CN110613680A - 一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法 - Google Patents

一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基础凝胶按照体积比0.5:0.5：0.5‑0.5:0.5：2的比例混合均匀，灌装到密封容器中，低温中保存待用。本发明的有益效果是：①满足伤口生物学需要：吸收渗液、湿润环境、维持合适的渗透压、保护创面新生肉芽组织，防止感染；②满足医务人员需要：减少换药工作量、操作简便易清洁、有利于伤口愈合、易于观察、容易储存、安全性好；③满足病人需要：加速伤口愈合、换药无痛、减少换药次数、无明显异物感、无异味易接受。

Description

一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及创伤伤口的治疗药物，特别是一种用于创伤伤口的凝胶制剂的 制备方法。
背景技术
干细胞能够产生一种称之为外泌体的囊泡结构。外泌体直径介于30-150nm 之间，是一种体积较小的细胞外泌囊泡，并具有脂质双层膜结构。外泌体含有 多种细胞特异性蛋白、脂类物质及核酸物质，能够释放信号分子并将其传递给 其他细胞，从而改变其生理功能。经过深入研究发现，外泌体可被受损组织处 的表皮及真皮细胞所吞噬，外泌体内含物，例如蛋白质、核酸等物质会释放到 细胞内发挥其调控作用，同时，细胞因子通过与细胞表面受体相结合，将刺激 信号传递至细胞内，会与外泌体协同修复并重构受损组织的再生微环境，调控 细胞增殖分化并促进组织再生。而对于表面创伤的情况，尤其是因糖尿病引起的创伤不愈的情况，现缺乏有效地外敷药物来进行减缓和治疗。由此，生产一 种可加快皮肤损伤的修复及愈合的药物是当前所急需的。
发明内容
本发明的目的是设计一种使用效果好、制备便捷的用于创伤伤口的凝胶制 剂的制备方法。
本发明的技术方案是，一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征 在于：将制得的外泌体、抗菌肽和基础凝胶按照体积比0.5:0.5：0.5-0.5:0.5： 2的比例混合均匀，灌装到密封容器中，低温中保存待用。
所述的低温为2℃-5℃。
所述的基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有药用高分子稳定剂 2.5-10g、保湿剂5-10ml、透皮吸收促进剂5-10ml、复方电解质注射液余量， 混合均匀后调整pH值为6.0-8.0。
所述的药用高分子稳定剂为：海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖和羟乙基淀 粉，上述药物可以单一使用，亦可两种及以上组合使用。
保湿剂如甘油、胶原蛋白、水解胶原蛋白、维生素原B5、氨基酸、透明质 酸、天然保湿因子等。保湿剂可以单一使用，亦可两种及以上组合使用，优选 天然保湿因子为基础的组合保湿剂用于糖尿病足凝胶的制备。
透皮吸收促进剂包含化学类促进剂(月桂氮卓酮、丙二醇)和天然类促进 剂(薄荷醇、冰片、精油类)。透皮吸收促进剂可以单一使用，亦可两种及以上 组合使用，优选薄荷醇为基础的透皮吸收促进剂用于糖尿病足凝胶的制备。
所述的抗菌肽为：天蚕素、多黏菌素类、达托霉素、Glutoxim/NOV-002、 恩夫韦地、DiaPep277、Pexiganan(MSI-78)、MBI594AN等。抗菌肽可以单一使 用，亦可两种及以上组合使用，优选Pexiganan(MSI-78)为基础的组合抗菌肽 用于糖尿病足凝胶的制备。
抗菌肽的抗菌机制不同于传统抗生素，其作用靶点大致分为细胞膜作用靶 点和胞内作用靶点(DNA，RNA，酶等)两大类。抑菌肽由于其分子量较小、热稳 定性强、水溶性好、无免疫原性、对人无毒副作用等特点,可以被人体内的酶 系直接降解、消化，安全性高，故抗菌肽成为抗生素的理想替代品之一。
干细胞外泌体的获取与纯化方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的 原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎脐带，置于碘伏中消毒；去除脐带两 端，脐带中间段剪成1cm长的脐带组织块，采用生理盐水或PBS对脐带组织段 反复漂洗去除血迹和碘伏；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通 氏胶组织，采用生理盐水或PBS对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1—3立方毫 米的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至T25瓶中，静置于温 度37℃、体积分数5％的CO2培养箱中，向T25中加入少量完全培养液培养，每 隔3天换液，静置培养10天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗 细胞，加入0.25％的胰酶消化2-3分钟，加入完全培养液终止消化，吹打得到 P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％融合 度时，弃去上清液，加入0.25％的胰酶消化2-3分钟，加入完全培养液终止消 化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并 在无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人源脐带 间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，每瓶20ml，密度1×107个/mL，并 将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得 Pn+1代人源脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4。
外泌体的获取与纯化步骤包括待P5代人源脐带间充质干细胞达80％时，4℃ 条件下，300g离心10分钟，收集上清，去除细胞，然后2000g离心10分钟， 收集上清，去除死细胞，10000g离心30分钟，收集上清，去除细胞碎片，100000g 离心70分钟，去除杂质蛋白，100000g离心70分钟收集底部外泌体，然后在-80℃ 条件下，冷冻固化12h；真空冷冻干燥机预冷至-45℃后开始抽真空，控制在 80Kpa，冷冻时间24h，得到外泌体冻干粉。
本发明的有益效果是：①满足伤口生物学需要：吸收渗液、湿润环境、维 持合适的渗透压、保护创面新生肉芽组织，防止感染；②满足医务人员需要： 减少换药工作量、操作简便易清洁、有利于伤口愈合、易于观察、容易储存、 安全性好；③满足病人需要：加速伤口愈合、换药无痛、减少换药次数、无明 显异物感、无异味易接受。
具体实施方式
实施例1，
一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基 础凝胶按照体积比0.5:0.5：0.5的比例混合均匀，灌装到密闭容器中，在2℃ 环境中保存待用。
外泌体的制备参照：
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎脐带，置于碘伏中消毒；去除脐带两 端，脐带中间段剪成1cm长的脐带组织块，采用生理盐水或PBS对脐带组织段 反复漂洗去除血迹和碘伏；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通 氏胶组织，采用生理盐水或PBS对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1—3立方毫 米带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至T25瓶中，静置于温 度37℃、体积分数5％的CO2培养箱中，向T25中加入少量完全培养液培养，每 隔3天换液，静置培养10天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗 细胞，加入0.25％的胰酶消化2到3分钟，加入完全培养液终止消化，吹打得 到P1代人源脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人源脐带间充质干细胞悬液浓 度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人源脐带间充质干细胞达80-90％融合 度时，弃去上清液，加入0.25％的胰酶消化2-3分钟，加入完全培养液终止消 化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人源脐带间充质干细胞清洗，并 在无血清培养基中重悬得Pn代人源脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人源脐带 间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，每瓶20ml，密度1×107个/mL，并 将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得 Pn+1代人源脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4。
外泌体的获取与纯化步骤包括待P5代人源脐带间充质干细胞达80％时，4℃ 条件下，300g离心10分钟，收集上清，去除细胞，然后2000g离心10分钟， 收集上清，去除死细胞，10000g离心30分钟，收集上清，去除细胞碎片，100000g 离心70分钟，去除杂质蛋白，100000g离心70分钟收集底部外泌体，然后在-80℃ 条件下，冷冻固化12h；真空冷冻干燥机预冷至-45℃后开始抽真空，控制在 80Kpa，冷冻时间24h，得到外泌体冻干粉。
抗菌肽选用DiaPep277类。
基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有海藻酸钠2.5g、甘油5ml、 月桂氮卓酮10ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后调整pH值为6.0。
实施例2，
一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基 础凝胶按照体积比0.5:0.5：1的比例混合均匀，灌装到密闭容器中，在4℃环 境中保存待用。
外泌体的制备参照实施例1的制备方法。
抗菌肽选用天蚕素。
基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有透明质酸钠4.5g、胶原蛋 白6ml、丙二醇5ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后调整pH值为7.0。
实施例3，
一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基 础凝胶按照体积比0.5:0.5：1.2的比例混合均匀，灌装到密闭容器中，在5℃ 环境中保存待用。
外泌体的制备参照实施例1的制备方法。
抗菌肽选用达托霉素。
基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有聚壳糖5.5g、维生素原B5 7ml、冰片8ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后调整pH值为8.0。
实施例4，
一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基 础凝胶按照体积比0.5:0.5：1.5的比例混合均匀，灌装到密闭容器中，在4.5℃ 环境中保存待用。
外泌体的制备参照实施例1的制备方法。
抗菌肽选用恩夫韦地。
基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有羟乙基淀粉6.5g、透明质 酸8ml、精油9ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后调整pH值为7.5。
实施例5，
一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基 础凝胶按照体积比0.5:0.5：2的比例混合均匀，灌装到密闭容器中，在3.5℃ 环境中保存待用。
外泌体的制备参照实施例1的制备方法。
抗菌肽选用Pexiganan(MSI-78)。
基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有海藻酸钠和透明质酸钠的 混合物共6.5g(其中海藻酸钠占4g,透明质酸钠2.5g)、天然保湿因子10ml、 冰片10ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后调整pH值为7.0。
实施例6，
一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，将制得的外泌体、抗菌肽和基 础凝胶按照体积比0.5:0.5：1.8的比例混合均匀，灌装到密闭容器中，在2.5℃ 环境中保存待用。
外泌体的制备参照实施例1的制备方法。
抗菌肽选用GlutoximV-002。
基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有海藻酸钠和聚壳糖的混合 物共5.5g(其中海藻酸钠占3.5g,聚壳糖2g)、甘油和氨基酸的混合物共9ml (其中甘油3ml、氨基酸6ml)、冰片9ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后 调整pH值为7.0。
实验例，
动物实验：
C57BL/6J雄性小鼠,静脉注射PBS液配制的STZ,连续注射5d，建立糖尿病 模型。在完全麻醉下结扎切除小鼠的左隐动静脉、左侧外部髋动脉、髋静脉和 股动、静脉等，10天后形成严重的后肢缺血动物模型。糖尿病足模型小鼠建立 后，后使用本发明实施例所配置的凝胶制剂，两周左右创面愈合，无红肿、过 敏、渗透等症状。
人体临床：
糖尿病足临床试验显示，其中糖尿病足1-2级患者，每日两次涂抹干细胞 外泌体凝胶，可增加溃疡愈合率，减少溃疡面积，降低疼痛感，两周后创面愈 合，无红肿、过敏、渗透等明显不良反应。
参照《糖尿病足与相关并发症的诊治》的疗效标准拟定有效率为创面愈合 率≥40％，干细胞外泌体凝胶治疗糖尿病足的总有效率100％，治疗效果显著。
病例一：
王XX,女，76岁，“双足肿痛3月余，右足第二趾红紫3天”，查体：双侧 股腘动脉可及，双侧胫后动脉可及，较弱；双侧足背动脉未及，足背皮温较对 侧低；
治疗二周后，肉芽生长良好，溃疡面积缩小爬皮
病例二：
李XX,男，60岁，“发现血糖高3年，右足破溃1月”；查体：右足背第一 趾处可见2.5X2.0cm表浅溃疡，皮肤表面暗红色，溃疡面有少量坏死组织及分 泌物。溃疡周围稍红肿，稍有压痛，双下肢无水肿。双足背动脉搏动可，生理 反应存在，病理反射未引出。
治疗二周后，肉芽生长良好，溃疡面积缩小爬皮
病例三：
徐XX,62岁，“口干、多饮、多尿10余年，右足第三趾溃烂20余天”；查 体：右足第一趾处可见3.5X3cm表浅溃疡，6点方向有一窦道，长约0.4cm；
有渗液，周边皮肤青紫，足背动脉搏动减弱。
治疗二周后，肉芽生长良好，溃疡面积缩小爬皮。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同 形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引 伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：将制得的外泌体、抗菌肽和基础凝胶按照体积比0.5:0.5：0.5-0.5:0.5：2的比例混合均匀，灌装到密封容器中，低温中保存待用。
2.如权利要求1所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述的低温为2℃-5℃。
3.如权利要求1所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述的外泌体的制备是：分离提取出脐带间充质干细胞，通过多次超速差速冷冻离心出干细胞分泌物，并经冷冻干燥制得外泌体冻干粉。
4.如权利要求1所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述的抗菌肽为：天蚕素、多黏菌素类、达托霉素、Glutoxim/NOV-002、恩夫韦地、DiaPep277、Pexiganan(MSI-78)、MBI594AN。
5.如权利要求1所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述的基础凝胶的制备是：在每100ml基础凝胶中含有药用高分子稳定剂2.5-10g、保湿剂5-10ml、透皮吸收促进剂5-10ml、复方电解质注射液余量，混合均匀后调整pH值为6.0-8.0。
6.如权利要求5所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述的药用高分子稳定剂为：海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖和羟乙基淀粉，上述药物可以单一使用，亦可两种及以上组合使用。
7.如权利要求5所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：保湿剂如甘油、胶原蛋白、水解胶原蛋白、维生素原B5、氨基酸、透明质酸、天然保湿因子等；上述药物可以单一使用，亦可两种及以上组合使用。
8.如权利要求5所述的一种用于创伤伤口的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：透皮吸收促进剂包含化学类促进剂，如：月桂氮卓酮、丙二醇和天然类促进剂，如：薄荷醇、冰片、精油类；上述药物可以单一使用，亦可两种及以上组合使用。
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