CN109929800A - 一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人源脐带间充质干细胞达80‑90%时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。本发明制得的干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共培养，刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加，有助于皮肤创面伤口的修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说，它涉及一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法。
背景技术
创面愈合是一个错综复杂的生物学过程，该过程通过细胞因子的高度协调介导细胞与细胞间或细胞与基质间的相互作用来修复受损组织。细胞因子的协调不良或功能障碍均可导致创面愈合“失控”，在临床上表现为创面难愈。难愈性创面常见于深度烧伤等疾病。
造成创面难愈的主要原因可分为两大类：一类是由病菌感染引起的创面难愈。这类创面难愈通常伴随免疫细胞的异常激活。由于树突状细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞的持续激活，释放大量炎性因子、活性氧簇和蛋白水解酶，使创面局部处于长期过度的炎症反应阶段，从而导致肉芽组织和表皮组织长期无法形成。另一类是由局部缺血缺氧导致的创面难愈。创面局部血供不足引起营养成分及氧气供给的减少，造成胶原蛋白无法有效合成，同时基质金属蛋白酶的异常激活进一步导致大量细胞生长因子的降解，影响了创面局部成纤维细胞、表皮细胞和角质细胞的增殖和迁移能力，导致创面长期不愈合。
现阶段难愈性创面的治疗原则首先是局部治疗服从全身治疗；其次创面的外科处理是局部治疗的前提和基础，如局部清创和抗感染等；最后采用某些措施和方法来促进难愈性创面愈合。近年来促进难愈性创面愈合的方法很多，经典的方法主要包括新型敷料类、基因工程药物(生长因子)类、传统医药类以及组织工程类。存在的主要问题是抗感染差、血管化延迟、制备技术复杂、生产周期长，价格昂贵以及组织工程皮肤存在生理缺陷等。
干细胞疗法作为新型的治疗方式，其应用已涉及生长发育、创面愈合和组织工程等多个方面，其可能的作用机制如下：a.分化作用：干细胞作为新兴的种子细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，移植干细胞能自我更新并可分化成多种细胞，对组织进行修复；b.旁分泌作用：干细胞能够分泌大量细胞因子，以间充质干细胞为例，其分泌因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，挽救濒临凋亡的细胞，从而达到修复组织的目的。
随着对干细胞研究的不断深入，研究者发现移植干细胞分化成组织细胞的几率很低且移植后存活时间很短。由于移植到患者体内的干细胞存活时间短暂的问题影响了其旁分泌作用的发挥。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其制得的干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共培养，刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加，有助于皮肤创面伤口的修复。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人源脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子；其中，e＝3、4、5、6、7、8、9、10。
进一步，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
进一步，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
进一步，所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。
进一步，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。
进一步，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
进一步，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得Pm+1代人源脐带间充质干细胞。
进一步，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
进一步，所述人源脐带间充质干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。
进一步，所述细胞培养瓶为T-175细胞培养瓶。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明制得的干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共培养，刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加，有助于皮肤创面伤口的修复。
第二、经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后再经过传代培养的人源脐带间充质干细胞仍然具有良好的增殖能力，从其培养基中所获取和纯化的干细胞分泌因子中的蛋白质浓度以及细胞因子VEGF、IL-8、MCP-1仍然具有较高的浓度，进而仍然可以增高人原代真皮成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2。
干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P3代人源脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。
实施例2
一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4、5。
干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P6代人源脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。
实施例3
一种促进人源脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导方法，包括如下步骤：包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4。
干细胞的冻存步骤包括待P5代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P5代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P5代人源脐带间充质干细胞浓度为1×107个/mL，将P5代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P5代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P5代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P5代人源脐带间充质干细胞悬液，将P5代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得P6代人源脐带间充质干细胞。
干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P6代人源脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。
实施例4
一种促进人源脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导方法，包括如下步骤：包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8。
干细胞的冻存步骤包括待P9代人源脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P9代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P9代人源脐带间充质干细胞浓度为1×107个/mL，将P9代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P9代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P9代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P9代人源脐带间充质干细胞悬液，将P9代人源脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得P10代人源脐带间充质干细胞。
干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P10代人源脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子。
测定实施例1-4所得到的干细胞分泌因子中的蛋白质浓度以及细胞因子的浓度，测定结果见表1。
利用BCA法对干细胞分泌因子中的蛋白进行测定。将其稀释5倍后，取25uL测定其吸光度，根据测得的标准曲线得出公式算出相应的蛋白量，经计算得出干细胞分泌因子中蛋白浓度。
利用ELISA试剂盒测定干细胞分泌因子中细胞因子VEGF、IL-8、MCP-1的浓度。VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子，它能引起血管通透性增加、细胞外基质成分改变，诱导新生血管的形成和肉芽组织形成；IL-8通过增加角质形成细胞迁移和增殖促进皮肤再上皮化；MCP-1促进皮肤伤口愈合作为免疫系统特别是巨噬细胞的化学引诱物。
实施例1-4提供的干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共培养：人原代真皮成纤维细胞以22000个/cm2的密度接种于六孔板的六孔中，六孔板为五个，五个六孔板中分别加入实施例1-4提供的干细胞分泌因子(实验组)以及不加血清的基础培养基(对照组)，每隔一天更换一次实施例1-4提供的干细胞分泌因子或者不加血清的基础培养基，共培养六天后结束培养，提取总蛋白测定人原代真皮成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达量。
人原代真皮成纤维细胞中蛋白的提取：取出培养人原代真皮成纤维细胞的六孔板进行处理，弃掉实施例1-4提供的干细胞分泌因子或者不加血清的基础培养基，并用PBS清洗2次。每孔加入100uL的RIPA裂解液和1uL的PMSF混合液，4℃裂解30min。将六孔板中的液体移入EP管中，4℃条件下12000r/min离心20分钟。吸取上清液-20℃储存备用。
测定人原代真皮成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达量：干细胞分泌因子与人原代真皮成纤维细胞共培养后，通过western bloting实验操作技术比较其与对照组中Ⅰ型胶原纤维表达量的差别，蛋白条带图用ImageJ软件进行灰度值分析取值，数据分析有统计学差异(P<0.005)，测定结果见表2。
表2
| 测定项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对照组 |
| Ⅰ型胶原蛋白表达量(GAPDH) | 1.43 | 1.44 | 1.42 | 1.41 | 0.65 |
从表2可以看出，利用本发明提供的干细胞分泌因子刺激培养人原代真皮成纤维细胞，从而使人原代真皮成纤维细胞对Ⅰ型胶原纤维的表达增加。可知本发明提供的干细胞分泌因子有助于皮肤创面伤口的修复。
从表1和表2中还可以看出，经过采用本发明提供的无血清间充质干细胞冻存液结合本发明提供干细胞的冻存步骤后再经过传代培养的人源脐带间充质干细胞仍然具有良好的增殖能力，从其培养基中所获取和纯化的干细胞分泌因子中的蛋白质浓度以及细胞因子VEGF、IL-8、MCP-1仍然具有较高的浓度，进而仍然可以增高人原代真皮成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达量。
应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；所述干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人源脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得干细胞分泌因子；其中，e=3、4、5、6、7、8、9、10。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人源脐带间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人源脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人源脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。
6.根据权利要求5所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
7.根据权利要求5所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人源脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人源脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人源脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得Pm+1代人源脐带间充质干细胞。
8.根据权利要求1或4或6或7所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
9.根据权利要求3或4或5或7所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述人源脐带间充质干细胞悬液的浓度为1×107个/mL。
10.根据权利要求4或7所述的一种干细胞分泌因子的获取与纯化方法，其特征在于，所述细胞培养瓶为T-175细胞培养瓶。
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