CN113081951B - 一种用于慢性伤口愈合的水凝胶及制备方法 - Google Patents

一种用于慢性伤口愈合的水凝胶及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于慢性伤口愈合的水凝胶及制备方法。本发明提供的水凝胶可以装载药物，水凝胶体系可以在伤口过度表达MMPs的情况下，利用酶对特定多肽序列的裂解作用释放药物起到智能调控作用。体外实验证明该水凝胶体系具有很好的生物相容性，糖尿病伤口愈合实验证明装载药物的水凝胶体系较普通溶液剂更能促进伤口愈合。本发明所制备的水凝胶可作为很好的伤口敷料，有望在组织工程领域发挥作用。

Description

一种用于慢性伤口愈合的水凝胶及制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于慢性伤口愈合的水凝胶及制备方法。
背景技术
在人体中，皮肤是最大的器官，完整的皮肤可以保护人体免受外来微生物的感染。因此，当皮肤受到外来创伤的时候，伤口的愈合对于人体来说尤为重要。研究显示，在我国发达或者较发达地区，每年创面修复与再生的治疗需求在1亿人次左右。创面的长时间不愈不仅使患者遭受严重的身心不适和经济困扰，同时也耗费了医疗系统的大量资源。
伤口愈合的过程特别复杂，尤其是慢性创面的修复，包括止血、炎症、增殖、重塑这四个独特而又相互重叠的阶段。大量研究表明炎症、缺氧等原因造成的过度氧化应激反应是创伤愈合的一个重要影响因素。慢性创面由于长时间的炎症浸润，进一步增加了有害物质的累积。
常见的慢性皮肤创伤包括糖尿病性足溃疡、压力性溃疡、下肢静脉性溃疡和镰状细胞溃疡等。慢性伤口中往往都存在缺氧和血液灌注不足的现象，伤口会有过量的Fe2+和ROS表达，抑制了低氧诱导因子HIF-1α的功能，而低氧诱导因子HIF-1α可以通过调控VEGF和SDF-1α基因的表达来促进血管生成，因此，糖尿病中血管的重塑较为困难。甲磺酸去铁胺可以结合多余的Fe2+，削弱ROS的功能来维持低氧诱导因子HIF-1α的表达促进血管生成。但甲磺酸去铁胺半衰期短,高频次给药具有很大的毒副作用，最好能构建按需给药的智能载药体系。
高质量的伤口敷料应该创造一个潮湿的环境来促进愈合。市场上有很多的伤口敷料，但并无特异的伤口敷料可以用来治愈慢性伤口。
发明内容
本发明提供了一种用于慢性伤口愈合的基质金属蛋白酶敏感水凝胶及制备方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种用于慢性伤口愈合的水凝胶，水凝胶含连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸。
水凝胶为连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和醛基修饰的葡聚糖混合形成的互穿网络结构聚合物水凝胶。
所述水凝胶具有很好的生物相容性，无毒，既有良好的机械性能，又有很好的溶胀性。
透明质酸(HA)由葡糖糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖构成的天然多聚糖，具有很好的生物可降解性和生物相容性。但天然高分子材料力学性能差，功能化不足，进而通过本发明处理增强机械强度。
葡聚糖(Dex)是由细菌来源的，具有α-1,6键D-吡喃的多聚糖。葡聚糖具有很好的生物可降解性，同时，羟基很容易被氧化修饰成醛基，可以和一些富含氨基的聚合物进行交联。通过本发明修饰后其可以与经修饰的透明质酸相连，进而由上述获得水凝胶力学强度明显改善，同时该水凝胶具有很好的孔径结构，利于伤口营养物质和代谢废物的输送。水凝胶湿润的性质有利于伤口愈合，此外，该水凝胶能在MMPs酶调控下来调节药物的释放，起到缓释的目的。
所述连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和醛基修饰的葡聚糖质量比为2:1～4:1。
所述基质金属蛋白酶敏感多肽为具有MMP-2酶的剪切位点的多肽(MMP-sensitivepeptide)；其中，MMP-sensitive peptide氨基酸序列为CPLG-LAG-NH-NH2。
一种用于慢性伤口愈合的水凝胶的制备方法，
(1)将连有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸溶解在PBS缓冲液中，得到高分子溶液；
(2)将醛基修饰的葡聚糖溶解在PBS缓冲液中，得到高分子溶液；
(3)将步骤(1)和(2)所得高分子溶液混合，即形成的互穿网络结构聚合物水凝胶。
进一步的说：
1)选取分子量为40～70KD的透明质酸钠(HA)，质量浓度范围在1％-3％，加入阳性离子交换树脂进行活化8-12小时，过滤后得滤液，加四丁基氢氧化铵调节pH至7.0～9.0，而后冷冻干燥得到四丁基修饰的透明质酸(HATBA)；
2)将上述获得四丁基修饰的透明质酸、N-(2-氨基乙基马来酰亚胺)三氟乙酸盐、卡特缩合剂，按照摩尔比为1:(1.0～1.5)：(1.0～1.5)混合，混匀后加入二甲基亚砜，在15～25℃氮气环境下搅拌反应1～4小时，反应物经透析，而后冷冻干燥，即得马来酰亚胺修饰的透明质酸(HA-mal)；其中，四丁基修饰的透明质酸与二甲基亚砜的质量体积(g/ml)比为1:90-105。
3)将质量之比为1：(1.2～1.5)的马来酰亚胺修饰的透明质酸和金属蛋白酶敏感多肽溶解于PBS缓冲液中，在氮气环境下搅拌反应2～4小时，反应物经透析，而后冷冻干燥得连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸；
4)选用分子量为40～70KD的葡聚糖(Dex)溶解于水中，溶解后滴加高碘酸钠溶液，在15～25℃避光搅拌1～2天，加入乙二醇停止反应，将混合物经透析获得冷冻干燥，即得到醛基修饰的葡聚糖Dex-CHO；其中，Dex与NaIO4的质量比为1:(0.5～1)；
5)将连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和Dex-CHO分别溶于溶解在PBS缓冲液中，各自溶液终浓度范围为2％～12％，而后将两溶液混合，即得水凝胶；其中，连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和Dex-CHO质量比为2:1～4:1。
一种用于慢性伤口愈合的水凝胶的应用，所述水凝胶作为用于慢性伤口愈合药物中，作为载体的应用。
一种用于慢性伤口愈合药物制剂，药物制剂为甲磺酸去铁胺与所述水凝胶混合，使甲磺酸去铁胺填充至水凝胶互穿网络结构中的形成水凝胶形式外用药物制剂。
所述甲磺酸去铁胺具有促进血管生成的作用，但是半衰期比较短且高频次给药具有一定的毒副作用，同时，慢性伤口基质金属蛋白酶MMP-2过度表达，因此构建MMP-2酶智能调控系统可以起到缓释DFO的作用。
所述制剂为将连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和Dex-CHO分别溶于溶解在PBS缓冲液中，各自溶液终浓度范围为2％～12％，配制质量浓度为50％～70％的甲磺酸去铁胺溶液，将连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸溶液和Dex-CHO溶液和甲磺酸去铁胺溶液搅拌混匀得到含有甲磺酸去铁胺的HA/Dex水凝胶药物制剂；其中，连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸、Dex-CHO、甲磺酸去铁胺(DFO)的质量比为30.3:(8.0～13.5):1。
一种用于慢性伤口愈合药物制剂的应用，所述药物制剂在作为慢性伤口糖尿病溃疡中的外用药物中的应用。外用剂型例如乳剂、膏剂、水凝胶或贴剂等。
上述记载PBS缓冲液均为pH值为7.4的PBS缓冲液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的水凝胶药物制剂具有良好的生物相容性，易于涂布，能够防止药物的流失；其能够提供一个湿润的环境，不仅能溶解坏死组织，促进细胞的增殖分化，而且能刺激毛细血管和肉芽组织的生长，有利于伤口的愈合，减轻换药时的疼痛感。
本发明的水凝胶药物制剂具有多孔性，有利于营养物质和代谢废物的交换，湿润的环境可以有利于伤口愈合；
本发明的水凝胶药物制剂具有一定的智能调控型，能根据伤口过度的MMPs酶表达来剪切MMP-sensitive peptide来降解药物，使用甲磺酸去铁胺的促进血管生成作用，实现智能调控释放药物来促进伤口愈合的目的。
附图说明：
图1为实施例1中HA-MMP-sensitive peptide的合成路线；
图2为实施例1中透明质酸(HA)、四丁基修饰的透明质酸(HATBA)和马来酰亚胺修饰的透明质酸(HA-mal)的1H-NMR谱图；
图3为实施例1中马来酰亚胺修饰的透明质酸(HA-mal)、MMP-sensitive peptide和HA-MMP-sensitive peptide的1H-NMR谱图；
图4为实施例1中马来酰亚胺修饰的透明质酸(HA-mal)、MMP-insensitivepeptide和HA-MMP-insensitive peptide的1H-NMR谱图；
图5为实施例2中葡聚糖(Dex)和醛基修饰的葡聚糖(Dex-CHO)的红外谱图；
图6为实施例5中两种水凝胶的细胞毒性；
图7为实施例7中DFO水凝胶药物制剂对糖尿病溃疡的愈合情况图；
图8为实施例7中DFO水凝胶制剂对糖尿病溃疡的愈合率曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
下述实施例中PBS缓冲液均为pH值为7.4的PBS缓冲液；透析袋均为3500分子量的美国联合碳化干型透析袋。
实施例1连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸的合成，参见图1：
(1)HATBA的合成：称取1.2g透明质酸钠，溶于60mL蒸馏水中，使其质量浓度为2％；将配制好的透明质酸钠溶液加入Dowex 50WX8-100阳离子交换树脂中，在25℃下反应8小时后过滤得到滤液；滴加0.25mol/L四丁基氢氧化铵(TBAOH)溶液小心调节滤液pH至7.0；最后将所得溶液放置于冰冻冰箱中冷冻24小时，再放入冻干机冷冻干燥24小时，得到四丁基修饰的透明质酸(HATBA)。采用核磁共振氢谱来确定化合物的结构，谱图结果如图2所示，波谱解析如下：
HATBA谱图上2.00ppm对应透明质酸上酰胺基团中甲基的特征峰，0.93ppm,1.34ppm,1.64ppm,3.20ppm分别对应四丁基的4个特征峰。
(2)HA-mal的合成：称量0.4838g四丁基修饰的透明质酸，0.2043g N-(2-氨基乙基马来酰亚胺)三氟乙酸盐，0.3628g卡特缩合剂，加入50mL二甲基亚砜，在氮气保护条件下，磁力搅拌反应2h。将反应液转移到透析袋中，透析3天，将透析产物放置于冰冻冰箱中冷冻24小时，再放入冻干机冷冻干燥24小时，得到马来酰亚胺修饰的透明质酸(HA-mal)。采用核磁共振氢谱来确定化合物的结构，结果如图2所示，波谱解析如下：
HA-mal谱图上6.85ppm对应马来酰亚胺的特征峰。
(3)HA-MMP-sensitive peptide的合成：称量60mg MMP-sensitive peptide(CPLG-LAG-NH-NH2)，90mg马来酰亚胺修饰的透明质酸，加入60mLPBS缓冲液。在氮气保护条件下，磁力搅拌反应4h。将反应液转移到透析袋中，透析2天，将透析产物放置于冰冻冰箱中冷冻24小时，再放入冻干机冷冻干燥24小时，得到产物HA-MMP-sensitive peptide。采用核磁共振氢谱来确定化合物的结构，结果如图3所示，波谱解析如下：
HA-MMP-sensitive peptide谱图中6.85处的峰消失证明MMP-sensitive peptide成功连接到了透明质酸上。
(4)HA-MMP-insensitive peptide的合成：称量60mg MMP-insensitive peptide(CLPALGG-NH-NH2)，90mg马来酰亚胺修饰的透明质酸，加入60mLPBS缓冲液。在氮气保护条件下，磁力搅拌反应4h。将反应液转移到透析袋中，透析2天，将透析产物放置于冰冻冰箱中冷冻24小时，再放入冻干机冷冻干燥24小时，得到产物HA-MMP-insensitive peptide。采用核磁共振氢谱来确定化合物的结构，结果如图4所示，波谱解析如下：
HA-MMP-insensitive peptide谱图中6.85处的峰消失证明MMP-insensitivepeptide成功连接到了透明质酸上。
所述MMP-sensitive peptide(CPLG-LAG-NH-NH2)序列选自文献(Tumor imagingby means of proteolytic activation of cell-penetrating peptides.DOI:10.1073/pnas.0408191101)中报道的具有MMP-2剪切位点的多肽ACPPs，节选序列CPLG-LAG-NH-NH2，委托上海吉尔生化有限公司生产制造获得。
MMP-insensitive peptide(CLPALGG-NH-NH2)序列为克服不同种类氨基酸所带来的差异影响，由所述的MMP-sensitive peptide含有的氨基酸种类和数目，按照无法获得MMP-2剪切位点的多肽序列进行设计，委托上海吉尔生化有限公司生产制造获得。
实施例2醛基修饰的葡聚糖(Dex-CHO)的合成
称量0.400g葡聚糖溶于32mL水中，称量0.2624g高碘酸钠溶于8mL水中。将高碘酸钠溶液逐滴加入到葡聚糖溶液中，在室温下避光磁力搅拌反应24h。加入140ul乙二醇，避光反应15分钟。透析3天将透析产物放置于冰冻冰箱中冷冻24小时，再放入冻干机冷冻干燥24小时，得到产物Dex-CHO。采用红外谱图来确定化合物的结构，结果如图5所示。
可以发现Dex-CHO的红外谱图上出现了少量1730cm-1的醛基特征峰。
实施例3：含有甲磺酸去铁胺的MMP-2敏感水凝胶(MMP-sensitive hydrogel)的制备
(1)将HA-MMP-sensitive peptide溶解于PBS缓冲液中过夜，HA-MMP-sensitivepeptide溶液的质量分数为2％；
(2)将醛基修饰的葡聚糖(Dex-CHO)溶解于PBS缓冲液中过夜，Dex-CHO溶液的质量分数为12％；
(3)将甲磺酸去铁胺(DFO)溶解于水中，DFO溶液的质量分数为66％
(4)将HA-MMP-sensitive peptide溶液，Dex-CHO溶液和DFO溶液搅拌混匀得到酶敏感水凝胶(MMP-sensitive hydrogel)，HA-MMP-sensitive peptide、Dex-CHO、DFO的质量比为30.3:9.4:1。
实施例4：含有甲磺酸去铁胺的MMP-2非敏感水凝胶(MMP-insensitive hydrogel)的制备
(1)将HA-MMP-insensitive peptide溶解于PBS缓冲液中过夜，HA-MMP-insensitive peptide溶液的质量分数为2％；
(2)将醛基修饰的葡聚糖溶解于PBS缓冲液中过夜，Dex-CHO溶液的质量分数为12％；
(3)将甲磺酸去铁胺溶解于水中，DFO溶液的质量分数为66％
(4)将HA-MMP-insensitive peptide溶液，Dex-CHO溶液和DFO溶液搅拌混匀得到酶非敏感水凝胶(MMP-insensitive hydrogl)，HA-MMP-insensitive peptide、Dex-CHO、DFO的质量比为30.3:9.4:1。
实施例5：细胞毒性实验
1将3T3小鼠胚胎成纤维细胞培养在DMEM培养基中(DMEM培养基中还含10％灭活胎牛血清，1％双抗(青霉素+链霉素))中，待细胞铺满后，用适量胰酶消化细胞，轻轻拍打后加入培养液终止消化，小心收集细胞于离心管中，离心，去除上清液，重悬细胞后进行计数。用DMEM完全培养基适当稀释使其细胞密度达2.5×104cells/mL。取细胞混悬液吹打均匀后按每孔200ul定量加入到96孔板中，置于细胞培养箱中，在37℃，5％CO2的环境下培养12h；待细胞完成贴壁后弃去原有的培养基，将用DMEM完全培养基稀释成不同浓度(4mg/mL、0.8mg/mL和0.16mg/mL)的上述实施例获得酶敏感水凝胶(MMP-sensitive hydrogel)或酶非敏感水凝胶(MMP-insensitive hydrogel)浸提液加入到96孔板中，每孔200ul，每个浓度的浸提液平行6次，37℃，5％CO2的条件下继续培养。24h后，取出96孔板弃去原有的培养基，再每孔加入新鲜的200ul培养基，加入20ul的MTT溶液，在37℃，5％CO2下培养4h，弃去其中原有的溶液，每孔加入200μL DMSO，置于振荡器上震荡10min，使用酶标仪在波长570nm下测定每一个孔中溶液的吸光度，使用如下的公式计算细胞的存活率：
Figure BDA0003013255600000061
2.实验结果
如图6所示，不同浓度组的细胞浓度均高于75％，基本可以认为水凝胶无毒性，具有很好的生物相容性。
实施例6：
1)糖尿病大鼠模型的建立
选用SPF级SD雄性大鼠，体重270-300g,自由饮水饮食。禁食不禁水18h后，配制链脲佐菌素(STZ)60mg/kg腹腔注射(STZ以pH4.5的柠檬酸缓冲液溶解，配制成质量分数为1％溶液)，3天后测量尾静脉血糖值，高于16.7mmol/L，且伴随有多食、多饮、多尿和体重减轻的情况，则视为糖尿病大鼠造模成功。
2)水凝胶药物制剂对糖尿病溃疡的愈合的影响
将糖尿病大鼠随机分成4组，每组6只。糖尿病症状出现5周后，将糖尿病大鼠麻醉，背部剃毛消毒后，在背部制造15mmX15mm的圆形伤口，止血后自然暴露。在伤口周围缝上1mm厚的硅胶垫。分别进行给药处理，四组分别是上述实施例获得酶敏感水凝胶(MMP-sensitive hydrogel)、酶非敏感水凝胶(MMP-insensitive hydrogl)、DFO溶液组和control组，给药频率为2天一次，每2天进行拍照一次。按照下列公式计算创伤的愈合率：
Figure BDA0003013255600000071
3)实验结果
大鼠的糖尿病溃疡修复情况如图7所示，与DFO溶液组和control组相比，给药处理14天后，水凝胶制剂可以明显促进糖尿病溃疡的快速愈合，在整个愈合时期中效果都很显著。从图8可以看到，酶敏感水凝胶的愈合效率高于酶非敏感水凝胶，说明酶敏感水凝胶可以起到很好的释放药物促进伤口愈合的目的，也说明了本发明构建的基质金属蛋白酶敏感水凝胶可以起到促进慢性伤口愈合的目的。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于慢性伤口愈合的水凝胶，其特征在于：水凝胶含连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸；
水凝胶为连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和醛基修饰的葡聚糖混合形成的互穿网络结构聚合物水凝胶；
所述基质金属蛋白酶敏感多肽为具有MMP-2酶的剪切位点的多肽(MMP-sensitivepeptide)；其中，MMP-sensitive peptide氨基酸序列为CPLG-LAG-NH-NH2。
2.按权利要求1所述的用于慢性伤口愈合的水凝胶，其特征在于：所述连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和醛基修饰的葡聚糖质量比为2:1～4:1。
3.一种权利要求1所述的用于慢性伤口愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于：(1)将连有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸溶解在PBS缓冲液中，得到高分子溶液；
(2)将醛基修饰的葡聚糖溶解在PBS缓冲液中，得到高分子溶液；
(3)将步骤(1)和(2)所得高分子溶液混合，即形成的互穿网络结构聚合物水凝胶。
4.按权利要求3所述的用于慢性伤口愈合的水凝胶的制备方法，其特征在于：
1)选取分子量为40～70KD的透明质酸钠(HA)，质量浓度范围在1％-3％，加入阳性离子交换树脂进行活化8-12小时，过滤后得滤液，加四丁基氢氧化铵调节pH至7.0～9.0，而后冷冻干燥得到四丁基修饰的透明质酸(HATBA)；
2)将上述获得四丁基修饰的透明质酸、N-(2-氨基乙基马来酰亚胺)三氟乙酸盐、卡特缩合剂，按照摩尔比为1:(1.0～1.5)：(1.0～1.5)混合，混匀后加入二甲基亚砜，在15～25℃氮气环境下搅拌反应1～4小时，反应物经透析，而后冷冻干燥，即得马来酰亚胺修饰的透明质酸(HA-mal)；
3)将质量之比为1：(1.2～1.5)的马来酰亚胺修饰的透明质酸和金属蛋白酶敏感多肽溶解于PBS缓冲液中，在氮气环境下搅拌反应2～4小时，反应物经透析，而后冷冻干燥得连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸；
4)选用分子量为40～70KD的葡聚糖(Dex)溶解于水中，溶解后滴加高碘酸钠溶液，在15～25℃避光搅拌1～2天，加入乙二醇停止反应，将混合物经透析获得冷冻干燥，即得到醛基修饰的葡聚糖(Dex-CHO)；其中，Dex与NaIO4的质量比为1:(0.5～1)；
5)将连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和Dex-CHO分别溶于溶解在PBS缓冲液中，各自溶液终浓度范围为2％～12％，而后将两溶液混合，即得水凝胶；其中，连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和Dex-CHO质量比为2:1～4:1。
5.一种权利要求1所述的用于慢性伤口愈合的水凝胶的应用，其特征在于：所述水凝胶在制备用于慢性伤口愈合药物中，作为载体的应用。
6.一种用于慢性伤口愈合药物制剂，其特征在于：药物制剂为甲磺酸去铁胺与权利要求1所述水凝胶混合，使甲磺酸去铁胺填充至水凝胶互穿网络结构中的形成水凝胶形式外用药物制剂。
7.按权利要求6所述的用于慢性伤口愈合药物制剂，其特征在于：所述制剂为将连接有基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸和Dex-CHO分别溶于溶解在PBS缓冲液中，各自溶液终浓度范围为2％～12％，配制质量浓度为50％～70％的甲磺酸去铁胺溶液，将连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸溶液和Dex-CHO溶液和甲磺酸去铁胺溶液搅拌混匀得到含有甲磺酸去铁胺的HA/Dex水凝胶药物制剂；其中，连接基质金属蛋白酶敏感多肽的透明质酸、Dex-CHO、甲磺酸去铁胺(DFO)的质量比为30.3:(8.0～13.5):1。
8.一种权利要求6所述的用于慢性伤口愈合药物制剂的应用，其特征在于：所述药物制剂在制备慢性伤口糖尿病溃疡中的外用药物中的应用。
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