CN116421710A - 一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白‑干细胞制剂；是将传代3‑5代的脂肪间充质干细胞置于胶原蛋白培养液中，于37℃、5％CO2培养至少5天；培养完成后得到胶原蛋白‑干细胞制剂；所述的胶原蛋白培养液是10％FBSα‑MEM培养液与胶原蛋白液以1：1体积比例混合，经超声至液态并灭菌而得。本发明提供促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白‑干细胞制剂，经皮肤愈合实验表明添加胶原蛋白的间充质干细胞可以缩短糖尿病犬的伤口愈合时间，促进犬类皮肤损伤的修复。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，涉及一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂。
背景技术
皮肤是保护机体免受外界病原体侵害的第一道屏障，并且具有调节体温、控制排泄和合成维生素D等必要功能。当皮肤的完整性遭到破坏时，创面即刻启动一系列复杂且高度协调的修复措施以促进损伤部位组织的愈合，在此期间创面容易受到多种因素干扰，导致伤口难以愈合，甚至丧失基本功能。创面的治疗需要特定的医疗技术，有些甚至需要长期治疗，这就构成了当代医学的一个巨大挑战。随着宠物市场的扩大，犬猫等宠物和人类皮肤伤口愈合问题愈加严重。
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)已经成为伴侣动物中常见的自发性复杂的代谢性内分泌疾病之一，有调研指出在犬和猫中患病率估计为0.26～1.33％。糖尿病所造成的伤口溃烂愈合难度高，易感染，这不仅可能延迟伤口愈合过程，还可能导致受影响患者的肢体截肢甚至更为严重的后果。使用不同的敷料，例如纱布、薄膜和组织工程皮肤替代物是目前的常规治疗方法，负压伤口治疗、自体皮肤移植物和高压氧伤口治疗也是有效的治疗手段。但是，这些方法有成本高、不能及时移除失活的组织和外科清创、氧中毒等限制性。为了规避传统方法的局限性，应用干细胞已成为一种很有前途的方法。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂，通过干细胞技术克服糖尿病宠物皮肤损伤愈合困难，促进糖尿病犬皮肤损伤修复。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂，是将传代3-5代的脂肪间充质干细胞置于胶原蛋白培养液中，于37℃、5％CO2培养至少5天；培养完成后得到胶原蛋白-干细胞制剂；
所述的胶原蛋白培养液是10％FBSα-MEM培养液与胶原蛋白液以1：1体积比例混合，经超声至液态并灭菌而得。
一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂的制备方法，包括以下操作：
1)用配置0.1M醋酸溶解胶原蛋白，室温搅拌至胶原蛋白完全溶解，得到胶原蛋白溶液；
2)取无菌玻璃瓶，在瓶底部铺上一层氯仿，将胶原蛋白溶液转移到氯仿上层，氯仿体积为胶原蛋白溶液的10％，不能震荡或搅拌；2-8℃静置过夜；无菌操作下将上层胶原蛋白溶液转移至无菌容器中，得到胶原蛋白原液；
3)将胶原蛋白原液的酸中和后，得到胶原蛋白液；
4)将10％FBSα-MEM培养液与胶原蛋白液以1：1体积比例混合，并超声至液态，得到胶原蛋白培养液；然后送去辐照灭菌；
5)将传代3-5代的脂肪间充质干细胞置于胶原蛋白培养液中，于37℃、5％CO2培养至少5天；培养完成后得到胶原蛋白-干细胞制剂。
所述的促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂在制备宠物皮肤创伤修复药物或制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂，是在犬脂肪间充质干细胞培养基中加入胶原蛋白，胶原蛋白保存了犬间充质干细胞的三维活性，可以有效地解决细胞转移过程中造成的细胞活性降低，建立了胶原蛋白与干细胞相结合的基础。
本发明提供促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂，经皮肤愈合实验表明添加胶原蛋白的间充质干细胞可以缩短糖尿病犬的伤口愈合时间，促进犬类皮肤损伤的修复。其中在HE染色中，在Col+ADSC组和ADSC组新形成的血管和毛囊较多，但在PBS组中较少，并且Col+ADSC组表皮的恢复效果更好。而在Masson染色中，PBS组蓝色部分的胶原纤维的量非常小。比较了Col+ADSC组、ADSC组和PBS胶原沉积部分进行颜色分析。Col+ADSC组的胶原沉积量高于ADSC组，胶原纤维的修复效果更好；添加胶原蛋白的间充质干细胞可以缩短伤口愈合时间，有效推进了糖尿病犬的伤口愈合进程。
附图说明
图1为胶原蛋白对间充质干细胞活力促进方面的测试结果；
图2为胶原蛋白-干细胞制剂对小鼠皮肤损伤修复促进效果测试结果；
图3为胶原蛋白-干细胞制剂对正常犬皮肤损伤修复促进效果测试结果；
图4为胶原蛋白-干细胞制剂对糖尿病犬皮肤损伤修复促进效果测试结果；
具体实施例
本发明在犬脂肪间充质干细胞培养基中加入胶原蛋白，胶原蛋白保存了犬间充质干细胞的三维活性，可以有效地解决细胞转移过程中造成的细胞活性降低。
胶原蛋白培养液制备过程如下：
1.配置0.1M醋酸(5.72ml+994.28ml蒸馏水)。
2.用0.1M醋酸溶液溶解胶原蛋白，配置1％(w/v)胶原蛋白原液。室温搅拌1-3h直至胶原蛋白完全溶液。
3.取无菌玻璃瓶，在瓶底部铺上一层氯仿，将胶原蛋白溶液转移到氯仿上层，氯仿体积为胶原蛋白溶液的10％，不能震荡或搅拌。2-8℃静置过夜。将上层胶原蛋白溶液转移至无菌容器中(无菌操作)，得到胶原蛋白原液。
4.向胶原蛋白原液加入其0.06倍体积的0.1mol/LNaOH中和，得到胶原蛋白液。
5.制备10％FBSα-MEM培养液
(1)将α-MEM基础培养基粉末置于经高压灭菌后的烧杯中，加入1000mL双蒸水，加入NaHCO32.2g,充分混匀用0.22μml滤器过滤后，保存于4℃冰箱。
(2)将FBS以10％的含量加入PBS溶液中得到10％胎牛血清，充分混匀后过滤分装2ml EP管中，2.0ml/支，保存于-20℃。
(3)α-MEM基础培养基96ml于100mL灭菌瓶内，加入10％胎牛血清2ml，NEAA及L-Glutamin和1％β-ME各1ml，置于磁力搅拌器上充分混匀后，用0.22μm滤器过滤，封口膜封口，4℃冰箱保存。
6.将10％FBSα-MEM培养液与胶原蛋白液以1：1体积比例混合，并超声至液态，得到胶原蛋白培养液；超声可以降低胶原蛋白培养液的粘稠度，让胶原蛋白原液与培养液更好结合；
然后送去辐照灭菌，以提供细胞所需的营养物质和离子环境。
7.将传代3-5代的脂肪间充质干细胞置于胶原蛋白培养液中，于37℃、5％CO2培养至少5天；培养完成后得到胶原蛋白-干细胞制剂
实施例1
1.取1岁雄性实验犬腹膜下脂肪和肠系膜脂肪进行细胞分离。待细胞长成80～90％细胞融合后，用TrypLE Express消化细胞，待细胞彼此分离时弃去胰蛋白酶，用培养液重悬细胞；
分离后将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中1:3传代培养，取3-5代细胞，得到犬脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)。
2.将ADSC细胞分别用普通α-MEM培养液和胶原蛋白培养液培养。
3.对培养五天之后的细胞做吉姆萨染色和EdU染色处理及细胞迁移实验，比较两种培养液对间充质干细胞凋亡、增殖的影响。
如图1的A-D所示，通过吉姆萨染色发现，在每毫升10μg胶原蛋白含量加入培养液，细胞数量最多，抗凋亡效果最佳，整体形态更加立体，呈现梭形。
将犬脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)分为NC与Col两组进行正常细胞培养，细胞培养至5天后，进行EdU染色；Col组细胞增殖效果最佳。
结果如图1的E-F所示，对于有无胶原蛋白培养的ADSC细胞进行细胞迁移实验，在2％血清浓度下，加入胶原蛋白的ADSC细胞在8h、20h迁移程度高于无胶原蛋白ADSC细胞，在32h接近长满。10％血清浓度下，两组细胞表现更为明显，迁移程度表现与2％血清浓度一致。
皮肤损伤愈合在炎症阶段，第一步是通过血小板脱粒和启动凝血级联形成血小板栓。驻留的外基质蛋白经成纤维细胞分泌，提供支架给炎症细胞迁移。在增殖期，创面愈合、肉芽组织的形成和血管的恢复是愈合过程的主要重点。此外，这种微环境中促血管生成因子的存在将促进新血管生成，促进氧气、营养物质以及干细胞和炎症细胞向伤口床的输送。重塑阶段通常在受伤后10天开始，可持续数月或数年。在重塑阶段，伤口的细胞成分在损伤部位消失，血管逐渐消退。此外，杂乱无章的II型胶原蛋白将逐渐被更有效的I型胶原蛋白取代。
下面给出本发明胶原蛋白-干细胞制剂的皮肤损伤愈合实验。
实施例2
在小鼠背面切除直径1.1厘米的圆形皮肤，进行小鼠皮肤损伤愈合自体实验和异体实验，分为PBS组、ADSC组、胶原蛋白+ADSC组(下面简称Col+ADSC组)。记录伤后愈合情况，如图2所示，胶原蛋白+ADSC组愈合效果最佳，表明胶原蛋白-干细胞制剂可以有效缩短小鼠皮肤愈合时间，促进伤口愈合。
实施例3
对正常犬腹部进行直径3厘米的圆形皮肤切除，进行犬皮肤损伤愈合实验，并记录皮肤愈合情况。各组伤口面积随时间推移而减小，PBS组愈合速度最慢，Col+ADSC组愈合最快，Col+ADSC组伤口在11d时基本愈合。HE和Masson对11天愈合的皮肤染色，结果表明添加胶原蛋白衍生的间充质干细胞可以缩短犬类伤口的愈合时间，促进犬类皮肤损伤的修复。
如图3所示，在HE染色中，在Col+ADSC组和ADSC组新形成的血管和毛囊较多，但在PBS组中较少，并且Col+ADSC组的表皮层恢复效果更好。在Masson染色中，PBS组蓝色部分的胶原纤维的量非常小。比较了Col+ADSC组、ADSC组和PBS胶原沉积部分进行颜色分析。Col+ADSC组的胶原沉积量略高于ADSC组，胶原纤维的修复效果更好。结果表明，胶原蛋白-干细胞制剂可以缩短正常狗的伤口愈合时间，促进皮肤损伤的修复。
实施例4
对糖尿病犬的腹部进行了四次同一区域的圆形皮肤切除术，进行犬皮肤损伤愈合实验，并记录皮肤愈合情况。各组伤口面积随时间推移而减小，PBS组愈合速度最慢，Col+ADSC组愈合最快，Col+ADSC组伤口在13d时基本愈合。13天后对愈合的皮肤进行HE和Masson染色，如图4所示。
结果表明，添加胶原蛋白的间充质干细胞可以缩短糖尿病犬的伤口愈合时间，促进犬类皮肤损伤的修复。在HE染色中，在Col+ADSC组和ADSC组新形成的血管和毛囊较多，但在PBS组中较少，并且Col+ADSC组表皮的恢复效果更好。在Masson染色中，PBS组蓝色部分的胶原纤维的量非常小。比较了Col+ADSC组、ADSC组和PBS胶原沉积部分进行颜色分析。Col+ADSC组的胶原沉积量略高于ADSC组。胶原纤维的修复效果更好。结果表明，添加胶原蛋白的间充质干细胞可以缩短伤口愈合时间。
对比实施例3与实施例4，正常犬于11天时几乎伤口完全愈合，糖尿病犬于13天时伤口仍处于愈合期，期间出现感染现象；而通过Col+ADSC组，有效推进了糖尿病犬的伤口愈合进程。
因此，提出本发明的促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂在制备宠物皮肤创伤修复药物或制剂中的应用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂，其特征在于，是将传代3-5代的脂肪间充质干细胞置于胶原蛋白培养液中，于37℃、5％CO2培养至少5天；培养完成后得到胶原蛋白-干细胞制剂；
所述的胶原蛋白培养液是10％FBSα-MEM培养液与胶原蛋白液以1：1体积比例混合，经超声至液态并灭菌而得。
2.一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下操作：
1)用配置0.1M醋酸溶解胶原蛋白，室温搅拌至胶原蛋白完全溶解，得到胶原蛋白溶液；
2)取无菌玻璃瓶，在瓶底部铺上一层氯仿，将胶原蛋白溶液转移到氯仿上层，氯仿体积为胶原蛋白溶液的10％，不能震荡或搅拌；2-8℃静置过夜；无菌操作下将上层胶原蛋白溶液转移至无菌容器中，得到胶原蛋白原液；
3)将胶原蛋白原液的酸中和后，得到胶原蛋白液；
4)将10％FBSα-MEM培养液与胶原蛋白液以1：1体积比例混合，并超声至液态，得到胶原蛋白培养液；然后送去辐照灭菌；
5)将传代3-5代的脂肪间充质干细胞置于胶原蛋白培养液中，于37℃、5％CO2培养至少5天；培养完成后得到胶原蛋白-干细胞制剂。
3.权利要求1所述的促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂在制备宠物皮肤创伤修复药物或制剂中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202310336773.6A CN116421710A (zh) | 2023-03-31 | 2023-03-31 | 一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310336773.6A CN116421710A (zh) | 2023-03-31 | 2023-03-31 | 一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN116421710A true CN116421710A (zh) | 2023-07-14 |
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ID=87090096
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| CN202310336773.6A Pending CN116421710A (zh) | 2023-03-31 | 2023-03-31 | 一种促进糖尿病宠物皮肤创伤修复的胶原蛋白-干细胞制剂 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN117363568A (zh) * | 2023-12-04 | 2024-01-09 | 山东大学 | 一种脂肪间充质干细胞外泌体及其制备方法与应用 |
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2023
- 2023-03-31 CN CN202310336773.6A patent/CN116421710A/zh active Pending
Cited By (2)
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| CN117363568B (zh) * | 2023-12-04 | 2024-04-09 | 山东大学 | 一种脂肪间充质干细胞外泌体及其制备方法与应用 |
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