
实施例5与实施例2的区别在于，步骤S4中，干细胞复合因子浓缩液浓度为15ug/L。
实施例6
实施例6与实施例2的区别在于，步骤S4中，干细胞复合因子浓缩液浓度为20ug/L。
对比例
多糖生物医用胶体液按重量百分比包括：低粘度羧甲基纤维素钠0.3％，中粘度羧甲基纤维素钠1.2％，高粘度羧甲基纤维素钠0.4％，氯化钠0.9％，其余为注射用水。将氯化钠溶于注射用水，然后向水中加低、中、高粘度羧甲基纤维素钠开启恒温箱，在温度65℃下机械搅拌，直至低、中、高粘度羧甲基纤维素钠完全溶解，获得多糖生物医用胶体液。
采用上述实施例1～6所制得的成品对大鼠进行试验，试验方式如下：
1、建立大鼠急性创伤模型：取至少18只成年SD大鼠，分6个治疗组，每组3只。造模前12h褪去大鼠背部毛发，禁食，自由饮水。造模前进行腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，常规消毒大鼠背部褪毛区，于每只大鼠背部脊柱两侧各标记1个直径1.2cm的圆形区域(圆形标记间距≥1cm)，用无菌手术刀沿圆形标记切除全层皮肤，创口深至深筋膜。
2、治疗方法：大鼠背部左、右的伤口分别设置为治疗组、对照组。将1～6所制得的成品贴敷于相应组别大鼠皮肤创面上，创面形成后每隔2d用无菌生理盐水清洁创面，安尔碘消毒创面后更换新敷料。治疗过程观察创面组织修复情况，以及大鼠饮食行动等其它反应。
3、治疗效果检测
治疗结束后处死大鼠，取创面处皮肤全层及附带部分皮下组织送病理切片，每一份标本进行苏木精-伊红染色；
检测结果如下：
实施例1-6-大鼠表皮完整且厚，胶原排列有序；有毛囊，血管规律生长且较多；皮下胶原生成且排列整齐，效果较对比例好。
实施例1-6和对比例修复情况表，修复情况如表1所示，表1中的+代表修复程度，+越多，修复效果越好，-代表未有修复。
表1
表皮 胶原 炎性浸润 血管 毛囊
实施例1 +++ +++ - ++ ++
实施例2 ++++ ++++ - ++ ++
实施例3 ++++ +++ - ++ ++
实施例4 +++ +++ - + ++
实施例5 +++ +++ - ++ ++
实施例6 ++++ ++++ - ++ +++
对比例 + + + + +
注：“+”的多少代表治疗后组织修复的程度。
采用上述实施例1～6所制得的成品对大鼠进行试验，试验方式如下：
1、建立大鼠慢性难愈合创面模型
取至少21只成年SD大鼠，分为7组，对照组1组、慢性创面组6组，每组3只，造模前进行腹腔注射水合氯醛溶液麻醉。背部脱毛，用3.0cm×3.0cm的卡片在脱毛区用缝合线固定四周标记造模面积，准备一次性无菌切开包及其他物品，待麻醉生效后，用碘伏消毒3遍大鼠背部皮肤备皮处，沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，止血，形成大鼠全层皮肤缺损开放。
2、治疗方法：
造模后，即刻肌肉注射氢化可的松(80mg/kg)，连续注射7d，2ml实施例1～6所制得的成品敷于创面。自实验前1d起，肌注青霉素钾盐(4 000单位/只)，连续4d，以预防感染。创面隔日换药，常规冲洗及包扎。治疗过程观察创面组织修复情况，以及大鼠饮食行动等其它反应。
3、治疗效果检测
用透明膜描记和照像法记录创面大小，部分动物创面采用计算机图象分析系统进行处理、校定，以计算创面愈合速度与质量。另外，治疗结束后处死大鼠，取创面处皮肤全层及附带部分皮下组织送病理切片，每一份标本进行苏木精-伊红染色
检测结果如下：
实施例1-6大鼠创面红润，分泌物少，创缘形状不规则，收缩明显。
实施例1-6和对比例修复情况表，修复情况如表1所示，表1中的+代表修复程度，+越多，修复效果越好，-代表未有修复
表皮 胶原 炎性浸润 血管 毛囊
实施例1 ++++ ++ - ++ ++
实施例2 +++ +++ - +++ +
实施例3 ++++ +++ - ++ ++
实施例4 +++ +++ - + ++
实施例5 +++ +++ - ++ ++
实施例6 +++ ++++ - ++ ++
对比例 + + + + +
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、纯化脂肪细胞
收集人体脂肪样本，使用生理盐水对其进行清洗，然后加入等体积的胶原酶消化，消化后多次过滤离心，去上清液，得到纯化的脂肪细胞；
S2、培养脂肪间充质干细胞(hASCs)
在无血清无酚红的高辅酶培养基中添加5％血小板裂解物，重悬纯化的脂肪细胞后，将其转入细胞培养瓶进行培育，细胞接种密度为6万个/ml；在低氧条件下培养，促进细胞因子的分泌，将脂肪间充质干细胞培养至90±5％，收集P3代到P5代之间的培养上清液；
S3、收集传代前上清液
将传代前的上清液通过离心机进行高速离心，浓缩后制成细胞培养液，经直径0.22μm滤膜过滤除菌，最终获得干细胞复合因子浓缩液；
S4、制备复合型生物医用胶体液
将羧甲基纤维素钠、果胶按80～90：1的摩尔比混合，得到1mL水胶体凝胶，再将水胶体凝胶用生理盐水稀释至5～10倍体积，再加干细胞复合因子浓缩液(浓度为10ug-20ug/L)，得到复合物多糖生物医用胶体液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中胶原酶为I型胶原酶、Ⅱ型胶原酶混合酶，消化的时间为30～60min，胶原酶的浓度为0.1％～0.5％，将消化后的脂肪细胞用直径为70μm的滤膜过滤，再在2000rpm/min的条件下离心5～10min，去除上清液，然后将细胞沉淀物以PBS分散，同样的条件，再次过滤离心得到纯化的脂肪细胞。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中无血清无酚红的高辅酶培养基是每1L添加有辅酶A 10mg～28mg、辅羧酶5mg～15mg、黄素腺嘌呤二核苷酸4mg～12mg、尿苷酸磷酸0.5mg～2.5mg的间充质干细胞培养基；低氧培养条件为：24h内细胞的氧浓度为21％，24h～26h氧浓度由21％均匀降到18％，第27h的氧浓度为18％，第28～36h氧浓度由18％均匀降到8％，第37h的氧浓度为8％，第38h～44h氧浓度由8％均匀降到2％，后持续于2％的氧浓度下培养，二氧化碳浓度均为5％，其余为氮气。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中收集提取脂肪间充质干细胞过程中培养获得的分泌物至少包括血管内皮生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)和血小板源性生长因子(PDGF)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中羧甲基纤维素钠为低粘度羧甲基纤维素钠、中粘度羧甲基纤维素钠和高粘度羧甲基纤维素钠按照1：1：1的摩尔比混合。
6.采用如权利要求1～5任一所述富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液制备方法制备的富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液，其特征在于，融合了脂肪间充质干细胞因子复合物和多糖生物医用胶体液。
7.如权利要求6所述富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液在治疗急性和慢性创面中的应用。
CN202210617933.XA 2022-06-01 2022-06-01 富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途 Pending CN114948998A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210617933.XA CN114948998A (zh) 2022-06-01 2022-06-01 富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途
LU502428A LU502428B1 (de) 2022-06-01 2022-06-30 Polysaccharid Biomedizinisches Kolloid Flüssigkeit, die mit dem Faktorenkomplex menschlicher mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe angereichert ist, sowie ihre Herstellung und Verwendung

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210617933.XA CN114948998A (zh) 2022-06-01 2022-06-01 富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114948998A true CN114948998A (zh) 2022-08-30

Family

ID=82960428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210617933.XA Pending CN114948998A (zh) 2022-06-01 2022-06-01 富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114948998A (zh)
LU (1) LU502428B1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116687837A (zh) * 2023-07-14 2023-09-05 黑龙江八一农垦大学 一种促进创面愈合的干细胞制剂及其制备方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808415A (en) * 1986-02-04 1989-02-28 Crinos Industria Farmacobiologica Spa Composition for the extemporary preparation of formulations for topical applications for pharmaceutical and cosmetic use
CN102793926A (zh) * 2011-05-20 2012-11-28 日东电工株式会社 可食性胶状组合物、胶状制剂以及胶状制剂的制造方法
CN105126159A (zh) * 2015-09-11 2015-12-09 任汉学 一种多糖生物医用胶体液及其制备方法
CN105709270A (zh) * 2016-03-18 2016-06-29 中国科学院长春应用化学研究所 一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料
CN106701672A (zh) * 2017-01-10 2017-05-24 广东康仹生命科技有限公司 一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途
CN107224614A (zh) * 2017-05-11 2017-10-03 黎洪棉 一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用
CN107714727A (zh) * 2017-10-24 2018-02-23 成都远山博桥生物科技有限公司 一种浓缩脂肪干细胞培养上清制剂、其制备方法及应用
CN110540678A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 怡诺博(北京)生物医学技术有限公司 改性海藻酸钠水凝胶及其制备的细胞培养基质材料和应用
US20200086000A1 (en) * 2018-09-17 2020-03-19 Rejuvablast LLC Combination grafts for tissue repair or regeneration applications
CN113712996A (zh) * 2021-09-09 2021-11-30 江苏中衍生科细胞技术研究院有限公司 一种脂肪间充质干细胞因子复合物促进头发再生的方法
CN113957040A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 维他利肤(北京)生物科技有限公司 一种脂肪干细胞生长因子提取物及其制备方法和应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808415A (en) * 1986-02-04 1989-02-28 Crinos Industria Farmacobiologica Spa Composition for the extemporary preparation of formulations for topical applications for pharmaceutical and cosmetic use
CN102793926A (zh) * 2011-05-20 2012-11-28 日东电工株式会社 可食性胶状组合物、胶状制剂以及胶状制剂的制造方法
CN105126159A (zh) * 2015-09-11 2015-12-09 任汉学 一种多糖生物医用胶体液及其制备方法
CN105709270A (zh) * 2016-03-18 2016-06-29 中国科学院长春应用化学研究所 一种用于干细胞治疗的水凝胶敷料
CN106701672A (zh) * 2017-01-10 2017-05-24 广东康仹生命科技有限公司 一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途
CN107224614A (zh) * 2017-05-11 2017-10-03 黎洪棉 一种富含细胞因子的脂肪源性基质细胞复合移植材料的制备及其临床应用
CN107714727A (zh) * 2017-10-24 2018-02-23 成都远山博桥生物科技有限公司 一种浓缩脂肪干细胞培养上清制剂、其制备方法及应用
CN110540678A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 怡诺博(北京)生物医学技术有限公司 改性海藻酸钠水凝胶及其制备的细胞培养基质材料和应用
US20200086000A1 (en) * 2018-09-17 2020-03-19 Rejuvablast LLC Combination grafts for tissue repair or regeneration applications
CN113957040A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 维他利肤(北京)生物科技有限公司 一种脂肪干细胞生长因子提取物及其制备方法和应用
CN113712996A (zh) * 2021-09-09 2021-11-30 江苏中衍生科细胞技术研究院有限公司 一种脂肪间充质干细胞因子复合物促进头发再生的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRISTIANO RODRIGUES等: "New therapy of skin repair combining adipose-derived mesenchymal stem cells with sodium carboxymethylcellulose scaffold in a pre-clinical rat model", 《PLOS ONE .》, vol. 9, no. 5, pages 96241 *
刘晓玉等: "人脂肪间充质干细胞对皮肤创伤修复的作用", 《基础医学与临床》, vol. 33, no. 11, pages 1377 - 1381 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116687837A (zh) * 2023-07-14 2023-09-05 黑龙江八一农垦大学 一种促进创面愈合的干细胞制剂及其制备方法
CN116687837B (zh) * 2023-07-14 2024-04-05 黑龙江八一农垦大学 一种促进创面愈合的干细胞制剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
LU502428B1 (de) 2023-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230405180A1 (en) Mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or mesenchymal stem cell-hydrogel-undegradable support composition for skin regeneration or wound healing
CN106676065B (zh) 一种脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用
Lou et al. Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: current knowledge and future perspectives
CN108653327B (zh) 一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法
CN113509590B (zh) 外泌体联合透明质酸的伤口敷料及其制备方法和应用
CN109627315B (zh) 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
US20190290690A1 (en) Compositions comprising adjustable concentrations of growth factors derived from blood serum and clot hypoxia-conditioned medium and methods of their production
CN105797205A (zh) 干细胞培养上清凝胶及其制备方法
CN111808804A (zh) 一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法
CN112915264A (zh) 用于明胶-海藻酸钠-prp复合材料的制作方法
CN114948998A (zh) 富含人脂肪间充质干细胞因子复合物的多糖生物医用胶体液及其制备方法和用途
CN112111451A (zh) 提高干细胞细胞因子产量的方法
CN112587720A (zh) 一种cgf和脐带间充质干细胞外泌体混合物、制备及应用
CN113425619B (zh) 一种间充质干细胞分泌因子的纯化制备方法及用途
CN107236032B (zh) 一种从脐带组织中提取复合细胞因子的方法
CN112409456B (zh) 干细胞细胞因子在制备化妆品或药物中的用途
CN113842398A (zh) 一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用
CN113274410A (zh) 外泌体水凝胶复合物在制备修复皮肤瘢痕的药物中的应用
CN113957040A (zh) 一种脂肪干细胞生长因子提取物及其制备方法和应用
CN108653800A (zh) 含生物活性玻璃和/或精氨酸的创面修复敷料及其制备方法与应用
CN112691186A (zh) 包含间充质干细胞和外泌体的组合物及其组织修复中的应用
CN117384822B (zh) 一种大鼠牙龈组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用
CN116421710A (zh) 一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂
CN115120708A (zh) 一种用于治疗糖尿病足的干细胞凝胶
CN113957041A (zh) 人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination